Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 12
2.1. Роль медиаторов в функциях нервной системы беспозвоночных 12
2.1.1. Медиаторы нервной системы 12
2.1.2. Дофамин и методы исследования его функций 14
2.1.2.1. Дофаминергическая нейропередача. Рецепторы 14
2.1.2.2. Роль дофаминергической системы в регуляции поведения 21
2.1.2.3. 6-ОНДА - нейротоксический аналог дофамина 24
2.1.3. Медиаторзависимое поведение животных 27
2.2. Поведение виноградной улитки 30
2.2.1 Оборонительное поведение. Локомоция 30
2.2.2. Долговременная сенситизация как модель стрессового воздействия 34
2.2.3. Исследование роли дофамина и серотонина в формировании ДС... 36
2.3. Нейролептики и их психофизиологическое действие 39
2.3.1. Нейролептики 39
2.3.2. Фармакологическая модуляция дофаминергической нейропередачи. Галоперидол 40
2.3.3. Медиатористощающее действие нейролептиков 43
3. Объект и методы исследования 47
3.1. Объект исследования 47
3.2. Дуга оборонительного рефлекса 48
3.3. Тестирование поведенческих реакций 50
3.4. Выработка долговременной сенситизации 51
3.5. Растворы, использованные в работе 52
3.6. Экспериментальные группы животных 53
3.7. Препарат 56
3.8. Регистрация электрических характеристик нейронов 56
3.8.1. Микроэлектроды 56
3.8.2. Регистрирующая установка 57
3.8.3. Электрические характеристики нейронов 58
4. Результаты иследований и обсуждение 60
4.1. Сравнительный анализ воздействия галоперидола и гидроксидофамина на поведение моллюсков 60
4.1.1. Анализ поведения моллюсков при воздействии HAL 60
4.1.2. Анализ поведения моллюсков при воздействии 6-OHDA 65
4.1.3. Анализ поведения моллюсков при выработке ДС 68
4.1.4. Анализ поведения моллюсков при выработке ДС после инъекций НАЬиб-OHDA 72
4.2. Исследование эффектов хронического введения галоперидола на электрические характеристики командных нейронов виноградной улитки 74
4.2.1. Влияние нейролептика галоперидола на электрические характеристики командных нейронов 74
4.2.2. Анализ эффектов блокады активного насоса на электрические характеристики командных нейронов интактных улиток и у улиток после хронического введения галоперидола 78
4.3. Исследование длительности сохранения эффектов хронического введения галоперидола 83
4.3.1. Исследование длительности сохранения эффектов хронического введения галоперидола на поведенческом уровне 83
4.3.2. Исследование длительности сохранения эффектов хронического введения галоперидола на электрические характеристики командных нейронов виноградной улитки 85
4.4. Сравнительное исследование влияния предшественника дофамина L- DOPA на поведение и выработку условного оборонительногорефлекса у интактных и б-ОНОА-инъецированных моллюсков 87
4.4.1. Сравнительный анализ влияния предшественника дофамина L-DOPA на локомоцию и оборонительное поведение интактных и 6-OHDA-инъецированных моллюсков 88
4.4.2. Сравнительное электрофизиологическое исследование влияния предшественника дофамина L-DOPA на интактных и 6-OHDA-инъецированных моллюсков 93
4.4.3. Сравнительный анализ влияния предшественника дофамина L-DOPA на выработку условного оборонительного рефлекса у интактных и 6-OHDA-инъецированных моллюсков 98
4.5. Анализ влияния нейролептика галоперидола на выработку условного оборонительного рефлекса у интактных моллюсков 101
5. Заключение 104
6. Выводы 114
7. Список литературы 116
- Дофаминергическая нейропередача. Рецепторы
- Оборонительное поведение. Локомоция
- Анализ поведения моллюсков при воздействии HAL
- Анализ поведения моллюсков при выработке ДС
Введение к работе
Актуальность исследования. Одной из форм пластичности является долговременная сенситизация (ДС) оборонительных реакций животного в ответ на экстрастимулы, такие как электрошок, сильные химические воздействия. Это состояние характеризуется резким усилением оборонительных реакций, сопровождающихся повышением возбудимости основных элементов нейронной сети - сенсорных, командных, а также моторных нейронов (Castellucci V.F. et al., 1986; Walters E.T., 1987; Гайнутдинов Х.Л., Береговой Н.А., 1994; Никитин В.П. и др., 1995; Geary L.J. et al., 1998). Подобные изменения биоэлектрической активности приводят к возникновению в нервной системе генератора патологически усиленного возбуждения (Крыжановский Г.Н. и др., 1991; Гайнутдинов Х.Л., Штарк М.Б., 1995). ДС, являясь видонеспецифическим феноменом, т.е. присущим животным разного уровня организации, позволяет успешно исследовать мембранные механизмы формирования устойчивых очагов возбуждения в нервной системе животного при изменении поведения (Кэндел Э., 1980; Walters Е.Т., Ambron R.T., 1995; Гайнутдинов Х.Л. и др., 2002; Wainwright M.L. et al., 2002). Таким образом, долговременная сенситизация может быть использована как модель, имитирующая некоторые черты нервно-психических расстройств, которая позволяет экспериментально проследить какие компоненты поведения и каким образом меняются при воздействии различных фармакологических веществ.
