Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы
Основные характеристики мультипотентных мезенхимных стромальных клеток (МСК)
История исследования малодифференцированных стромальных предшественников взрослого организма
Критерии МСК
Тканевые источники МСК .
МСК из жировой ткани .
Участие МСК в регенеративных процессах .
МСК в клеточной терапии и регенеративной медицине
Содержание кислорода как фактор микроокружения МСК .
Молекулярный механизм ответа МСК на пониженную концентрацию О2
Изменение свойств МСК при гипоксических значениях концентрации О2 .
Морфология и иммунофенотип .
Жизнеспособность и метаболизм
Пролиферация .
Дифференцировка/пластичность
Миграция в зону повреждения
Иммуномодуляторные свойства МСК
Воздействие МСК на иммунной системы: клеточные компоненты
Т-лимфоциты Натуральные киллеры (НК) Дендритные клетки (ДК) В-лимфоциты Механизм реализации иммуносупрессивных свойств МСК Влияние О2 на иммуномодуляторные свойства МСК Влияние иммунных клеток на МСК Иммуномодуляция Жизнеспособность Морфология и иммунофенотип .
Пролиферация 48
Миграция 49
Дифференцировка 49
Материалы и методы исследования 54
Химические реагенты 54
Антитела 54
Материалы и оборудование 55
Среды для культивирования клеток 56
Выделение МСК 57
Культивирование МСК 57
Пассирование МСК 57
Криоконсервация МСК 58
Размораживание МСК 58
Выделение МНК 58
Сокультивирование МСК и МНК 58
Методы исследования 59
Характеристика апоптотического и некротического путей гибели
МСК 59
Пролиферативная активность 60
Дифференцировка в остеогенном направлении 60
Дифференцировка в адипогенном направлении 61
Оценка функционального состояния митохондрий, лизосом, эндоплазматического ретикулума, продукции активных форм кислорода 62
Конфокальная микроскопия 63
Иммуноцитохимический анализ 63
Определение содержания цитокинов в среде культивирования 63
Анализ дифференциальной экспрессии генов 65
Проточная цитофлуориметрия 66
Направленная миграция МСК 66
Ненаправленная миграция МСК 67
Статистическая обработка 67
Результаты экспериментальных исследований 68
Характеристика МСК и МНК в монокультуре при различном уровне кислорода 68
Характеристика монокультуры МНК 72
МСК после взаимодействия с неактивированными МНК 73
3.4 Морфофункциональная характеристика МСК после взаимодействия с ФГА- активированными МНК 75
3.4.1 Жизнеспособность 76
3.4.2 Клеточные органеллы
3.4.2.1 Митохондрии 77
3.4.2.2 Лизосомы 77
3.4.2.3 Эндоплазматический ретикулум 78
3.4.2.4 Продукция АФК
3.4.3 Иммунофенотип 79
3.4.4 Пролиферативная активность 80
3.4.5 Миграционная активность
3.4.5.1 Ненаправленная миграция 82
3.4.5.2 Направленная миграция МСК 83
3.4. Способность к дифференцировке
3.4.6.1 Остеогенная дифференцировка 85
3.4.6.2 Адипогенная дифференцировка
3.4.7 Экспрессия на МСК молекул межклеточных контактов ICAM1 88
3.4.8 Экспрессия молекул главного комплекса гистосовместимости HLA-ABC и HLA-DR 89
3.4.9 Паракринная активность 90
3.4.10 Транскрипционная активность 93
3.5 МСК с исходно высоким и низким уровнем АФК проявляют разные свойства при взаимодействии с МНК 97
3.5.1 Морфология МСК 98
3.5.2 Жизнеспособность МСК 99
3.5.3 Митохондриальная активность МСК 100
3.5.4 Лизосомальная активность МСК 101
3.5.5 Продукция АФК 102
Глава 4. Обсуждение результатов 104
Выводы 118
Список литературы
- Содержание кислорода как фактор микроокружения МСК
- Среды для культивирования клеток
- Оценка функционального состояния митохондрий, лизосом, эндоплазматического ретикулума, продукции активных форм кислорода
- Экспрессия на МСК молекул межклеточных контактов ICAM1
Содержание кислорода как фактор микроокружения МСК
Основоположником современной концепции о мультипотентных стромальных предшественниках по праву считается А.Я. Фриденштейн. Но задолго до осуществления серии работ коллектива под его руководством исследователи пытались описать свойства и роль в организме клеток, являющихся компонентами стромы костного мозга. Обзор Prockop (1997) отсылает нас к исследованиям, которые проводились ещ XIX в. В 1867 г. немецкий патолог J.F. Cohnheim опубликовал работу, в которой предположил, что фибробластоподобные клетки, участвующие в восстановлении повреждений, приходят из костного мозга. В это же время L.L. Ollier показал, что костный мозг является источником предшественников костных клеток. К 1869 г. Goujon в экспериментальной модели на животном впервые выполнил эктопическую трансплантацию костного мозга и показал образование кости, а уже в следующем году А. Байков в своей работе (Baikow A., ber Transplantation von Knochenmark) подтвердил эти результаты.
