Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы. 8
2.1. Строение и рост фолликулов 8
2.2. Дцерно-цитоплазматическое созревание ооцитов . 10
2.3. Способность к созреванию и оплодотворению вне организма ооцитов крупного рогатого скота. 16
2.4. Методы извлечения ооцитов из яичников и отбор ооцитов для культивирования и оплодотворения in vitro. 16
2.5. Среды и сыворотки, используемые для созревания ооцитов коров. 22
2.6. Подготовка ооцитов для оплодотворения in vitro. 32
2.7. Культуры клеток, используемые для культивирования эмбрионов крупного рогатого скота. 44
2.8. Культивирование и сокультивирование оплодотворенных ооцитов in vitro на монослоях различных соматических клеток . 47
3. Собственные исследования. 55
3.1. Материал и методика исследований. 55
3.2. Влияние сезона года на созревание и оплодотворение ооцитов крупного рогатого скота при культивировании вне организма. 64
3.3. Созревание ооцитов в различных средах в присутствии сыворотки и гонадотропных гормонов . 66
3.4. Культивирование ооцитов в различных культуральных средах. 72
3.5. Влияние дозы гепарина и времени капацитации спермиев на их оплодотворяющую способность. 73
3.6. Культивирование и сокультивирование предымплантационных эмбрионов на монослоях соматических клеток . 74
4. Обсуждение 80
5. Выводы 88
6. Предложения и рекомендации 89
7. Список литературы 90
- Дцерно-цитоплазматическое созревание ооцитов
- Культивирование и сокультивирование оплодотворенных ооцитов in vitro на монослоях различных соматических клеток
- Созревание ооцитов в различных средах в присутствии сыворотки и гонадотропных гормонов
- Культивирование и сокультивирование предымплантационных эмбрионов на монослоях соматических клеток
Дцерно-цитоплазматическое созревание ооцитов
Большинство ооцитов из яичников коров содержит хромосомы на стадии диплотены, представленной диффузной, фибриллярной структурой и в виде отдельных бивалентов. По мере культивирования ооцитов в них заканчивается деконденсация хромосом с последующей постепенной конденсацией /55/.
Созревание ооцитов сопровождается значительными изменениями не только ядерного аппарата, но и функций цитоплазмы: увеличением синтеза РНК, белка, усилением дыхания, накопления и потребления энергетических субстратов. Шегельская Е.А, Щербак Е.В /49/ установили, что ядра ооцитов коров через 16 часов созревания находятся в стадии диакинеза и вступают в метафазу через 18-20ч. Стадии анафазы-1 и телофазы-I очень кратковременные и могут быть обнаружены через 20ч после культивирования. Ооциты с хромосомами в метафазе-П впервые появляются через 22ч. Все ооциты находятся на этой стадии мейоза через 24-26ч (рис 1).
Межклеточные взаимодействия между ооцитом и клетками яйценосного бугорка являются решающими в механизмах контроля мейотического процесса. Так, известно, что в преовулярный период поступления веществ из фолликулярных клеток в ооцит прекращается. Предполагается, что перед овуляцией щелевые контакты между ооцитом и фолликулярной клеткой под влиянием ЛГ нарушаются и ингибитор и другие регуляторы созревания перестают поступать в цитоплазму.
Зона пеллюцида удалена, видны веретено и хромосомы. К моменту рождения телки ее яйцеклетки достигают стадии диплотены/профазы мейоза. На этой стадии мейоза дальнейшее созревание ооцитов приостанавливается до физиологической зрелости животного. Установлено, что около 95% ооцитов, выделенных из антральных фолликулов, находятся на стадии диплотены, остальные на более поздних стадиях мейоза: диакинеза, метафазы-I и метафазы-П /11/. Ооциты на более поздних стадиях мейоза и часть ооцитов на стадии диплотены характеризуются признаками дегенерации (чаще слиянием хромосом), в среднем 60% фолликулярных ооцитов содержат интактные ядра на стадии диплотены мейоза. Таким образом, на стадии диплотены у крупного рогатого скота наступает блок мейоза. Важную роль в подавлении мейоза играют клетки гранулезы и некоторые компоненты фолликулярной жидкости. После подъема уровня лютеинизирующего гормона in vivo или извлечения ооцитов из фолликулов ингибирующее фолликулярное действие прекращается, и мейоз возобновляется /56/.