Известен ряд лекарственных препаратов - нейролептиков (НЛ), оказывающих успокаивающее действие на все сферы психической деятельности. К таким психоактивным соединениям принадлежат галоперидол (HAL) и другие препараты (Раевский К.С., 1976; Гайнетдинов P.P. и др., 1992; Sakharov D.A. et al., 1994). Нейролептики, избирательно воздействующие на медиаторные системы мозга, регулируют психические функции и эмоциональное состояние. Они обладают относительно невысокой токсичностью, но, тем не менее, могут вызывать и нежелательные эффекты, они понижают скорость психических реакций и двигательную активность, а некоторые расслабляют скелетные мышцы (Машковский М.Д., 2002). Изучение механизма действия нейролептиков на простых модельных системах представляется важным для разработки тестовой системы и синтеза новых веществ.
Наиболее популярная, так называемая дофаминовая, гипотеза связывает терапевтический эффект нейролептиков с тем, что они блокируют дофаминовые рецепторы, снижая тем самым патологически повышенный тонус дофаминергической системы мозга (Раевский К.С. др., 1996; Ершов П.В. и др., 2001). Кроме того, в ходе исследований был обнаружен ранее неизвестный способ действия нейролептиков, в данном случае галоперидола, - способность снижать содержание дофамина в нервной ткани (Baker M.W. et al., 1995; Sakharov D.A. et al., 1996).
На сегодняшний день достоверно установлено, что для селективного истощения дофаминовых элементов в нервной системе особенно благоприятным методом является применение 6-гидроксидофамина (Lent СМ., Santamarina L., 1984; Reader Т.A., Gauthier Р., 1984; Kemenes G. et al., 1990). Его открытие в 60-е годы было важным в изучении функций мозга в контроле за поведением. Известно, что 6-OHDA производит постепенное избирательное разрушение дофаминсодержащих терминалей в стриатуме и других участках мозга, и оказывает однонаправленное снижающее действие на ориентировочно-исследовательское и приспособительное поведение, а также тревожно-фобический статус животных (Willis G. L., SleemanM. 1987).
Поэтому представляется актуальным исследование механизмов действия галоперидола, как вещества, оказывающего мощное воздействие на организм и применяющегося в современной медицинской практике.
Цель и основные задачи исследования. Целью работы явилось исследование эффектов галоперидола на поведение, включая формирование долговременной сенситизации у виноградной улитки и ассоциативное обучение, и механизмов его действия на уровне нейрональной мембраны. В соответствии с этой целыо были поставлены следующие задачи: изучить влияние HAL и 6-OHDA на локомоцию, оборонительную реакцию закрытия пневмостома и на формирование долговременной сенситизации у виноградной улитки; исследовать влияние хронического (ежедневное в течение 7 дней) введения HAL на электрические характеристики командных нейронов виноградной улитки; с применением блокатора активного насоса оуабаина исследовать роль активного насоса в изменении электрических характеристик командных нейронов улиток после хронического введения HAL;
4) исследовать длительность сохранения эффектов хронического введения HAL; изучить влияние предшественника дофамина L-диоксифенилаланина (L-DOPA) и 6-OHDA на локомоцию, оборонительную реакцию закрытия пневмостома и выработку условного оборонительного рефлекса у виноградной улитки; исследовать влияние хронического (ежедневное в течение 7 дней) введения HAL на выработку условного оборонительного рефлекса у виноградной улитки.
