Типы nmda рецепторов в нейронах мозжечка и роль са2+-активируемых к+ каналов в регуляции нейропротекторных механизмов Степаненко Юлия Дмитриевна

Введение к работе

Изучение механизмов эксайтотоксичности или цитотоксического действия глутамата
и разработка подходов к ее коррекции являются важнейшими проблемами нейробиологии.
Эксайтотоксичность вызывается чрезмерной активацией рецепторов глутамата, что
приводит к Са²⁺ перегрузке нейрона и активации молекулярных каскадов,

сопровождающихся гибелью клетки (Khodorov et al., 2004). За счет высокой Са²⁺ проницаемости NMDA рецепторы вовлечены как в реализацию нормальных функций ЦНС (синаптическая пластичность, когнитивные функции), так и в эксайтотоксичность. Считается, что вход Са²⁺ через NMDA рецепторы при их гиперактивации глутаматом или другими агонистами сопровождается большей летальностью, чем через другие Са²⁺ проницаемые каналы (Sattler et al., 1998).

Уникальность функций, выполняемых мозжечком в ЦНС, связана, по-видимому, в том числе и c уникальностью профиля экспрессии GluN2 субъединиц NMDA рецепторов его нейронами. Установлено, что мозжечок in vivo характеризуется выраженной экспрессией GluN2C и GluN2D субъединиц (Akazawa et al., 1994), что отличает его от остальных структур мозга. В настоящее время существуют данные относительно субъединичного состава NMDA рецепторов в нейронах мозжечка in vivo и динамики его изменений в онтогенезе (Misra et al., 2000; Thompson et al., 2000; et al., 2000). Однако остаются противоречия, касающиеся экспрессии NMDA рецепторов (Watanabe et al., 1994; Renzi et al., 2007) в клетках Пуркинье (КП). Несмотря на то, что первичная культура широко используется для исследования механизмов апоптоза и нейропротекции, а также для поиска новых лекарственных препаратов, сведения о типах GluN2 субъединиц, формирующих NMDA рецепторы в нейронах первичной культуры мозжечка, и о динамике изменения субъединичного состава в развитии скудны. В связи с этим изучение

субъединичного состава NMDA рецепторов нейронов мозжечка представляется важным для выработки стратегии коррекции вызванной глутаматом цитотоксичности, и может объяснить особенности побочного действия некоторых лекарственных препаратов на двигательную активность.

Поскольку NMDA рецепторы обеспечивают нормальное функционирование мозга, прямая блокада данных рецепторов в целях коррекции патологических изменений может давать побочные эффекты, которые выражаются в нарушении когнитивного статуса вплоть до симптомов шизофрении. Поиск других механизмов регуляции нарушенного глутаматом Са²⁺ гомеостаза, не связанных с прямой блокадой NMDA рецепторов, является актуальной проблемой. Одним из перспективных механизмов коррекции является активация Са²⁺-активируемых К⁺ каналов. На первичной культуре нейронов коры было показано уменьшение входа Са²⁺ в клетки при одновременной активации рецепторов глутамата и аллостерической модуляции Са²⁺ - активируемых К⁺ каналов, сопровождающееся повышением выживаемости нейронов после эксайтотоксического стресса (Dolga et al., 2011). Хотя имеются данные относительно влияния аллостерических модуляторов (NS309 и CyPPA) на частоту разрядов КП (Egorova et al., 2014), их действие на гомеостаз [Ca²⁺]i в нейронах мозжечка ранее не исследовалось. Остается открытым вопрос, обладают ли эти вещества нейропротекторным действием на нейроны мозжечка в условиях вызванной глутаматом эксайтотоксичности.

Для создания эффективных терапевтических подходов к коррекции вызванных глутаматом нарушений требуется детальное знание GluN2 субъединичного состава NMDA рецепторов нейронов, особенностей и механизмов регуляции [Ca²⁺]_i. Несмотря на широкое экспериментальное использование первичных нейронных культур, вопрос об особенностях экспрессии NMDA рецепторов в нейронах первичной культуры мозжечка практически не изучен, и исследование субъединичного состава NMDA рецепторов является актуальным как с точки зрения фундаментальной науки, так и для понимания особенностей действия фармакологически активных веществ на функции мозжечка. Предполагаемые Са²⁺ -регуляторные и нейропротекторные эффекты аллостерической модуляции Са²⁺ -активируемых К⁺ каналов нейронов мозжечка требуют экспериментального подтверждения.

В связи с вышеизложенным были определены следующие цели и задачи исследования.