Чрезвычайно важную роль в развитии исследований в области стволовых клеток мезенхимного происхождения сыграли работы выдающегося отечественного гистолога А.А. Максимова, сформулировавшего теорию «мезенхимного резерва». В 1927 г. был опубликован его фундаментальный труд «Соединительная ткань и кроветворные ткани» (нем. Bindegewebe und Blutbildendes Gewebe), где он высказал мнение о наличии в соединительных тканях взрослого организма клеток-предшественников, располагающихся вокруг мелких сосудов. Эти клетки он обозначал как стволовые мезенхимные клетки, вкладывая в это понятие не только их эмбриональное происхождение, но и дифференцировочные потенции, т.е. способность дифференцироваться во все виды соединительных тканей, например, при репаративном гистогенезе. Это направление продолжилось в работах выдающихся российских гистологов А.А. Заварзина, С.И. Щелкунова, Н.Г. Хлопина. Было продемонстрировано, что малодифференцированные фибробласты (по Заварзину «камбиальные клетки»), лежащие в основном вблизи сосудов, участвуют в репаративном гистогенезе соединительной ткани, а также в физиологической регенерации (см. обзор Бозо и др., 2010). Позже были проведены эксперименты, демонстрирующие как то, что в репаративных процессах участвуют местные источники клеток-предшественников (Ross et al., 1970), так и участие в этом предшественников костномозгового происхождения (Хрущов, 1976; Oehmichen, 1973).
В 1961 г. А.Я. Фриденштейн выделил из костного мозга адгезирующие фибробластоподобные клоногенные клетки, которые были названы им колониеобразующими единицами фибробластов – КОЕ-Ф. In vitro эти клетки обладали высокой репликативной способностью (Фриденштейн и др., 1973; Friedenstein et al., 1968, 1970, 1974), а при трансплантации in vivo проявляли мультипотентность: КОЕ-Ф дифференцировались в остеобласты, хондроциты, адипоциты и клетки гемопоэтической стромы (Фриденштейн и др., 1968, 1986; Лурия и др., 1966; Friedenstein et al., 1966, 1968, 1974, 1980, 1987). А.Я. Фриденштейн в своих работах указывал на то, что в постнатальном периоде костный мозг является резервуаром стволовых клеток для тканей мезенхимального происхождения.
Многочисленные исследования продемонстрировали, что стромальные клетки, присутствующие в костном мозге, обладают потенциями к дифференцировке в различных направлениях. Danis (1960) (см. Dennis et al., 2007) с помощью имплантации животным диффузионных камер с костным мозгом показал, что клетки костного мозга обладают остеогенным потенциалом, а не являются лишь индуктивным фактором или хемоаттрактантом для остеогенных клеток. Другими исследовательскими группами (Petrakova et al., 1963; Friedenstein et al., 1966; Bruder et al., 1990) в сходных экспериментах установлено, что клетки костного мозга обладают потенциалом к образованию, по крайней мере, кости и хряща, а позже было обнаружено, что костный мозг содержит клетки различных мезенхимных линий (Owen, Friedenstein, 1988; Caplan, 1991, Dennis et al., 1996, 1999, 2002, Friedenstein, 1973; Friedenstein et al., 1987, Pittenger et al., 1999), и при особых условиях культивирования популяция клеток костного мозга экспрессирует дополнительные маркры эктодермальных и энтодермальных линий (Jiang et al., 2002).