В опытах E.S.Critser et. al. /73/ оценивалось влияние гранулезных клеток на созревание ооцитов in vitro, ядерное созревание, оплодотворение и развитие эмбрионов. Свидетельством развития явилось получение морул и бластоцист. Овулировавшие ооциты коров после созревания in vitro с гранулезными клетками завершают ядерное дозревание (138/197, 70%) так же часто, как изолированные комплексы (133/197, 87%). Аналогичная частотность оплодотворения (33/38, 87%, против 55/73, 75%) и формирования мужских пронуклеусов (31/33, 94%, против 50/55, 91%) наблюдалась при культивировании с гранулезными клетками и без них. Однако во втором случае не отмечалось никакого развития, а в первом развивались 8/22 яйцеклетки (36%). Таким образом, взаимодействия гранулезных клеток с кумулюсно-овулировавшими ооцитами играют свою роль при стимулировании способности к развитию дозревающих овулировавших ооцитов коров.
L. Bigger et al. /66/ впервые показали, что гранулезные клетки обеспечивают энергетический субстрат ооциту. Теперь известно, что соматические клетки участвуют в переносе некоторых предшественников аминокислот, нуклеотидов и фосфолипидов в ооцит. Кроме того, фолликулярные клетки генерируют сигналы, которые влияют на ядро и прямой синтез структурных белков. И структурные сигналы, специфически требуемые для созревания ооцитов, наиболее критические впервые 6-8ч после инициации мейоза, и если они изменяются или блокируются, то вызывают большие нарушения в раннем развитии эмбриона.
Клетки кумулюса важны не только для полноценного созревания ооцита, но и для его оплодотворения. Так, установлено, что в ходе созревания ооцит - кумулюсного комплекса клетки, окружающие яйцеклетку, подвергаются лютеинизации и другим глубоким морфологическим изменениям. В частности, в межклеточном веществе под воздействием фермента гиалуронидазы образуется гиалуроновая кислота, разрыхляющая кумулюсный слой, что облегчает проникновение спермия к яйцеклетке в процессе оплодотворения in vitro /59/.
Смыслова Н.И и др. /45/ установили, что денудирование ооцитов с помощью гиалуронидазы повышает их оплодотворяемость на 21%, чем с интактными, и на 25,9% выше, чем с частично удаленными (рис.2).
Позднякова Т.Э. /37/ исследовала влияние различных биологически активных веществ на созревание ооцитов и установила, что активное разрыхление кумулюсных клеток способствует нормальному завершению
Так, при использовании жидкости из фолликулов диаметром более 6мм в качестве системы дозревания у 72,5% созревших яйцеклеток кумулюс был сильно разрыхленным, а у 9,9% ооцитов, не реинициировавших мейоз в процесс культивирования, он так и остался компактным. В случае использования жидкости из фолликулов диаметром 3-6мм, предварительно подвергшейся термической обработке, лишь 4,2% ооцитов достигли завершающихся стадий мейоза. Одновременно в этой же группе лишь 20% ооцитов имели кумулюс с высокой степенью разрыхления, а 52% даже не реинициировали мейоз.
При использовании в качестве систем дозревания фолликулярную жидкость, лишенную белков, 97,1% ооцитов не реинициировали мейоз. При этом лишь 3,8% комплексов отличались высокой степенью разрыхления кумулюсных клеток, а 85,3% ооцитов имели хромосомы с признаками дегенерации. 78% и 62,5% ооцитов созревших с добавками БФЖ 1 и БФЖ 2 фракций. Клетки гранулезы были окружены разрыхленными клетками кумулюса, при этом все ооциты инициировали мейоз.
Позднякова Т. Э. /37/ также установила, что при введении в культуральную среду 6СТГ и ФСГ 61,4% и 65,2% ооциты соответственно достигали стадий телофазы - метафазы -П. Лишь у 3,5% и 4,5% ооцитов, не реинициировавших мейоз, кумулюс оставался не разрыхленным.
А также в группе опыта, где в культуральную среду добавляли ФСГ 83,2% ооцитов достигли завершающих стадий мейоза, 85% ооцитов имели разрыхленный кумулюс.