Положения, выносимые на защиту:
1. Хроническое (ежедневное в течение 7 дней) введение нейролептика HAL вызывает гиперполяризационное смещение мембранного потенциала командных нейронов у виноградной улитки, которое сохраняется в течение нескольких дней.
2. Одинаковое влияние хронического введения галоперидола и введения 6-OHDA (снижение скорости локомоции, блокада формирования долговременной сенситизации), а также их одинаковые эффекты на фоне долговременной сенситизации подтверждают гипотезу о дофаминистощающем механизме действия галоперидола.
3. Введение 6-OHDA и хроническое (ежедневное в течение 7 дней) введение нейролептика HAL не влияют на выработку условного рефлекса у виноградной улитки.
Научная новизна. Впервые найден новый механизм действия галоперидола - гиперполяризационное смещение мембранного потенциала командных нейронов, которое сохранятся в течение нескольких дней. Показано, что галоперидол оказывает подавляющее действие на двигательную активность виноградной улитки, вызывая снижение скорости локомоции, и не влияет на оборонительное поведение. Такой же эффект наблюдается при инъекции 6-гидроксидофамина, истощающего дофамин в синаптических окончаниях. Полученные результаты свидетельствуют о дофаминистощающем механизме действия галоперидола. Такой же механизм действия галоперидола вытекает из впервые экспериментально показанного сходства эффектов 6-гидроксидофамина и галоперидола на фоне выработанной долговременной сенситизации и блокады формирования долговременной сенситизации этими агентами. Показано, что хроническое введение L-DOPA угнетает двигательную активность и усиливает оборонительное поведение интактных животных, а также вызывает снижение мембранного потенциала командных нейронов и уменьшение порогового потенциала. Впервые найдено, что применение данного препарата на фоне истощенного дофамина не вызывает достоверного изменения электрических характеристик командных нейронов. Впервые показано, что 6-гидроксидофамин и галоперидол не влияют на выработку условного рефлекса у улитки.
Научно-практическая ценность. Полученные результаты дают дополнительные доказательства в пользу гипотезы дофаминистощающего механизма действия галоперидола. Кроме того, найден новый механизм действия галоперидола, который заключается в гиперполяризации определенных элементов нейронной сети - в данном случае командных нейронов. Данные результаты могут помочь в выборе стратегии применения веществ при нарушениях поведения и деятельности нервной системы. Найдено, что L-DOPA угнетает двигательную активность животных и тормозит выработку условного рефлекса. В тот же время 6-OHDA и HAL не влияют на выработку условного рефлекса у улитки. Полученные результаты демонстрируют, что избыток ДА в организме тормозит обучение, а его недостаток не влияет на выработку условного рефлекса. Полученные результаты используются при чтении курсов лекций в КГУ и ТГГПУ.
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы доложены на: итоговых конфер. Казанского научного центра РАН (Казань, 2001-2003, 2005, 2006 гг);
7, 8 Всеросс. школах молодых ученых «Актуальные проблемы нейробиологии» (Казань, 2000, 2001 гг); XVIII съезде Физиол. общества им. И.П.Павлова, (Казань, 2001 г);
6-ой, 7-ой и 9-ой Пущинской школы-конференции молодых ученых (Пущино, 2002, 2003, 2005 гг); VI и VII Всеросс. симпоз."Растущий организм: адаптация к физической и умственной нагрузке" (Казань, 2002 г и Набережные Челны, 2004 г.);
IV съезд физиологов Сибири (Новосибирск, 2002 г.); Conference of the International Society for Invertebrate Neurobiology (Kaliningrad, 2003 r);
International symposium "Neuron Differentiation and Plasticity - Regulation by Intercellular Signals" (Moscow, Russia 2003 г.);
Всеросс. конфер. «Нейрогуморальные механизмы регуляции сердца» (Казань, 2004 г.);
Всеросс. конфер. «Нейрохимия: Фундаментальные и прикладные аспекты» (Москва, 2005 г);
Междунар. симпозиум «Mechanisms of adaptive behavior» (Санкт-Петербург, 2005 г.).