В 1991 г. Caplan предложил термин «мезенхимные стволовые клетки» для обозначения стромальных предшественников, после чего аббревиатура МСК стала общеупотребительной. Говоря об эмбриональных МСК, он констатировал, что они являются мультипотентными предшественниками, способными многократно делиться, и потомки которых дают начало опорным тканям, среди которых хрящ, кость, связки, сухожилие, строма костного мозга, соединительная ткань; по определению, они не ограничиваются фиксированным числом митотических делений. В то же время он возлагал большие надежды на возможность использования собственных МСК взрослого организма для целенаправленной дифференцировки (in vitro) в клетки какой-либо линии в регенеративных целях, подчркивая, что МСК должны существовать для поддержания стромального дифферона, точно так же, как гемопоэтические стволовые клетки обеспечивают оборот красных и белых клеток крови (Caplan, 1991). В течение многих лет шли споры о стволовых характеристиках этих клеток, т.е. о способности их к самообновлению и асимметричному делению. В 1999 году Pittenger описал наличие в костном мозге человека 3-потентных адипогенных, остеогенных и хондрогенных клонов и охарактеризовал профиль их поверхностных антигенов с низкой экспрессией специфических маркров эндотелиальной и гемопоэтической линий дифференцировки. Дальнейшие исследования показали, что МСК действительно отличаются от эндотелиальных и гемопоэтических прогениторных клеток (Delorme et al., 2008).
Стромальные клетки с мультипотентными свойствами в ходе исследований назывались по-разному. Фриденштейн определял их «КОЕ-ф» или «остеогенные предшественники» (Friedenstein et al., 1970), Owen использовал термин «стромальные костномозговые клетки» (Owen et al., 1987). Наиболее часто использовался термин Каплана «МСК», но в то же время Bianco и Robey предпочитали применять название «скелетные стволовые клетки», а Dennis называл их «мезенхимными клетками-предшественниками» (Caplan, 1991; Dennis et al., 1999; Bianco et al., 2008). В 2006 году Международное Общество по Клеточной Терапии (Mesenchymal and Tissue Stem Cell Committee of the International Society for Cellular Therapy) предложило термин «мультипотентные мезенхимные стволовые/стромальные клетки (МСК)», чтобы подчеркнуть стволовые и стромальные характеристики этих клеток (Dominici et al., 2006).
Среды для культивирования клеток
Valencic et al. (2014) показали, что активированные лимфоциты снижают пролиферативную активность МСК. Причм приписать это свойство какой-то определнной популяции клеток не удатся, поскольку подавление пролиферации происходило как в присутствии смеси лимфоцитов, так и после удаления НК-клеток, а также с выделенными популяциями CD4+ и CD8+ лимфоцитов. В то же время неактивированные лимфоциты не оказывали влияние на этот показатель. Авторы считают, что в этой системе в подавлении пролиферации играют роль внеклеточный АТФ и в меньшей степени ФНО-альфа. Интересно, что когда МСК были предварительно обработаны провоспалительным ИФН-гамма, они оказывались в какой-то степени защищены от действия активированных лимфоцитов. Но в случае, когда на МСК действовала кондиционированная среда от активированных лимфоцитов, такое праймирование интерфероном не «спасало» от подавления пролиферации. Возможно, праймированные МСК регулируют активированные лимфоциты таким образом, что сформировавшееся микроокружение уже не столь значительно изменяет свойства МСК; кондиционированная среда взята от лимфоцитов, которые были активированы, но в этом случае не происходило динамического взаимодействия между клетками, при котором МСК способны регулировать функции лимфоцитов, а не просто односторонне реагировать на выделенные ими цитокины.
В другой модельной системе, где в качестве источника стимуляции использовалась СКЛ, авторы отмечали повышение пролиферативной активности МСК (Crop et al., 2010). Но когда воспалительное микроокружение создавалось добавлением в среду смеси цитокинов ИФН-гамма, ФНО-альфа и ИЛ-6, наоборот, пролиферация МСК замедлялась. Freytes et al. (2013) обнаруживали ингибирование роста МСК М1 макрофагами за счт продукции ИЛ-1бета, ИЛ-6, ФНО-альфа и ИФН-гамма и стимуляцию роста М2 макрофагами и ассоциированными с ними цитокинами ИЛ-10, ТФР-бета1, ТФР-бета3 и VEGF.
Более детальное исследование влияния на пролиферацию МСК различных цитокинов выявило разнонаправленное действие этих факторов. Ряд цитокинов вызывал замедление пролиферации, среди них: ИФН-гамма, ИЛ-1бета, HMGB1, ГФР (Abarbanell et al., 2009; Croitoru-Lamoury et al., 2011; Liu et al., 2013). Некоторые цитокины, напротив, оказывали стимулирующее воздействие: ФНО-альфа, ТФР-бета1 (Abarbanell et al., 2009; Rodrigues et al., 2010; Zubkova et al., 2016), хотя ранее были получены данные о торможении пролиферации ТФР-бета1 (Romieu-Mourez et al., 2007). По-видимому, причиной вариабельности результатов могут быть различающиеся подходы в построении модельной системы, использование разных активаторов иммунной реакции и разных способов создания воспалительного микроокружения. В таких системах условия микроокружения, в котором оказываются МСК, будут отличаться друг от друга, где-то в большей степени, где-то менее значительно. Но так или иначе, эти различия могут заметно повлиять на проявление свойств МСК (Gornostaeva et al., 2015).