Цель исследования

Исследовать GluN2 субъединичный состав NMDA рецепторов в нейронах первичной культуры мозжечка в процессе их дифференцировки in vitro. Изучить возможный нейропротекторный эффект аллостерических активаторов Са²⁺-активируемых К⁺ каналов малой и средней проводимости в условиях нейротоксичного действия

глутамата, механизм нейропротекторного эффекта, и роль данных каналов в регуляции спайковой активности КП.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие конкретные задачи исследования:

1. Исследовать субъединичный состав NMDA рецепторов и его изменения в
нейронах мозжечка в первичной культуре ткани в процессе развития, а также Са²⁺ ответы
нейронов при действии различных агонистов рецепторов глутамата.

2. Изучить кинетику и фармакологические особенности миниатюрных
возбуждающих постсинаптических токов (мВПСТ) и вовлеченность NMDA рецепторов,
имеющих различные GluN2 субъединицы, в генерацию интегральных токов, активируемых
NMDA, нейронами, а также их изменение по мере развития культуры.

3. Исследовать действие аллостерических модуляторов SK и IK каналов (NS309 и
CyPPA) на внуриклеточные Са²⁺ ответы нейронов мозжечка при активации рецепторов
глутамата.

4. Исследовать возможность и механизм нейропротекторного действия NS309 и
CyPPA на нейроны первичной культуры мозжечка в условиях нейротоксического действия
глутамата и проанализировать влияние данных модуляторов на частоту спайковой
активности КП в опытах in vivo.

Научная новизна

Новыми являются данные о GluN2 составе NMDA рецепторов КП и других
нейронов в первичной культуре мозжечка крыс на разных сроках ее развития. С
использованием фармакологического анализа природы трансмембранных токов в нейронах
мозжечка, вызванных NMDA, и миниатюрных спонтанных возбуждающих

постсинаптических токов (мВПСТ) на разных сроках развития первичной культуры впервые показано, что в течение первых трех недель культивирования в нейронах происходят значительные изменения в экспрессии GluN2 субъединиц в пользу увеличения экспрессии GluN2C. Эти изменения захватывают как внесинаптические, так и синаптические зоны, к тому же их направленность сопоставима с изменениями, обнаруженными в мозжечке в онтогенезе in vivo.

Впервые был проведен анализ Са²⁺ ответов нейронов первичной культуры мозжечка при совместной аппликации глутамата и позитивных модуляторов SK-каналов в Mg²⁺-содержащей и без Mg²⁺-средах, показавший, что наименьшее изменение внутриклеточной концентрации Са²⁺ происходит при активации рецепторов глутамата и SK/IK-каналов в Mg²⁺-содержащей среде. Впервые был продемонстрирован нейропротекторный эффект аллостерических модуляторов SK-каналов. Показано также, что действие аллостерических модуляторов SK/IK-каналов на выживаемость нейронов первичной культуры мозжечка не

связано с влиянием данных веществ на потенциал-зависимый Mg²⁺ блок каналов NMDA рецепторов.

Теоретическая и практическая значимость работы

Данная работа имеет значение для фундаментальной науки в области исследования
нейропротекторных механизмов, которые можно использовать при разработке

терапевтического подхода к лечению мозжечковой атаксии и нейродегенеративных заболеваний, в патогенез которых вовлечены рецепторы глутамата. Теоретическое значение работы состоит в расширении представлений о механизмах регуляции электрогенеза при активации Са²⁺-зависимой К⁺ проводимости в клетках Пуркинье и других нейронов мозжечка крыс. Результаты исследования, раскрывающие особенности развития нейронов мозжечка in vitro, и механизмы нейропротекции, связанной с активацией Са²⁺-зависимой К⁺ проводимости, могут использоваться при чтении лекция по нейрофизиологии в университетах и медицинских учебных заведениях.

Основные положения, выносимые на защиту

1. На ранних этапах развития культуры все нейроны экспрессируют GluN2A, GluN2B,
GluN2C субъединицы NMDA рецепторов. По мере дифференцировки нейронов мозжечка в
первичной культуре ткани с 7 по 21 день происходят значительные изменения в паттерне
экспрессии синаптических и экстрасинаптических GluN2 субъединиц. К 21 DIV также
значительно увеличивается количество тригетеромерных рецепторов, включающих GluN2B
и GluN2C/D субъединицы.

1. Аллостерические модуляторы SK/IK-каналов вызывают снижение [Ca²⁺]_i при активации рецепторов глутамата и обладают нейропротекторным влиянием против нейротоксического действия глутамата.

2. Активация SK/IK-каналов с помощью аллостерических модуляторов вызывает снижение частоты простых спайков клеток Пуркинье крыс in vivo.

Структура и объем диссертации