Мейотическое преобразование хромосом, приводящие к образованию компетентных к оплодотворению яйцеклеток, протекают на основе тесного ооцит-кумулюсного взаимодействия, сопровождается вначале усилением синтеза ДНК и пролиферации фолликулярных клеток, с последующим их разрыхлением /37/.
Культивирование и сокультивирование оплодотворенных ооцитов in vitro на монослоях различных соматических клеток
Начиная с 1946 года эмбрионы коров, культивируют в большинстве случаев в различных средах и культуральных in vitro системах. В последние годы в рамках эмбриотрансплантации у крупного рогатого скота, на практике используются исключительно маточные эмбрионы. В связи с этим культивирование эмбрионов in vitro исследовалось как возможность кратковременного хранения морул и бластоцисты перед пересадкой. Главным интересом, была возможность надежного и стабильного приготовления сред культивирования, которые смогли бы обеспечить жизнеспособность эмбрионов на относительно короткое время.
Благодаря исследованиям в области in vitro оплодотворения, и развитию новых биотехнологических исследований, таких как пересадка генов и трансплантация ядер, стало необходимым получение эмбрионов на ранних стадиях деления, без больших качественных потерь при культивировании in vitro до стадии подлежащих пересадке.
При этом получение живого потомства после in vitro оплодотворения, с применением различной техники пересадки эмбрионов, а также исследование раннего эмбрионального развития, ограничивалось не хваткой соответствующих сред культивирования.
По многочисленным данным литературы известно, что эмбрионы крупного рогатого скота, которые культивируются in vitro от стадии 1-,2-или 4-клеток, редко развиваются дальше стадии 8-16 клеток. Существует блок в развитии 8-16 клеточных эмбрионов крупного рогатого скота. Блок является природным видовым фактором и обеспечивает важную информацию о чувствительности определенных эмбриональных стадий к условиям культивирования и их потребностям роста /78/ (рис 6, 7, 8). Развитие эмбрионального блока, очевидно, обусловлено генетическими особенностями яйцеклетки и определяется активностью материнских генов еще в овогенезе. Возможно, это связано с запасом и РНК, различной активностью ряда ферментов, структурой и особенностями функций митохондрий, и различиями в проницаемости плазматической мембраны, обеспечивающих развитие эмбриона до более поздних стадий. Остановка в развитии при культивировании in vitro может быть также обусловлена неадекватностью условий для ооцитов в культуральной среде /45/.
Смыслова Н.И, Сергеев Н.И и др./45/ провели культивирование оплодотворенных ооцитов на монослое кумулюсных клеток и гранулезы, эпителиальных клеток яйцевода и эндометрия матки. Все используемые монослои оказали положительное влияние на развитие зародышей. Наибольшее их число получено при культивировании ооцитов на клетках эпителия яйцевода и матки. На этих средах большинство зародышей было на стадии 2-16 бластомеров. Однако стадии морулы достигло наибольшее количество зародышей при культивировании ооцитов на монослое кумулюсных клеток /45/.
Установлено, что эмбрионы на ранних стадиях деления /менее чем 8 клеток/ культивируются значительно труднее, чем эмбрионы на более поздних стадиях. Ни одна из применяемых сред, добавок, культуральных систем и газовых атмосфер не в состоянии полностью отразить естественные условия организма.
При исследовании хромосом крупного рогатого скота, было установлено, что блок наступает на стадии развития, на которой нарушается контроль эмбриональных функций при передаче от материнского к эмбриональному геному. К этому времени удлиняется клеточный цикл и происходит синтез РНК. Кроме того, эмбрион крупного рогатого скота на 8 клеточной стадии перемещается из яйцевода в матку.
Транскрипция эмбриональных продуктов, которые необходимы для определенных этапов эмбрионального развития, происходит до бластуляции или компактирования. Таким образом, неспособность эмбриона достигнуть определенной критической стадии, могла быть отнесена к неблагоприятным условиям, которые влияли уже раньше.
Фаза активирования эмбрионального генома, такая, как и компактирование или бластуляция, в особенности кажется восприимчивой к неблагоприятным условиям, что отражается затем в развитии блока и даже в замедлении ритма деления.
Eyestone W.H. et.al./79/ установили, что 8 клеточный блок при промежуточном культивировании зигот крупного рогатого скота и ранних эмбрионов in vitro проявляется в лигированных яйцеводах кролика, овцы и телки может успешно проходить, независимо от гормонального статуса промежуточного реципиента.