Целый ряд исследований указывает на то, что воспалительное микроокружение способствует повышению миграционной активности МСК: стимулирующий эффект проявляют смесь растворимых факторов, секретируемых активированными лимфоцитами (Li et al., 2015), моноцитами (Григорьева и др., 2014), а также цитокины: ИФН-гамма, ФНО-альфа, ИЛ-2, ИЛ-6, ИЛ-8, HMGB1, ТФР-бета1, VEGF, IGF-1, ТрФР, ГФР, SDF-1, MCP-1, MCP-3, MIP-1, MIP-3 (Abarbanell et al., 2009, Li et al., 2012, Plotnikov et al., 2013; Lejmi et al., 2015, Li et al., 2015, Niu et al., 2015, Zubkova et al., 2015). Schmidt-Lucke et al. (2015) наблюдали миграцию в сердце аутологичных МСК пациентов с воспалительной кардиомиопатией, чему, вероятно, способствовали выделяемые в очаге воспаления цитокины. Таким образом, возможно, стимулируется направленное движение МСК в очаг воспалительной/иммунной реакции, где они будут осуществлять местное регуляторное воздействие.
Данные о влиянии участников иммунного ответа на дифференцировку МСК неоднозначны. Li et al. (2015) показали, что медиаторы, выделяемые активированными лимфоцитами, стимулируют остеогенную дифференцировку МСК. Схожие результаты получили и Falrinner et al. (2012): кондиционированная среда от смешанной культуры лимфоцитов способствовала остеогенной дифференцировке (но при этом подавляла адипогенную), аналогично действовали и цитокины ФНО-альфа и ИФН-гамма. Эти авторы также отмечали увеличение пролиферативной активности МСК, и возможно, стимуляция остеогенной дифференцировки была связана с возросшей плотностью – эффект, который ранее наблюдали Lohmann et al. (2012). В то же время Crop et al. (2010) не выявили влияния паракринного взаимодействия со смешанной культурой лимфоцитов на дифференцировочный потенциал МСК. Prasanna et al. (2010) также не обнаружили изменения остеогенной, хондрогенной и адипогенной дифференцровки МСК под воздействием ИФН-гамма и ФНО-альфа. Более того, имеются данные, что ИФН-гамма способен снижать остеогенный и адипогенный потенциал МСК (Croitoru-Lamoury et al., 2011), а ФНО-альфа – остеогенный, адипогенный, хондрогенный и миогенный (Abarbanell et al., 2009; Suzawa et al., 2011; Lu et al., 2011). Cao et al. (2015) обнаружили снижение экспрессии генов Runx2 (Runt-related transcription factor 2) и Osx (Osterix) – ключевых для остеогенеза транскрипционных факторов. In vivo показано, что секретируемые лимфоцитами реципиента ИФН-гамма и ФНО-альфа подавляют регенерацию кости, осуществляемую за счт аллогенных МСК (Liu et al., 2011). При этом подавление остеогенеза ИФН-гамма может осуществляться через повышение уровня SMAD6 с последующим ингибированием RUNX2 – ключевого фактора остеогенной дифференцировки. ИФН-гамма и ФНО-альфа способны стимулировать апоптоз МСК через интернализацию FAS, при этом происходит снижение экспрессии транскрипционного фактора NF-B и блокаторов клеточной гибели XIAP (X-linked inhibitor of apoptosis protein) и FLIP (FLICE-inhibitory protein). Liu et al. (2011) показали, что местное введение аспирина и системное введение Treg способны значительно улучшить МСК-опосредованное заживление костей свода черепа за счт снижения уровня ИФН-гамма и ФНО-альфа.