Реализация результатов исследования. Материалы исследования отражены в 5 статьях, опубликованных в рецензируемых журналах, и в 16 тезисах докладов.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа объемом 140 страниц состоит из введения, обзора литературы, описания объекта и методов исследования, главы результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов и указателя цитируемой литературы. Список цитируемой литературы включает 237 источника, из них 124 -иностранных автора. Диссертация иллюстрирована 29 рисунками и содержит 2 таблицы.
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Дофаминергическая нейропередача. Рецепторы
Группа молекул, которая действует как медиаторы - это катехоламины. Основными катехоламинами являются норадреналин, адреналин, дофамин (ДА). Катехоламины осуществляют синаптическую передачу нервного импульса в центральной и вегетативной нервных системах, или, иными словами, являются нейромедиаторами. Помимо этого катехоламины, в первую очередь адреналин, выполняют гормональные функции широкого спектра действия (Ткаченко А.А., 1997). Широта биологических функций катехоламиновых структур наряду с неспецифичностью и уникальной ролью этих молекул в гомеостатическом балансе организма чрезвычайно затрудняют исследование роли нарушений ключевых этапов метаболизма катехоламинов в патогенезе психических расстройств.
Принципиальные пути метаболизма катехоламинов в настоящее время достаточно хорошо изучены. Системы утилизации активных нейромедиаторных и гормональных молекул имеют огромное значение для нормальной жизнедеятельности организма. Быстрое устранение действующих медиаторных единиц не менее важно, чем механизмы оперативного выброса нейромедиатров в ответ на потенциал действия. Хорошо известно, что основными процессами инактивирования катехоламиновых медиаторов в синаптической щели являются энергозависимый специфический обратный захват норадреналина и ДА пресинаптическим окончанием и метилирование медиаторных молекул, катализируемое катехол-О-метилтрансферазой. Моноаминоксидаза является важнейшим ферментом катаболизма катехоламинов (Ткаченко А. А., 1997).
Дофамин является медиатором во многих типах, включая хордовых, тогда как норадреналин и адреналин в основном принадлежат позвоночным. Причина этого не ясна, однако, во многих типах серотонин замещает норадреналин, как периферический трансмиттер. Другие моноамины, которые действуют как нейротрансмиттерные молекулы, - это гистамин, октопамин и серотонин (5 гидрокситриптамин, 5-НТ). Из них 5 15
НТ, как трансмиттер, играет ключевую роль, как в периферической, так и в центральной нервной системе многих типов (Науменко Е.В., Попова Е.К., 1975; Walker R.G. et al., 1996; Семенова Т.П., 1997). Этот амин также может действовать как гормон. Данные, основанные на последовательной гомологии, предполагают, что мускариновые, дофаминергические, а-адренергические и р-адренергические рецепторы могут происходить от 5-НТ-1 рецептора после дивергенции предкового серотонинового рецептора на 5-НТ-1, 5-НТ-2 и 5-НТ-6 подтипы рецепторов (Audesirk G., 1975; 1985). Эти соединения могут действовать строго, как трансмиттеры, диффундируя на 20 - 50 нм, чтобы произвести свой эффект постсинаптически. Альтернативно, они могут действовать, как модуляторы, модифицируя постсинаптическую функцию, или активизируя пресинаптические рецепторы, и, таким образом, модифицируя высвобождение трансмиттера. Кроме того, они могут попадать внутрь кровеносного потока и действовать на месте, удаленном от их места высвобождения, действуя как нейрогормон.
