Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 13
1.1. Общая характеристика прооксидантной и антиоксидантной систем организма 13
1.1.1. Характеристика прооксидантной системы 13
1.1.2. Характеристика антиоксидантной системы 22
1.1.2.1. Физиологический компонент антиоксидантной системы 23
1.1.2.2. Биохимический компонент антиоксидантной системы 23
1.2. Действие на легкие кислорода при нормобарической и гипербарической оксигенации 31
1.2.1. Токсическое действие гипероксии на легкие 31
1.2.2. Свободно-радикальные процессы и антиоксидантная защита в легких и крови при гипероксии 35
1.2.2.1. Градиенты кислорода в организме, связанные с деятельностью легких в условиях гипероксии 35
1.2.2.2. Прооксидантные и антиоксидантные процессы в легких при гипероксии 37
1.2.2.3. Прооксидантные и антиоксидантные процессы в крови здорового организма при гипероксии 42
ГЛАВА 2. Объекты и методы исследования 48
2.1. Общая характеристика объектов и методов исследования 48
2.2. Методика гипербарической оксигенации 51
2.3. Обработка ткани легкого и взятие проб крови для определения содержания в них биохимических показателей 52
2.4. Определение содержания мочевины в ткани легкого и плазме крови 53
2.5. Определение содержания мочевой кислоты в ткани легкого и плазме крови 53
2.6. Определение содержания малонового диальдегида в ткани легкого и плазме крови 54
2.7. Определение активности каталазы в ткани легкого и эритроцитах крови 55
2.8. Определение активности супероксиддисмутазы в ткани легкого и плазме крови 56
2.9. Определения гемоглобина в плазме крови и в ткани легкого 56
2.10. Статистические методы обработки экспериментальных исследований 57
ГЛАВА 3. Результаты исследований 58
3.1. Динамика изменений МДА и внеэритроцитарного гемоглобина в легких, притекающей к ним и оттекающей от них крови при курсовом применении ГБО 58
3.2. Антиоксидантная защита легких при курсовом применении ГБО 61
3.3. Перекисное окисление липидов и активность антиоксидантной системы в легких в постгипероксическом периоде 68
3.3.1. Последействие однократного сеанса ГБО 69
3.3.2. Последействие 5-ти сеансов ГБО 70
3.3.3. Последействие 10-ти сеансов ГБО 72
ГЛАВА 4. Обсуждение результатов исследования 75
4.1. Динамика и взаимодействие оксидантных и антиоксидантных реакций в легких в процессе увеличения гипероксической нагрузки 75
4.2. Динамика и взаимодействие оксидантных и антиоксидантных реакций в легких при последействии курсовых сеансов ГБО 86
Заключение 91
Выводы 96
Практические рекомендации 98
Литература 99
- Биохимический компонент антиоксидантной системы
- Обработка ткани легкого и взятие проб крови для определения содержания в них биохимических показателей
- Динамика изменений МДА и внеэритроцитарного гемоглобина в легких, притекающей к ним и оттекающей от них крови при курсовом применении ГБО
- Динамика и взаимодействие оксидантных и антиоксидантных реакций в легких в процессе увеличения гипероксической нагрузки
Введение к работе
Актуальность исследования. С 50-х годов двадцатого столетия кислород под повышенным давлением (гипербарическая оксигенация, ГБО) стал использоваться при различных заболеваниях, сопровождающихся общей гипоксией организма, таких как геморрагический шок, легочная, сердечная патология и др. [12,19, 37, 59, 120,88, 11, 118 ,51,23, 116, 160,222, 263 и др.].
Исследования механизмов действия ГБО на организм человека проводится на основе двух теорий: гипернасышения крови и тканей кислородом [19, 161, 163, 251] и адаптационно-метаболической [76-84]. С позиции первой теории терапевтический эффект рассматривают как антигипоксическое действие ГБО. Однако данная теория не дает удовлетворительного объяснения длительного терапевтического последействия, при этом не ясен также эффект ГБО при заболевании без выраженной гипоксии организма.
В адаптационно-метаболической теории гипербарический кислород выступает регулятором степени развития и соотношения приспособительных, компенсаторных и патологических реакций организма, обладая мощным саногенетическим потенциалом. Эта теория предусматривает изучение конкретных метаболических реакций адаптации, которые формируют сано-генетический эффект ГБО при различных заболеваниях, а также объясняет физиологические эффекты гипероксии в здоровом организме. Разработка проблемы ГБО в этом аспекте может выявить новые свойства гипербарического кислорода, открыть новые направления в'его применении или, наоборот, ограничить его расширенное применение в медицинской практике.