Таким образом, при аллогенном иммунном ответе МСК оказываются под воздействием целого спектра цитокинов, выделяемых иммунными клетками, а также непосредственных контактов с этими клетками. Все вместе эти факторы регулируют свойства МСК, но результат такого взаимодействия в значительной степени зависит от исходного состояния самих МСК. В ответ на факторы, выделяемые иммунными клетками при взаимодействии, может происходить изменение пролиферативной, дифференцировочной активности МСК, способности к поддержанию гемопоэза, экспрессии молекул адгезии, паракринной активности. Однако вопрос о влиянии на МСК иммунных клеток остатся довольно слабо проработанным, как следует из Таблицы 1.8, а значительная часть исследований, посвящнных этой тематике, рассматривает влияние на МСК каких-либо конкретных цитокинов (либо смеси цитокинов). В то же время, в межклеточном взаимодействии участвует целый спектр растворимых факторов и молекул межклеточных контактов, кумулятивное действие которых может отличаться от эффектов каждого из них, взятых по отдельности.
Оценка функционального состояния митохондрий, лизосом, эндоплазматического ретикулума, продукции активных форм кислорода
Межклеточное взаимодействие представляет собой сложный динамический процесс, в котором клетки подвергаются воздействию со стороны как клеточных, так и внеклеточных компонентов микроокружения, отвечают на него и тем самым регулируют свойства других клеток в соответствии со своим новым статусом. В настоящей работе были исследованы эффекты аллогенных активированных МНК на функциональную активность МСК в условиях «физиологической» гипоксии (при концентрации О2, близкой к тканевой). Эти эффекты были рассмотрены в двух аспектах. Во-первых, как провоспалительная активация («праймирование») со стороны аллогенных МНК влияет на состояние самих МСК. Во-вторых, как изменяются функции МСК, непосредственно связанные с дальнейшим взаимодействием с другими клетками (в т.ч. иммунными), что может отразиться на их судьбе и дальнейшем участии в физиологических процессах.
Активация МСК в присутствии провоспалительных медиаторов рассматривается в настоящее время как основной механизм индукции функциональной активности этих клеток, в первую очередь, иммуномодуляторного потенциала. Показано, что этот эффект обеспечивается в присутствии активированных иммунных клеток, а также отдельных провоспалительных медиаторов (ФНО-альфа, ИФН-гамма, ИЛ-1бета, ИЛ-6), причем эффекты коктейля факторов, выделяемых активированными МНК, и отдельных метаболитов могут значительно отличаться (Chan et al., 2007; Ryan et al., 2007; Crop et al., 2010; Hemeda et al., 2010; Prasanna et al., 2010). Так, при анализе экспрессии генов было выявлено только частичное совпадение генов с измененной транскрипционной активностью в МСК, экспонированных с отдельными цитокинами и их комбинациями или с кондиционированной средой от смешанной культуры лимфоцитов (Crop et al., 2010). При этом индивидуальные цитокины стимулировали продукцию МСК ИДО, а коктейль от иммунных клеток – ПГЕ2-опосредованную иммуносупрессию (Crop et al., 2010). Эти данные прямо указывают на то, что использование смеси медиаторов, продуцированных МНК, является более адекватным с точки зрения физиологии подходом для анализа провоспалительного воздействия на МСК.
Действительно, выполненный в настоящей работе анализ дифференциальной экспрессии генов МСК после экспозиции с активированными МНК, отделнными полупроницаемой мембраной, выявил увеличение экспрессии ФНО-альфа и ИФН индуцируемых генов (TNFAIP3, IF44, GBP2 и др.), что может указывать на провоспалительную активацию МСК, необходимую для стимуляции продукции иммуносупрессивных факторов. В МСК возросла активность генов, ответственных за молекулы гистосовместимости I класса, среди них: HLA-B, HLA-E, HLA-H. Кроме того, повышалась экспрессия HLA-ABC на поверхности МСК, что подтверждает описанные ранее эффекты (Le Blanc et al., 2003). При этом лишь малый процент МСК экспрессировал молекулы гистосовместимости II класса после контактного взаимодействия с активированными МНК, а паракринное взаимодействие вовсе не повлияло на экспрессию этого антигена: как и в монокультуре, он не детектировался на поверхности МСК, хотя ранее Crop et al. (2010) показали увеличение экспрессии молекул MHCII в воспалительном окружении. Однако среди использованных ими МСК изначально выявлялось небольшое количество HLA-DR-положительных клеток, в то время как в наших экспериментах МСК практически не экспрессировали данный антиген.