Известно, что дофамин является основным катехоламиновым медиатором в мозге у моллюсков (Сахаров Д.А., 1974; Gospe S.M., 1983). Разными авторами показано, что экзогенный ДА вызывает на нейронах моллюсков возбуждающие (деполяризующие) либо тормозные (гиперполяризующие) ответы (Солнцева Е.И., Борисова О.В., 1983). Медиаторная роль других катехоламинов не доказана, несмотря на то, что в клетках нервной системы были обнаружены норадреналин и адреналин. В мозге моллюсков обнаружены и специфические норадреналиновые рецепторы, однако, никому не удавалось найти норадреналин и адреналин в пресинаптических окончаниях этих животных (Сологуб М.И. и др., 1983). Из исследованных отделов ЦНС моллюска наиболее богаты биогенными аминами педальные ганглии и педальные доли церебральных ганглиев. Нейроны этого химического типа встречаются также в буккальных ганглиях и в ганглиях нижней пары щупалец, а также в ганглиях висцеральной дуги (Kerkut G.A. et al. 1967; Сахаров Д.А., 1974). Относительно крупные дофаминергические нейроны имеются только в плевральной доле церебральных ганглиев, они составляют очень небольшую часть нейронов, покрывающих дорзальную поверхность церебральных ганглиев. Гораздо более многочисленны клетки этого типа на вентральной стороне, они составляют несколько компактных групп. Одна из таких групп лежит на границе между плевральной долей и процеребрумом; отходящие от нее волокна проходят по дорзальной поверхности процеребрума и входят в состав тентакулярного нерва. В нерве волокна собраны в пучок, который, войдя в тентакулярный ганглий, дает зоны синаптического нейропиля. В дистальной части тентакулярного ганглия пучок распадается, участки нейропиля отмечаются во всех пальчатых выростах ганглия. Другие группы нейронов лежат у границы педальной доли с соседними долями церебрального ганглия - с плевральной и коммиссуральной. Крупное скопление клеток имеется в вентральной коре ганглия, где эти нейроны образуют свиту гигантского вентрального нейрона (Сахаров Д. А., 1974). Распределение дофаминсодержащих нейронов виноградной улитки подробно описано в работе Иерусалимского В.Н. и соавторов (1997). Дофаминсодержащие нейроны найдены в буккальных, церебральных и педальных ганглиях. Дофаминергические нейроны в основном мелкие, немногочисленные. Идентификации поддаются только две гигантские педальные клетки и церебральные клетки из группы, расположенной около места выхода губных нервов. На моллюсках было показано, что рецепторы дофаминергического нейрона распределены неравномерно, наиболее сильно располагаясь на аксоном холмике, аксоне и нейрональных терминалях (Green К.A. et al., 1996).
Дофаминовые системы головного мозга позвоночных животных организованы в более компактные системы, выполняющие четко очерченные функции. Дофаминергические нейроны локализованы в основном в областях промежуточного и среднего мозга. Дофаминовые нейроны среднего мозга образуют протяженную и довольно гомогенную клеточную группу в области вентральной покрышки. Обычно выделяют дофаминовые нейроны черной субстанции и нейроны, локализованные вне черной субстанции, хотя между ними не существует четко очерченной границы (Раевский К.С. и др., 1996). В мозге у позвоночных животных гипоталамус и черная субстанция являются основными источниками продукции дофамина в головном мозгу. У взрослых млекопитающих ДА, синтезирующийся в гипоталамусе, в основном в зонах инсерты, перивентрикулярного и аркуатного ядер, вовлечен в нейроэндокринную регуляцию (Ugrumov M.V., 1994; 1997). В сером веществе спинного мозга дофаминсодержащие нейроны локализованы в дорсальных рогах, интеремедиальная зона грудных сегментов одинаково богата норадреналином и дофамином. Много дофаминовых терминалей находиться внутри области норадренергической иннервации (Westlund K.N. et. al., 1983).
В настоящее время известно пять основных подтипов рецепторов дофамина, среди которых на основе различий в молекулярном строении принято выделять два основных рецепторных семейства Д1-подобных, состоящее из Д1 и Д5 подтипов рецепторов, и семейство Д2-подобных, включающее Д2, ДЗ и Д4 подтипы рецепторов (Jarvie K.R., Caron M.G., 1993). Важно отметить, что только Д2 и ДЗ подтипы рецепторов локализованы пресинаптически и могут рассматриваться как ауторецепторы, участвующие, по механизму обратной связи, в пресинаптической ауторегуляции ДА-ергической нейропередачи, оказывая влияние на импульсную активность ДА-ергических нейронов, синтез, высвобождение и метаболизм ДА (Carlsson А., 1991; Gingrich J.A., Caron M.G., 1993).