Зиготы могут культивироваться до стадии бластоциста в гомологичных или гетерологичных яйцеводах, что является полностью не физиологичным и указывает на автономию раннего развития. Присутствие жидкости яйцевода или эпителиальных клеток яйцевода в культуральной системе, могут послужить примерной питательной средой регулируемого развития для оплодотворенных ооцитов. Монослой фибробласта крупного рогатого скота, как питательная среда (фидерный слой, представленный монослоем соматических клеток) требуется для развития морулы и бластоцисты /119/.
Савченкова И.П. /40/ тоже утверждает, о важности функции фидерного слоя в развитии предымплантационных эмбрионов кролика in vitro.
Существует мнение, что фидерный слой может продуцировать фактор или удалять токсические субстанции из культуральных сред, которые позволяют увеличить развитие бластоцист /108/
Фетальный маточный фибробласт в сокультуре с эмбрионом крупного рогатого скота является превосходной системой для развития морулы in vivo. При добавлении в среду культивирования трофобластического везикула, получено развитие эмбриона дальше 8 клеточного блока. При этом не нужен прямой контакт между эмбрионом и клетками трофобластического везикула, так как кондиционированная среда также улучшает развитие. Поэтому было решено, что вероятно от трофобластического везикула эмбриотрофные субстанции выделяются непосредственно в среду /25/.
Сергеев Н.И, Лебедев В.И и др. /42/ установили, что культивирование в среде МРМ с монослоем соматических клеток даст возможность получать до 16% ранних бластоцист хорошего качества, пригодных для пересадки и замораживания.
Эффективность поддержания развития эмбриона, посредством соматических клеток зависит от вида питательных клеток и стадии развития эмбриона. Хотя фибробласт и трофобластический везикул могут поддержать дробление оплодотворенного ооцита, тем не менее, только клетки яйцевода в состоянии снизить сильное падение жизнеспособности.
В экспериментах с эмбрионами крупного рогатого скота (стадия 5-8 клеток) Байбеков Ф.Р., Мальцева И.В 121 установили, что клетки яйцевода коров поддерживают их развитие до морулы и бластоцисты, через 8-клеточный блок. Однако не ясно, выделяют ли клетки яйцевода необходимые факторы в среду или удаляет вредные субстанции из среды, возможно, это происходит и в комбинации с выделением необходимых субстанций.
Культивирование зигот в среде Менезо+10% эстральной сыворотки коров заканчивается незначительным эмбриональным развитием. Сокультивирование с клетками может значительно увеличить формирование компактных морул и бластоцист это показывает, что клеточные линии из различных типов тканей, не всегда эпителиальных, поддерживают развитие зигот до стадии бластоцист также хорошо, как и в случае сокультивирования с эпителиальными клетками яйцевода коров. Хотя сокультивирование со сплошными клеточными линиями почечного эпителия коров (МДВК) и фибробластов плода мыши (СТО) были менее удачными, чем с остальными. Все же нужно отметить, что клетки других видов животных (мыши; СТО) способны поддерживать зиготы коров в их развитии до стадий компактной морулы и бластоцист. Компактные морулы и бластоцисты, получившиеся при различных способах сокультивирования, были морфологически нормальными, но число клеток и изучение трансформации могут быть предпосылкой для определения их нормальности и жизнеспособности /119/.
Введение в среду культивирования ооцитов 10% эстральной сыворотки обеспечивало высокий процент созревания и оплодотворения in vitro. Клетки гранулезы в составе сред культивирования способствуют частичному преодолению "блока" развития, что позволило получить нормальные эмбрионы на стадии морулы и бластоцисты, пригодные для пересадки.
В связи с тем, что сокультивирование с кумулюсными клетками и гранулезы, эпителиальных клеток яйцевода является средством преодоления "блока" в развитии in vitro эмбрионов млекопитающих, можно сказать, что их нужно использовать при созревании и оплодотворении ооцитов вне организма.
