Введение к работе
~-"rL''_Актуальность проблемы. Трансплантация нервной ткани является одной из важнейших фундаментальных проблем' современной нейробиоло-гической науки, которая приобретает особенно большой практический интерес в связи с исследованием таких нейродегенеративных заболеваний, как болезни Паркинсонэ, Хантингтона, Алыдгеймерз и др. Метод пересадки мозговой ткани дает возможность, с одной стороны, изучить основы развития, дифференциации, специализации и регенерации, а также
. биохимические, иммунологические и анатоме—морфологические особенности нервной ткани, а с другой - разработать и в последующем внедрить в медицинскую практику эффективные терапевтические методы лечения тех заболеваний ВДС, в основе которых лежит селективное и постоянно прогрессирующее перерождение нейронных групп определенных типов.
В настоящее время накоплен богатый экспериментальный материал, свидетельствующий о том, что эмбриональные нейроны, пересаженные в разные структуры мозга взрослых млекопитающих, могут восстанавливать поврежденные нервные связи мозга реципиента путем замены погибших, или перерожденных его элементов. Эти исследования, в противоположность традиционным взглядам, привели к осознанию того факта, что,> зрелая ткань ВДС млекопитающих распологает потенциальной возможностью интегрирования в свои сформировавшиеся нервные цепи новых нейро-нальных элементов и, что эти имплантированные элементы в состоянии модифицировать функции и поведение самих реципиентов. Несмотря на неоспоримость полученных экспериментальных данных, до сих пор не существует единого мнения о возможных механизмах действия трансплантатов нервной ткани на различные функции мозга реципиента.
Исследование проблемы эпилепсии дает возможность выявить не только те интимные механизмы, которые лежат в основе происхождения, течения и завершения этого патологического состояния, но и открывает широкие перспективы для получения фундаментальных знаний в области нормального Функционирования отдельных клеточных систем ВДС. Одним из наиболее широко используемых методов экспериментальной эпилепсии животных является т.н. «раскачка», впервые описанная Годдардои и соавт. в 1969 году (codderd et ні.. 1969). Несмотря на то, что данная модель эпилепсии весьма интенсивно изучается многими исследователями
и что удалось продемонстрировать важную тормозящую роль норадренергической системы синего пятна б процессе раскачки, вызываемой из амигдалы и гкппокаша, до сих пор не полностью ясны тонкие клеточные и фармакологические механизмы развития данной патологии.
В настоящее время, наряду с многочисленными экспериментальными исследованиями по изучению пересадки мозговой ткани в некоторых моделях вышеописанных нейродегенеративных заболеваний, также предпринимаются отдельные попытки изучения возможного влияния трансплантации различных типов эмбриональных нейронов на судорожную эпилептическую активность, вызванную в экспериментальных животных. Несмотря на то, что, в некоторых случаях, было продемонстрировано подавление генерализации судорожной активности трансплантатами
Определенных ТИПОВ НерВНОЙ ТКаНИ (Barry et al.. 1987 Camu. Privat..
і see), всеже не удалось окончательно установить те возможные механизмы, которые могут определять этот эффект.
Исходя из всего вышеизложенного, исследование влияния пересадки эмбриональной нервной ткани на развитие экспериментальной эпилепсии, может выявить некоторые закономерности как нормальной так и патологической активности нейронных систем головного мозга во время судорожнеой активности, а также определить те интимные механизмыи которые лемат в основе восстановления потерянных функций, модуляции возбудимости и регенерации нервной ткани. Все это имеет несомненное теоретическое и практическое значение и является весьма актуальной проблемой современной нейробиологической науки.
Цель и задачи исследования. Основной целью настоящего исследования было определение тех специфических нейрофизиологических и кейрофармакологических механизмов, которые лежат в. основе подавления судорожной активности мозга при пересадке эмбриональной нервной ткани.