Оборонительное поведение. Локомоция
Аплизия и виноградная улитка к настоящему времени являются наиболее распространенными объектами для изучения механизмов пластичности нервной системы (Kandel E.R., Schwartz J.H., 1982; Сахаров Д.А., 1992; Krasne V.F., Glanzman D.L., 1995). Это вызвано тем, что, во-первых, они способны к сложным поведенческим модификациям, и во-вторых, простая нервная система этих моллюсков позволяет исследовать нейронные механизмы привыкания, сенситизации, ассоциативного обучения (Сахаров Д.А., 1974; Кэндел Э., 1980; Соколов Е.Н., 1981; Балабан П.М., Захаров И.С, 1992). Так, центральная нервная система (ЦНС) виноградной улитки сконцентрирована в передней части тела (голове) и кольцом охватывает пищевод. ЦНС состоит из 11 ганглиев, 9 из которых образуют окологлоточное кольцо (Schmalz Е., 1914). Головные ганглии иннервируют голову и ногу и управляют главными соматическими функциями - питанием, спариванием и локомоцией (Сахаров Д.А., 1974; KilliasR., 1985).
У виноградных улиток одной из наиболее удобных и хорошо изученных форм поведения является оборонительное поведение (Захаров И.С, 1992). Виноградная улитка, не имея средства активной защиты от врагов, почти на любое раздражение отвечает комплексом пассивно-оборонительных реакций. В этот комплекс входят реакции втягивания щупалец, закрытия отверстия легочной полости и генерализованная реакция животного с втягиванием всего тела в раковину. Поэтому обычно для выработки оборонительного поведения у виноградной улитки используется рефлекс закрытия легочной полости, так как он удобен для объективной регистрации. Оборонительные реакции виноградной улитки можно вызвать нанесением тактильного, светового, теплового и вестибулярного стимулов (Максимова О.А., Балабан П.М., 1983).
При оборонительных реакциях избегания выявлено три уровня реагирования (Балабан П.М., Захаров И.С, 1992). В ответ на слабое тактильное раздражение поверхности кожи наблюдается сокращение в месте нанесения стимула, опосредуемое только периферическими нервными элементами. Увеличение интенсивности стимула приводит к появлению, кроме сокращения в месте стимула, реакций втягивания щупалец и передней части тела, закрытия дыхательного отверстия. Дальнейшее повышение интенсивности тактильной стимуляции, а также болевое раздражение вызывают генерализованную оборонительную реакцию, выражающуюся в быстром втягивании всего тела в раковину. В ответ на стимулы такой интенсивности во многих центральных нейронах регистрируется сильная тоническая активация. Около 90% нейронов в той или иной форме отвечают на адекватно (Максимова О.А., Балабан П.М., 1983; Балабан П.М. и др., 1992).
Локомоция виноградной улитки осуществляется благодаря мышечным сокращениям, возникающим в каудальнои части подошвы в виде поперечных складок (мышечных волн). Мышечные волны, темные поперечные полосы, разделенные светлыми промежутками, движутся по подошве вперед, и каждая волна смещает подошву на определенную величину, равную своей длине, - на длину шага. Во время локомоции на подошве насчитывается одновременно несколько мышечных волн, они не захватывают лишь самый край подошвы (Павлова Г.А., 1996; Цыганов В.В.,2001).
Скорость локомоции виноградной улитки может определяться как количеством волн, пересекающих каждую точку подошвы в единицу времени, - частотой шагов, так и длиной шагов. Во время непрерывной локомоции скорость перемещения улитки коррелирует с длиной подошвы, которая может значительно изменяться (Павлова Г.А., 1994). Частота шагов при изменении длины подошвы не меняется. Следовательно, при изменении длины подошвы скорость локомоции моллюска определяется длиной шагов. Чем длиннее подошва, тем длиннее шаги и выше скорость локомоции (Павлова Г.А., 1996).
Брюхоногий моллюск Lymnaea stagnalis может перемещаться в воде двумя способами. При мышечной локомоции моллюск периодически вытягивает переднюю часть ноги и подтягивает заднюю, движения ноги всегда сопровождаются ритмическими смещениями раковины в ростро-каудальном направлении (Kaiser Р., 1960). Во время скользящей локомоции прудовик ползет, не меняя форму ноги, длительное время (Kaiser P., 1960; Winlow W., Haydon P.G.A., 1986). Участие мышц в первом способе перемещения бесспорно, во втором отрицается, так как не наблюдается ни сокращения ноги, ни мышечных волн, бегущих по поверхности подошвы время (Kaiser Р., 1960; Winlow W., Haydon P.G.A., 1986). Считается, что скользящая локомоция осуществляется за счет работы многочисленных ресничек, расположенных на подошве ноги прудовика (Kaiser Р., 1960). С помощью ресничек перемещаются многие водные брюхоногие моллюски.