Созревание ооцитов в различных средах в присутствии сыворотки и гонадотропных гормонов
Для полного развития и последующего оплодотворения питательная среда, по мнению First и Parrish /83/ должна содержать сыворотку крови. Из литературных источников известно, что при культивировании ооцитов коров используется БСА, фетальная сыворотка теленка и эстральная сыворотка коров в охоте. По сравнению с БСА, по мнению Rutledge и др. /113/, фетальная сыворотка способствует кумулюсной экспансии, индуцированной ФСГ и улучшает жизнеспособность и окончание 1 мейотического деления. Концентрация сыворотки может колебаться от 2% до 20%. При сравнении фетальной и эстральной сыворотки, наблюдается более полная экспансия кумулюсных клеток в эстральной сыворотке, высокая степень оплодотворения и развития ранних эмбрионов достигается при добавлении эстральной сыворотки.
В наших экспериментах для созревания ооцитов использовали модифицированную среду Паркера с добавлением 20% фетальной и эстральной сыворотки в присутствии гонадотропных гормонов, таких как ФСГ в дозе 10 мкг/мл и ЛГ 5мкг/мл, так и без них (табл.2).
Результаты показывают, что на созревание ооцитов в большей степени влияет эстральная сыворотка, ФСГ и ЛГ (56%), чем фетальная сыворотка с гормонами на 26% ниже. Показатели культивирования в среде с эстральной сывороткой без гормональных добавок были ниже на 11,6% по сравнению с гормональными добавками. Поэтому при созревании ооцитов можно использовать эстральную сыворотку даже без добавки в среду созревания гонадотропных гормонов. Эстральная сыворотка коров в охоте является как добавка белка среде созревания. При этом наступает полная экспансия кумулюсных клеток, включая корону радиата, а кумулюсная экспансия сопровождает созревание цитоплазмы, что в свою очередь ведет к полному созреванию ооцита. Увеличить репродуктивные функции коров возможно посредством интенсивного использования огромного потенциала резерва ооцитов, заложенного в их яичниках. Для этого крайне необходимо разработать методы не только выделения из яичников и доведения яйцеклеток до зрелого состояния, но и их оплодотворения с целью культивирования эмбрионов вне организма. Сочетание в культуральной среде для ооцитов ряда биологически активных веществ может дать высокое обеспечение генетически полноценных яйцеклеток.
Так для оплодотворения ооцитов вне организма нами использовалась среда ТСМ-199 с добавлением 20% фетальной или эстральной сыворотки, а также гипофизарных гормонов ФСГ в дозе Юмкг/мл и ЛГ 5мкг/мл и без них. Оплодотворенными считались ооциты, у которых наблюдалось второе полярное тельце и наличие 2-х и более бластомеров.
Для полного развития и последующего оплодотворения также необходимо наличие сыворотки крови. И в этом случае эстральная сыворотка эффективнее, чем фетальная. Это объясняется тем, что в эстральной сыворотке находятся биологически активные вещества (ростовые факторов, аминокислоты) благоприятно влияющие на процесс оплодотворения (табл.3).
Из таблицы видно, что при добавлении в среду эстральной сыворотки получено 40% оплодотворенных ооцитов, а при добавлении ФСГ и ЛГ на 10% увеличивается выход оплодотворенных ооцитов по сравнению с фетальной сывороткой, ФСГ и ЛГ всего 33%. Эти различия объясняются тем, что эстральная сыворотка содержит стероидные и гонадотропные гормоны.
Так же изучая влияние сред с минимальной концентрацией сыворотки крови на созревание ооцитов, снижали концентрацию эстральной сыворотки коров до 5% и добавляли различные концентрации гонадотропинов: ФСГ-20мкл, 5мкл/мл среды, глутамина-150мкл (табл.4).
Число созревших ооцитов при добавлении в среду 10% эстральной сыворотки составил 66,0%, а 5%-55,0%, добавление к этой среде 20 мкл ФСГ повышало норму созревания на 4,7%, а 5 мкл ФСГ и 150 мкл глутамина не влияли на созревание ооцитов.
Стимулирующий эффект сыворотки может быть объяснен действием содержащихся в ней ростовых факторов и аминокислот.
Оплодотворяемость в среде с 10% эстральной сывороткой была высокой (71,9%). При уменьшении концентрации эстральной сыворотки до 5% выход оплодотворенных ооцитов составил 30,8%, а при добавлении 20 мкл ФСГ повышало оплодотворяемость на 27,3%. Снюкение концентрации ФСГ до 5 мкг и включение 150 мкл глутамина не влияло на этот показатель, однако выход зародышей был на 14,8% больше (табл. 5).