Дополнительным подтверждением индукции иммуносупрессивной активности является увеличение экспрессии гена СОХ-2 - циклооксигеназы-2 (индуцибельной). Этот фермент участвует в продукции ПГЕ2 – одного из основных факторов, подавляющих пролиферацию Т-клеток (сходные результаты получены Crop et al., 2010). Кроме того, происходило повышение экспрессии PTGS2, кодирующего один из ключевых ферментов метаболизма арахидоновой кислоты – субстрата для синтеза различных простагландинов, в числе которых ПГЕ2 (Aggarwal et al., 2008). Таким образом, можно утверждать, что как при 20%, так и при 5 % О2 паракринные факторы, образующиеся при активации МНК в присутствии МСК, вызывали провоспалительную активацию последних, что подтверждалось индукцией иммуносупрессивной активности, по крайней мере, на уровне транскрипции. Ранее в нашей и ряде других лабораторий было продемонстрировано снижение активации и пролиферации Т-клеток в присутствии МСК, что является функциональной реализацией описанного выше изменения профиля экспрессии генов.
Каким же образом МСК реагировали на «праймирование», помимо активации иммуносупресии? Как показали наши эксперименты, после 72 часов паракринного и контактного взаимодействия с активированными МНК как при 20% О2 (нормоксия), так и при «физиологической» гипоксии (5% О2) МСК сохраняли стромальный фенотип (CD73+, CD90+, CD105+, CD45-), что подтверждает ранее полученные при 20% О2 данные об отсутствии влияния смешанной культуры лимфоцитов (Crop et al., 2010) и провоспалительных цитокинов ИФН-гамма и ФНО-альфа (Beyth et al., 2005) на экспрессию некоторых маркрных молекул МСК. Анализ состояния клеточных органелл не выявил изменения трансмембранного потенциала митохондрий и стресса ЭПР, который характеризуется значительным увеличением объма цистерн, заполненных нефункциональным белком. Однако, в МСК при прямом контакте с МНК наблюдалось закисление лизосомального компартмента, что может быть связано с деградацией поврежднных, либо ненужных клетке структур, и повышался уровень эндогенных АФК, которые могут оказывать повреждающее воздействие на различные структуры клетки.
В результате более детального анализа внутриклеточных параметров было установлено, что все МСК в данном исследовании можно разделить на 2 группы: первая -МСК, в которых уровень АФК исходно был относительно низким, и вторая - МСК с относительно высоким уровнем АФК. Оказалось, что МСК с исходно высоким уровнем АФК более чувствительны к воздействию МНК, что особенно проявлялось при контактном взаимодействии. Было выявлено небольшое, но достоверное снижение жизнеспособности, а также повышение лизосомальной активности и дальнейшее повышение уровня АФК. При паракринном контакте доля живых клеток уменьшалась только при 20% О2, кроме того, наблюдалось повышение активности митохондрий, лизосомального компартмента и продукции АФК, в разной степени выраженное при 20% и 5% О2. В то же время МСК с исходно низким уровнем АФК в меньшей степени реагировали на «праймирование». При непосредственном контакте активированные иммунные клетки не влияли на жизнеспособность МСК, в «физиологической» гипоксии увеличивалась лизосомальная активность и продукция АФК. Таким образом, нам удалось показать, что исходный уровень АФК в МСК может быть одним из факторов, регулирующих ответ МСК на провоспалительное «праймирование».
Известно, что значительное накопление АФК в клетке ведт к окислительному стрессу и повреждению клеточных структур (Зоров и др., 2005; Papa S., Skulachev V.P., 1997). Внутриклеточные АФК играют важную регуляторную роль, активируя MAPK сигнальные пути, такие как JNK, p38MAPK, ERK, а при определнных условиях способны провоцировать апоптоз через увеличение продукции проапоптотических белков и ингибирование антиапоптотических путей (Скулачев, 2001; Rodrigues et al., 2012). Song et al. (2010) показали, что АФК ухудшают адгезию МСК к клеткам и матриксу, в т.ч. за счт снижения количества молекул фокальных контактов фосфо-FAK, p-Src, а также интегринов V, 1. Таким образом снижается способность МСК приживляться при трансплантации. В нашей лаборатории было продемонстрировано, что индукция выработки нецитотоксических доз эндогенных АФК может приводить к увеличению экспрессии на МСК ICAM-1 и снижению уровня CD90.