Впервые исследованы две формы мышечной локомоции прудовика и установлена их нейротрансмиттерная зависимость (Цыганов В.В., 2001; Воронцов Д.Д. и др., 2003; Цыганов В.В. и др., 2004). Показано, что каждая из них представляет самостоятельную поведенческую программу: одна применяется животным при движении по твердому субстрату (как вводной среде, так и на суше), а другая при движении по поверхности воды, при этом первая активируется 5-НТР (5НТ-зависимая), вторая L-DOPA (ДА-зависимая). Мышечная локомоция имеет четко выраженный циклический характер; каждый локомоторный цикл включает координированные сокращения и расслабления ноги и тела, а также коллумелярной мускулатуры (подтягивания раковины). Описаны сходства и различия между двумя локомоторными программами.
Впервые доказано, что центральные генераторы мышечной локомоции, индуцированной как 5-НТР (5-НТ), так и L-DOPA (ДА), локализованы в педальных ганглиях и являются парными (продублированы в каждом ганглии); координации левого и правого генераторов осуществляется через педальные комиссуры (Цыганов В.В., 2001; Цыганов В.В. и др., 2004). Также впервые показано, что два симметричных гигантских педальных интернейрона - дофаминергический RPeDl и серотонинергический LPeDl - интегрированы в оба центральных локомоторных ритма, и при мышечной локомоции демонстрируют противофазную координированную активность. Обе разновидности мышечной локомоции не являются результатом какого-то приспособления (механического, рецепторного или др.) ресничного способа движения к новым условиям, а представляют собой самостоятельные медиаторзависимые программы. Локомоция "наземного" активируется 5 33
НТР (5-НТ-зависимая) и предназначена для движения по твердому субстрату, тогда как другая разновидность мышечной локомоции -"акватическая поверхностная" - активируется L-DOPA (ДА-зависимая) и пригодна только для движения по поверхностной пленке воды в перевернутом состоянии (ногой вверх) (Цыганов В.В., 2001).
При скользящей локомоции форма подошвы прудовика может значительно меняться. Наибольшим флуктуациям подвержена длина подошвы. Параллельно с длиной увеличивается площадь подошвы. Ширина же подошвы (как ростральной части, так и средней) меняется пропорционально и не зависит от длины. Скорость локомоции связана прямой зависимостью с длиной подошвы и достигает 2,0-2,4 мм/с у летних моллюсков (прудовиков). Скорость локомоции зависит от уровня возбуждения определенных педальных нейронов, управляющих частотой ресничных биений (Audesirk G., 1979; Делягина Т.Г., 1988). Можно предположить, что нервная система координирует частоту ресничных биений с длиной подошвы. Также можно предположить, что реснички прудовика обладают автоматией, а по мере сокращения ноги на подошве образуются эпителиальные складки.
Анализ поведения моллюсков при воздействии HAL
Нейролептики, среди них и галоперидол, составляют обширную группу так называемых психотропных средств, действующих преимущественно на психические функции и эмоциональное состояние человека, устраняют чувство страха, беспокойства, тревоги, напряжения и применяются при лечении различных невротических состояний, преимущественно при тяжелых нарушениях деятельности нервной системы (Машковский М.Д. и др., 1981; Раевский К.С., 1992). Нейролептики с успехом применяются в психиатрической клинике, но природа их эффективности до сих пор полностью не раскрыта.
Как известно (Машковский М.Д., 1967; 2002), галоперидол применяют в качестве лекарственного средства в суточной дозе 15-20 мг, максимальные дозы при приеме внутрь и внутримышечном введении для взрослого человека могут достигать 100 мг в сутки, что равно примерно дозам от 0,2 до 1,4 мг/кг веса. Поэтому нами была проведена предварительная серия экспериментов по анализу концентрационной зависимости эффектов хронического введения галоперидола. Было показано, что при хроническом введении HAL в течение 7 дней в дозе от 2 мг/кг веса и выше часть улиток погибает. В то же время галоперидол в дозе 0,1 мг/кг веса долговременных эффектов не оказывает. Поэтому на основании проведенных предварительно экспериментов была выбрана доза 1,0 мг/кг веса для проведения последующих экспериментов с хроническим введением HAL.