Для достижения данной цели в работе были решены следующие конкретные задачи:
изучена возможность применения метода микродиализа мозга в определении синаптической активности норадренергических окончаний в гиппокампе крыс:
проведен анализ динамики высвобождения НА и серотонина во время фокальных и генерализованных судорог при развитии раскачки в
гиппокампе:
исследована динамика высвобождения НА в гиппокампе и изучены фармакологические особенности возможного его тормозящего влияния на процесс генерализации судорог во время развития т.н. быстрой раскачки;
исследовано тормозящее влияния пересадки клеточной суспензии эмбриональной ткани синего пятна унилатерально в гиппокамп и билатерально в отдаленные от стимулирующих электродов участки мозга, в частности в амигдала-пириформнуп кору, на скорость развития генерализованных судорог при раскачке в гиппокампе крыс с повышенной предрасположенностью к эпилептизашш, вызванной разрушением внутренней норадренергической системы;
изучено тормозящее влияния пересадки клеточной суспензии аллогенной эмбриональной ткани синего пятна на процесс генерализации судорог при быстрой раскачке в гиппокампе крыс с повышенной возбудимостью, вызванной разрушением внутренней норадренергической системы;
определена специфичность эффектов трансплантатов эмбрионального синего пятна на процесс раскачки по отношению к норадренергическим нейронам;
исследована динамика регулируемого синаптического высвобож-^ дения НА из трансплантированных норадренергических нейронов эмбрионального синего пятна в ответ на генерализованные судороги.
Научная новизна результатов исследования. Использование ориги-нального метода микродиализа мозга в свободном поведении животных, с применением последующего усовершенствованного нами радиоферментативного теста для анализа внеклеточного уровня НА в гиппокампе, позволило впервые показать значительное увеличение высвобождения НА во время развития фокальных и генерализованных судорог, вызванных раскачкой в гиппокампе. Впервые показано, что это увеличение высвобождения НА носит специфический характер, поскольку таковое не наблюдается, например, в случае серотонина и его метаболитов. Впервые показано также , что во время быстрой раскачки происходит сильное увеличение внеклеточного уровня НА поело первых же стимуляций ггашокампа, которое с последующими стимуляциями постепенно снижается и приходит к первоначальному уровню. Одновременно с этим протекает усиление генерализации судорожной активности.
- 6 -Впервые показано, что устойчивый фоновий уровень внеклеточного НА в гиппокампе после завершения раскачки значительно ниже по сравнению с таковым в интгктных животных. На основаниии анализа высвобождения НА в гиппокампе с использованием микродиализного метода до и после перерезки восходящих норадренергических путей у животных с завершенной раскачкой нами впервые показано, что наблюдаемое увеличение выброса НА при развитии генерализованных судорог резко снижается после операции.
Все вышеизложенное свидетельствует о мощной активации норадре-нергической системы синего пятна и о длительном сохранении изменений в нейромедкаторной тормозящей передаче этой системы в процессе эпилептизации и после его завершения.
Впервые показана нормализация скорости генерализации судорог при раскачке в гкппокампе у животных с, повышенной предрасположенностью к эпилептизации, вызванной предварительным разрушением внутренней норадренергкческой системы трансплантатами клеточных суспензий эмбриональной ткани синего пятна, пересаженными в область амиг-дала-гофиформной коры.
Впервые показано, что билатеральная аллотрансплантация эмбрионального синего пятна в гиппокамп нормализует развитие судорог при быстрой раскачке в животных с предварительно разрушенными катехо-ламинергическими системами. Впервые продемонстрировано, что сингенная унилатеральная внутригиппокампальная трансплантация данной области в таких животных не влияет на процесс генерализации судорог при традиционной раскачке.
Также впервые показано,' что аналогично внутренней норздренер-гической системе, во время развития генерализованных судорог, из гиппокампальных трансплантатов синего пятна происходит регулируемое увеличение сикаптического" высвобождения, а' также, восстановление фонового уровня внеклеточного содержания НА в гиппокампе животных с предварительно разрушенной норадренергической системой.
Впервые было продемонстрировано устранение торможения процесса генерализации судорог гигаюкампальными трансплантатами эмбрионального синего пятна при блокировании альфа-2 адренергических постсинапти-ческих рецепторов.