Кроме того, наблюдалось повышение продукции провоспалительных цитокинов ИЛ-6 и ИЛ-8, а также VEGF, и снижался уровень ТФР-бета1, и в целом можно говорить о провоспалительном и проангиогенном изменении функционального состояния МСК. Предположительно, в таких условиях действие АФК может быть опосредовано HIF-1 и NF-B (Ударцева и др., 2016). В ряде исследований получены данные о регуляции дифференцировки МСК в адипоциты, хондроциты, остеоциты и нейрональные клетки в зависимости от активности митохондрий и выработки АФК (Shao et al., 2007; Rodrigues et al., 2012; Zhang et al., 2013; Nayernia et al., 2014). Через PDGFR-b, Akt и ERK пути АФК индуцируют экспрессию микро-РНК miR-210, которая способствует повышению пролиферативной активности и миграции МСК (Kim et al., 2013). Таким образом, АФК играют роль в выживании, пролиферации и терминальной дифференцировке МСК. АФК способны регулировать дифференцировку в остео/адипо-направлениях через различные сигнальные пути: при низком уровне АФК задействованы преимущественно Wnt, Hedgehog, Nell-1, BMP, IGF, которые способствуют остеогенной дифференцировке. При повышенном уровне АФК задействованы FOXO, PPARg, CEBPs, BMP, IGF, которые стимулируют адипогенную дифференцировку (Atashi et al., 2015).
Зубкова и др. (2016) показали, что АФК являются важными сигнальными молекулами, вовлеченными в ФНО-альфа-опосредованную активацию пролиферации и миграции МСК, а также их секреторной и ангиогенез-стимулирующей активности. При этом включаются сигнальные каскады, в которых участвуют Akt, малая ГТФаза Rac1, ERK1/2 и p38 MAPK, способствующие активации ангиогенеза (Zubkova et al., 2016). Кроме того, было обнаружено, что МСК (6-8 пассажи), предкультивированные в гипоксических условиях (2% О2), оказывают благоприятное «трофическое» воздействие на гепатоциты, причм это воздействие реализуется за счт механизмов и сигнальных путей, в которых задействованы АФК (Qin et al., 2015).
Экспрессия на МСК молекул межклеточных контактов ICAM1
Межклеточное взаимодействие опосредуется как мембранно-связанными, так и растворимыми молекулами. При контакте с МНК при обеих концентрациях О2 обнаружено не только увеличение до 100% доли МСК, несущих ICAM-1, но и возрастание числа этих молекул адгезии на поверхности МСК. Кроме того, после сокультивирования в кондиционированной среде была детектирована растворимая форма sICAM-1, которая отсутствовала в среде монокультуры МСК. Как известно, ICAM-1 играет важную роль в адгезии лейкоцитов и миграции их в область воспаления (Yang et al., 2005). Ранее Falrinner et al. (2012) продемонстрировали увеличение экспрессии данного антигена при взаимодействии МНК и МСК из костного мозга при 20% О2. Majumdar et al. (2003) связывают такое увеличение экспрессии ICAM-1 с воздействием на МСК ФНО-альфа и ИФН-гамма, вырабатываемых активированными МНК. Зубкова и др. (Zubkova et al., 2016) показали повышение экспрессии этой молекулы в присутствии ФНО-альфа. Хотя, по-видимому, какие-то паракринные факторы помимо ИФН-гамма и ФНО-альфа ответственны за такое повышение, т.к. блокировка ИФН-гамма, ФНО-альфа не отменяет полностью роста экспрессии ICAM-1 (Falrinner et al., 2012).
В работе Ren et al. (2010) показано, что экспрессия ICAM-1 на МСК повышается не только под воздействием ИФН-гамма, ФНО-альфа, но также и ИЛ-1. Najar et al. (2010) наблюдали повышение экспрессии этой молекулы в присутствии активированных Т клеток, а также в воспалительном окружении, однако блокирование ICAM-1 при помощи антител не вызывало подавления иммуносупрессивных свойств МСК. Возможно, ICAM-1 напрямую не участвует в формировании способности МСК к подавлению иммунной реакции. Но эта молекула опосредует миграцию лимфоцитов к МСК (Ren et al., 2008), и авторы связывают повышение экспрессии ICAM-1 с увеличением иммуносупрессивной способности МСК за счет «концентрирования» вокруг них иммунных клеток и дальнейшего воздействия на них растворимых иммуноподавляющих факторов, вырабатываемых МСК.