Сразу после введения HAL в течение 2-3 минут улитки проявляют отличительные изменения в поведении по сравнению с контролем. Наблюдается значительная хаотичная двигательная активность. Примерно через 5 минут краткосрочные эффекты исчезают, в том числе и раскоординированность поведения животных. Данное поведение очень схоже с поведением улиток после инъекции 6-OHDA, а также при воздействии стандартных антагонистов дофаминовых рецепторов эргометрина и эрготамина (Sakharov D.A., Salanki J., 1982).
Известно (Машковский, 1967; 2002), что максимальная концентрация галоперидола в плазме крови достигается через 3-6 часов, период полувыведения составляет в среднем 24 часа (12-37часов). При исследовании скорости локомоции при воздействии HAL в дозе 1,0 мг/кг веса через 2-3 часа после введения нейролептика наблюдается снижение скорости локомоции примерно в 2,5 раза, в то же время через сутки при однократной инъекции это снижение исчезает (рис. 6). Этот результат, вероятно, отражает блокаду дофаминовых рецепторов галоперидолом. При хроническом введении HAL в течение 7 дней наблюдается постепенное снижение скорости локомоции на протяжении всего периода инъекций. На 8-й день, т.е. через сутки после последней инъекции, скорость локомоции снизилась с 3,4+0,3 до 1,6+0,2 см/мин - в 2 раза по сравнению с первоначальной (рис. 7А). При исследовании зависимости скорости от длины ноги (как известно из работ Г.А. Павловой (1994), чем длиннее подошва, тем выше скорость локомоции) найдено, что при воздействии HAL сохранялась линейная зависимость (рис. 12Б). Показатели оборонительных реакций в начале и конце эксперимента значительно не отличались (рис. 7Б). Т.о., галоперидол действует подавляюще на двигательную активность животных, вызывая снижение скорости локомоции, и не оказывает влияния на оборонительное поведение. Влияние галоперидола на скорость локомоции виноградной улитки до начала инъекций (К) (п=10), через 2 часа (п=10) и через 24 часа (п=10) после однократной инъекции. - достоверные отличия от значений К, р 0,01 Нами была предпринята попытка исследования роли дофаминергической системы в локомоции виноградной улитки и взаимоотношений между системами, обеспечивающими локомоцию и оборонительное поведение. Многие авторы предпринимали исследования по распределению и функциям медиаторов в нервных элементах различных модельных объектов, в том числе моллюсков (Audesirk G., 1979; Sakharov D.A., Salanki J., 1982; Pavlova G.A., 2001). Проведенные эксперименты демонстрируют, что, если серотонин обычно является возбуждающим медиатором в поведении и локомоторных движениях, то дофамин участвует в тормозном контроле этих форм поведения у моллюсков (Sakharov D.A., Salanki J., 1982; Сахаров Д.А., Каботянский Е.А., 1986; Иерусалимский В.Н. и др. 1997; Pavlova G.A., 2001). V,CM/MIIH Динамика изменения скорости локомоции (А) и реакции пневмостома (Б) у виноградных улиток при воздействии HAL (HAL) (п=30) и у интактных улиток (К) (п=20) - достоверные отличия от начального значения в группе HALp 0,01 Было найдено, что нейролептик HAL действовал подавляюще на двигательную активность животных, не вызывая значительных изменений в оборонительном поведении, что видимо связано с разной медиаторной специфичностью нервных структур, являющихся мишенями для HAL. Соответствующее снижение скорости локомоции, частоты дыхательных движений, суммы потребляемой пищи под воздействием нейролептиков описывается в литературе для других видов брюхоногих моллюсков (Croll R.P. et al., 1997; Sakharov D.A. et al., 1996). Наиболее популярная, так называемая дофаминовая, гипотеза связывает терапевтический эффект НЛ с блокадой дофаминовых рецепторов и снижением тем самым патологически повышенного тонуса дофаминергической системы мозга (Leysen J.E. et al., 1993). Гипотеза о связи нейролептического эффекта с блокадой рецепторов ДА была впервые предложена A. Carlsson и A. Lindguist в 1963 году. Ими было обнаружено, что HAL повышает содержание метаболитов ДА в мозге животных. На основании этого наблюдения было высказано предположение, согласно которому НЛ блокируют рецепторы ДА, а усиление его оборота является вторичным и отражает активацию ДА нейрона, направленную на преодоление рецепторной блокады (Раевский К.С. и др., 1996).