Все вышеуказанное свидетельствует о том, что трансплантаты
эмбрионального синего пятна оказывает свое тормозящее влияние на процесс генерализации судорог при раскачке в гиппокампе путем активации специфического механизма норадренергических нейронов и, что несмотря на свое эктопическое расположение, они, по-видимому хорошо интегрируются в нейронные цепи гкппокампзльной формации реципиента.
Теоретическое и практическое значение работы. Проведенное исследование тонких нейрсбиологических механизмов процесса эпилептизадаи нервной системы и подавления судорожной активности, с использованием методов микродиализа мозга и пересадки мозговой ткани, а также иммуногистохимических, гистофлуоресценткых, биохимических и фармакологических подходов, имеет большое теоретическое и практическое значение. Представляется возможность по новому взглянуть на роль норадренергической системы ШС, в частности системи синего пятна, в осуществлении защиты от чрезмерной активации отдельных, особенно лимбических, структур головного мозга, что, в случае периодического повторения может привести к возникновению эпилептического очага с его последующей генерализацией и развитием моторных судорог.
Показанное в работе увеличение выброса НА из нервных окончаний аксонов норадренергических нейронов в результате активации их тел на уровне продолговатого мозга в синем пятне во время возникновения Фокальных и"генерализованных судорог, играет важную роль в рзсшіренш наших знаний о тех синаптических тормозящих механизмах, нарушение которых может лежать в основе происхождения различных эпилептических состояний в ЩС и дает определенные предпосылки для разработки фармакологических подходов в лечении эпилептических заболеваний.
Изученная в работе роль трансплантации эмбриональной нервной ткани синего пятна в регулировании предрасположенности к эпилеп-тизации мозга взрослых реципиентов, углубляет' наше понимание функционального интегрирования таких трансплантатов в уже сформировавшиеся нервные цепи, с одновременным изменением их функцинального состояния. Подавление генерализации судорожной активности пересадкой определенного типа эмбриональной нервной ткани в различные критические для эпилептизации структуры головного мозга может ішеть неоценимое практическое значение длі разработки методов нейрохирургического лечения эпилептических заболеваний с использованием метода внутримозговой трансплантации. Практическое
- 8 -значение этого метода уже подтверждается многочисленными успешными клиническими попытками использования такого подхода в лечении Паркинсонизма.
Результаты работы могут быть использованы при чтении учебных курсов нейрофизиологии, невролопш и .невропатологии в ВУЗах биолопіческого и медицинского профилей, а также могут быть в дальнейшем внедрены в невролдогических и нейрохирурпіческих клиниках.
Основные положения выносимые на защиту,
1. Изменения содержания НА з микродиализных перфузатах гиппокампа
отражает изменения в сикаптической активности норадренергической
системы синего пятна крыс:
стимуляция синаптических окончаний повышением концентрации КСІ в перфуэирующем растворе, а также блокироание поглощения НА синаптическими окончаниями добавлением дезипрамика, приводит к значительному увеличению концентрации НА в перфузатах;
блокирование потенциалов действия аксонов путем добавления в перфузирующий раствор блокатора натриевых каналов тетродотоксина на фоне действия дезипрамика приводит к резкому падению содержания НА в перфузате:,
галотановый наркоз значительно уменьшает концентрацию НА в префузате;
нейронное происхождение НА доказывает понижение его содержания в перфузате ниже уроня детекции после разрушения норадренергической системы внутрижелудочковымм введением катехоламинергического нейротоксина, 6-гидроксидофамина (6-ГДА)
2. Нейротоксическое разрушение норадренергической системы мозга
частично компенсируется с течением времени:
- низкое содержание НА в перфузате гиппокампа, не поддающееся
определению на второй неделе после внутрихелудочкового введения
б-ГДА, постепенно восстанавливается до уровня детекции, на 4-8
неделе, не достигая контрольного значения,-
-при этом увеличение высвобождения НА в ответ на повышение концентрации КСІ в перфуэирующем растворе и генерализованную судорогу сильно подавлено;