В нашей работе экспрессия ICAM-1 на поверхности МСК после контакта с МНК увеличивалась вне зависимости от концентрации О2. В то же время, уровень экспрессии другой молекулы, которая также может участвовать во взаимодействии с иммунными клетками (через leukocyte integrin Mac-1) - СD90 (Thy-1), был достоверно ниже в гипоксии. Ранее, в работе Campioni et al. (2009), было показано, что снижение экспрессии CD90 на МСК может вести к значительному уменьшению их иммуносупрессивной активности. Хотя мы и не обнаружили снижения иммуносупрессии МСК в гипоксии, факт уменьшения экспрессии CD90, по-видимому, подтверждает меньшую провоспалительную активацию МСК при тканевых значениях О2 (Wetzel et al., 2004). После контактного и паракринного взаимодействия МСК с аллогенными МНК изменился профиль цитокинов, детектируемых в кондиционированной среде сокультуры, по сравнению с монокультурами МНК и МСК. Известно, что МСК способны секретировать в условиях воспалительного окружения целый ряд растворимых молекул, которые имеют чрезвычайное значение для осуществления регенеративных процессов: ЭФР (эпидермальный фактор роста), ФРФ, ТрФР, ТФР-бета, VEGF, ГФР, ИФР-1 (инсулиноподобный фактор роста-1), Ang-1, KGF, SDF-1 (Ma et al., 2014). Выработка МСК молекул, обладающих иммуносупрессивными свойствами, отмечалась под воздействием факторов, выделяемых лейкоцитами в воспалительном окружении, в частности, ИФН-гамма в сочетании с ФНО-альфа, ИЛ-1альфа или ИЛ-1бета (Ma et al., 2014). Для медиаторов, продуцируемых МНК в монокультуре, после сокультивирования было отмечено существенное снижение концентрации ФНО-альфа, тогда как продукция ИФН-гамма, ИЛ-10 и ИЛ-1бета была такой же, как в монокультуре. Как МСК, так и МНК в монокультуре синтезировали ИЛ-8. При этом концентрация ИЛ-8 не изменялась при сокультивировании, что указывает на снижение продукции этого цитокина по крайней мере одним из типов взаимодействующих клеток. Исходя из того, что в МСК после взаимодействия с МНК было обнаружено значительное увеличение транскрипции гена IL8, можно предположить существенное подавление продукции ИЛ-8 в МНК. В монокультурах МСК и МНК были детектированы два медиатора суперсемейства ИЛ-6: ИЛ-6 и ЛИФ. Концентрация ИЛ-6 в среде после контактного и паракринного взаимодействия клеток была значительно ниже, чем в исходных монокультурах, что может говорить об уменьшении продукции этого цитокина как в МСК, так и в МНК. Транскрипционные изменения IL6 в МСК отсутствовали, и по-видимому, регуляция продукции ИЛ-6 осуществлялась на уровне синтеза белка. При этом нельзя исключить, что существенное подавление продукции этого интерлейкина происходило и в МНК.
Напротив, по сравнению с низким уровнем синтеза ЛИФ в монокультурах МСК и МНК, после сокультивирования при наличии контакта и при разделении полупроницаемой мембраной его концентрация существенно возросла. Кроме того, отмечалось и повышение транскрипционной активности гена LIF в МСК. Таким образом, учитывая снижение концентрации таких провоспалительных медиаторов, как ФНО-альфа и ИЛ-6, и увеличение продукции ЛИФ, являющегося одним из медиаторов иммуносупрессивной активности МСК, можно охарактеризовать изменение цитокинового профиля после взаимодействия как противовоспалительное, обеспечивающее иммуносупрессивные эффекты МСК. Кроме того, при непосредственном контакте с МНК повышалась продукция VEGF-, что может способствовать стимуляции роста сосудов при регенерации ткани.
Растворимые факторы, выделяемые активированными МНК, в значительной степени влияли на транскрипцию генов МСК, связанных с их паракринной активностью. Стимулировалась экспрессия генов МСК, отвечающих за продукцию целого ряда цитокинов, относящихся к семействам СС, CXC, IL. Наиболее значимое увеличение транскрипционной активности продемонстрировано для плейотропных хемокиновых молекул (CXCL5, IL8, CXCL1, IL1b, LIF, IL11), способных активировать пролиферацию клеток, в том числе и аутокринно. Эти молекулы обеспечивают хемотаксис, межклеточный и внутриклеточный сигналинг, регуляцию пролиферации, участие в иммунном ответе и воспалительной реакции лейкоцитов крови, таких как моноциты (МСР1), лимфоциты (CXCL12), гранулоциты (CXCL6), нейтрофилы (CXCL5, IL8, CXCL1). Кроме того, для CXCL5 и CXCL1 показано участие в стимуляции ангиогенеза, что также крайне важно для регенерации. Активность цитокиновых генов в некоторых случаях не зависела от концентрации О2 (CCL5, IL11), для ряда генов было показано существенное увеличение активности при 20% О2 (CXCL5, CXCL6, IL8), а для других – напротив, при 5% О2 (MCP-1, IL1b, LIF).