Из оыта следует, что добавление в среду созревания 10% астральной сыворотки обеспечивает высокий процент (71,9%) созревания и оплодотворения ооцитов in vitro.
Культивирование и сокультивирование предымплантационных эмбрионов на монослоях соматических клеток
Часто при культивировании предымплантационных эмбрионов многие исследователи сталкиваются с клеточным блоком, когда развитие эмбриона останавливается на стадии 8-16 клеток. Стадия блокировки связаны по времени с основным началом транскрипции эмбрионного генома; с главными качественными изменениями в белковом синтезе; и с появлением активного нуклеуса.
Для того, чтобы преодолеть этот блок, используется ряд различных методов. В некоторых случаях используют промежуточных реципиентов, таких как кролик, помещают эмбрион в яйцеводы и извлекают его улсе на более поздних стадиях развития, т.е. после прохождения клеточного блока.
В настоящее время для преодоления блока используется ряд соматических клеток, в частности клетки кумулюса, эпителиальные клетки яйцевода, гранулезные клетки. Из этих клеток получают монослой, который используется для культивирования предымплантационных эмбрионов.
Мы же поставили перед собой задачу изучить влияние монослоя соматических клеток на преодоление клеточного блока. Ооциты культивировали в среде МРМ с добавлением 20% эстральной сыворотки, оплодотворение проводили в среда FERTALP, а дальнейшее культивирование оплодотворенных ооцитов проводили в среде Паркера. Полученные эмбрионы 6-8 бластомеров переносили на монослой соматических клеток. Первая группа не содержала соматических клеток и служила контролем, вторая группа ооцитов сокультивировалась на монослое клеток кумулюса, третья на монослое эпителиальных клеток яйцевода и четвертая на монослое клеток гранулезы (табл. 8).
Исследования показали, что успешное преодоление 8-16 клеточного эмбрионального "блока" достигается при сокультивировании на монослое гранулезных клеток (34,8%), что на 13% выше контроля. При сокультивировании на монослоях кумулюсных клеток и эпителиальных клеток яйцевода, различия были незначительными (25,6-27,2%).
Роль монослоя в культуральных системах не совсем ясна, однако, после совместного культивирования оплодотворенных ооцитов с монослоями соматических клеток повышается степень дробления и развития ранних эмбрионов.
Так же, при введении в среду созревания клеток гранулезы наблюдалось повышение числа созревших ооцитов на 13,3% (80% против 66,7%) по сравнению с контролем. Кроме того, 20,8% ооцитов опытной группы оплодотворились, в то время в контроле оплодотворенные ооциты отсутствовали (табл. 9).
Период блокирования развития эмбрионов совпадает по времени с их потребностью в новых элементах питания. Поэтому усилия исследователей направлены на поиск различных природных и синтетических ростовых факторов в качестве добавок в культуральные среды. Удачной альтернативой этому является использование не только клеточных сокультур, но и их кондиционных сред, поскольку установлено, что на развитие эмбрионов влияет не фактор контакта с клетками, а трофический фактор, то есть секреция целого спектра питательных веществ.
Позднякова Т.Э /37/ установила, что культивирование в среде, кондиционированной клетками гранулезы, обеспечивает более оптимальные условия для созревания, что подтверждается не только высоким выходом ооцитов 72,7%, но и низким процентом (6% против 16,4%) яйцеклеток с дегенерацией хромосом.
Также установлено, что кондиционирование ооцит-кумулюсными клетками среды обеспечивают нормальное развитие зародышей, если для культивирования используется аутогенная среда, то есть когда оплодотворенные ооциты помещают в среду, в которой они созревали (табл. 10).
Несмотря на высокую степень оплодотворяемости в контрольной группе, дробление зародышей наблюдалось лишь в кондиционных средах (19,2% и 14,5%), причем стадии ранней морулы достигало большинство зародышей (80,0 и 75,0%) от числа дробящихся. Но в гетерогенной кондиционной среде оплодотворенные зародыши развивались только до стадии ранней морулы, дальше развитие прекратилось, а в аутогенной среде зародыши развились до бластоцист 20%.