3. Фоноеый устойчивый уровень внеклеточного НА значительно
уменьшается после завершения процесса раскачки, однако
норадренергичэская система синего пятна сохраняет способность
- 9 -реагировать на развитие судорог увеличения высвобождения НА:
гиппокзмпалькые перфузаты интактных животных содержат значительно высокие концентрации НА по сравнению с животными подвергшихся процессу польной раскачки;
развитие как Фокальных (интактные животные), так и генерализованных судорог (животные подвергшиеся полной раскачке) приводит к одинаковому повышению высвобождения НА в гиппокампэльных перфузатах;
4. Увеличение высвобождения НА во время развития генерализованных
судорог происходит зз счет активации тел нейронов синего пятна:
- увеличение высвобождения НА в ответ на генерализованные
судороги в гиппокампе устраняется перерезкой восходящих путей
синего пятна;
5. Процесс генерализации судорог тесно связан с нарушением нормальной
норадренергической нейропередачи в гиппокампе во время быстрой
раскачки:
увеличенный выброс НА в ответ на первоначальные стимуляции быстрой раскачки постепенно уменьшается с последующими раздражениями;
процесс генерализации судорог во время быстрой раскачки усиливается с уменьшением высвобождения НА;
6. Унилатеральная норадренергическая реиннервация гиппокампа но
влияет на процесс генералиэашш судорог, вызванных раскачкой
гиппокампа:
- пересадка норадренергической ткани эмбрионального синего
пятна илсилатерально по отношению к раздражающему электроду в
гиппокамп не способна повлиять на развитие раскачки;
7. Реиннервация норадренергическими волокнами амигдала-пириформной
коры достаточна для подавления генерализации 'судорог, вне зависимости
от места их первоначального возникновения:
- пересадка норадренергической эмбриональной ткани в область
амигдала-пириформной коры в животных с повышенным предрас
положением к судорогам связанным с предварительным разрушением
норадренергичесмкой системы, подавляет развитие генерализации
судорог, вызываемых раскачкой гиппокампа;
8. Аллогенная эмбриональная норадренергическая ткань способна
подавить генерализацию судорог при внутригиппокаыпальной трансплэн-
- 10 -тации:
- внутригиппокампальнзя пересадка норадренергической эмбриональной ткани между индивидами лабораторной линии беспородных крыс с повышенным предрасположением к судорогам связанным с предварительным разруиением норадрекергичесмкой системы, подавляет развитие генерализации судорог, вызываемых раскачкой гсппокампа: 9. Пересаженная эмбриональная ткань окаэнвэет свое подавляющее влияние на развитие генерализации судорог посредством активации эктопически расположенных норадренергических нейронов, которые хорошо интегрированы в мозг реципиента:
генерализованные судороги вызывают аналогичное нормальному увеличение высвобождения' НА из транспадотированных норадренергических нейронов эмбрионального синего пятна:
эффект подавления генерализации судорог у крыс с предварительным разрушением норадренергической системы трзнспалнтатами эмбриональной нервной ткани устраняется при блокировании альфа-2 адарекергических рецепторов введением идазоксана:
Апробация работы. Материалы диссертации доложены на: Ежегодной Международной встрече Общества Нейронаук (ХУПІ - Торонто, 1988); Ежегодной Международной встрече Европейского Общества Нейронаук (XI -Цюрих, ФРГ, 1983; XII - Турин, Италия, 1989; XIII - Стокгольм, Швеция, 1990); Четвертой мєадународной встрече «Электрохимическая детекция, ХХВД и in vivo наблюдения в бионэуках.» (Ноттингем, Великобритания, 1939); Международной встрече Американского Общества Эпилепсии (Бостон, США, І989)-, Осенней школе Европейской Образовательной Программы (Кастельвеччио, Лука, Италия, 1990); заседании Физиологического общества Грузии; заседании ученого совета Института физиологии АН Грузии.
Публикации. Основные положения диссертации изложены в 17 печатных работах.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 271 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, 7 глав и вызодоз. Работа илюстрирована 22 рисунками и 2 таблицами. Библиография содержит 471 источников, из которых 28 отечественных и 443 иностранных.