Работы последних десятилетий демонстрируют широкое обращение к ГБО как методу терапии заболеваний, не сопровождающихся системной гипоксией и у здоровых людей, в связи с их профессиональной деятельностью. Из семидесяти шести нозологических форм, при которых рекоменду-
7 ется применение ГБО в соответствии с Приказом Министерства здравоохранения СССР №977 (от 4.11.75 г.), двадцать пять заболеваний не сопровождаются ни системной гипоксией организма, ни локальной гипоксией легких. Например, ГБО применяется в офтальмологической практике [71, 137 и др.], оториноларингологии [110], гастроэнтерологии [26, 54, 63], при лечении кожных заболеваний [53, 65, 106, 122], инфекционных заболеваний [20, 29, 121], облитерирующих заболеваний сосудов конечностей [20, 31, 73], заболеваний опорно-двигательного аппарата [35, 52, 70], пародонтозов [133]. Кроме того, ГБО используется применительно и к здоровому организму для реабилитации военных летчиков [68, 69, 114], а также как метод повышения устойчивости организма к декомпрессионной болезни у подводников [72, 103, 104]. При этом используются многократные сеансы ГБО в различных режимах: давление от 1,2 до 2,5 ата; продолжительность сеансов от 40 до 60 мин; число сеансов от 1 до 25 (в литературе встречаются единичные работы с использованием и большего курса ГБО) [21,71, 54, 85, 121, 133 и др.].
Вместе с тем кислород при определенных параметрах оксигенации может оказывать токсический эффект на организм [8, 37, 39, 42, 43, 67, 113, 145, 159 и др]. При длительном постоянном и дискретном многократном воздействии сравнительно небольших давлений кислорода (до 3 ата) может развиваться хроническая (подострая) кислородная интоксикация, при которой наиболее чувствительным органом являются легкие, где токсическое действие кислорода реализуется, формированием ателектазов, пневмонии, отека легких (синонимы - эффект Смита, легочный ожог, кислородная пневмония) [64, 65, 255, 171-173]. Суммарное время действия сеансов ГБО в клинике достигает продолжительности летальных непрерывных ингаляций кислорода (например, при 2 ата она равна в среднем 24 часа [235]). По мнению J. Clark [171, 172] верхним пределом безопасности для человека
8 при многодневном воздействии на человека является давление кислорода
0,5 ата, что значительно ниже реально применяемых в медицине давлений.
Известно, что одним из первичных механизмов токсического действия кислорода является генерация агрессивных свободных радикалов с нарушением мембранной проницаемости клеток [19, 22, 37, 113]. При этом ведущей стресс-лимитирующей, системой является антиоксидантная система [55, 93, 94]. В проанализированной нами литературе мы не нашли работ по изучению действия ГБО на метаболизм легких в режимах, близких к его курсовому применению в клинической практике при нелегочной патологии. Таким образом, вопрос о возможности токсического действия многократных сеансов ГБО на легкие, находящиеся перед оксигенацией в условии нормального кислородного режима, остается открытым. Не лишено оснований и предположение о возможности субклинических эффектов гиперок-сии, которые впоследствии могут реализоваться в виде пульмосклеротиче-ских процессов. Во многом не ясны также механизмы положительного эффекта ГБО, применяемой у здоровых людей и при различных заболеваниях, общим для которых является отсутствие генерализованной гипоксии организма и локальной гипоксии легких.
Вышеизложенное определило цель и задачи данной работы, проведенной в соответствии с программно-целевым исследованием Воронежской государственной медицинской академии им. Н.Н. Бурденко «Общие закономерности и фундаментальные механизмы адаптации биологических систем при гипо- и гипероксии» (руководитель - Заслуженный деятель науки РФ, профессор А.Н. Леонов) и проблемной комиссии «Гипербарическая оксиге-нация» (председатель - Лауреат Государственной премии СССР, профессор В.Л. Лукич) Научного совета по хирургии (председатель - академик РАН и РАМН Б.В, Петровский).
Цель исследования заключается в выявлении динамики развития окислительного стресса по взаимоотношению в легких процессов ПОЛ и антиоксидантных реакций при курсовых режимах ГБО с оценкой качества адаптации легких к хронической гипероксии.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
Изучить динамику процессов перекисного окисления липидов -ПОЛ (по содержанию малонового диальдегида - МДА) в ткани легких, плазме притекающей и оттекающей от них крови при ГБО (2 ата — 50 мин) на разных этапах оксигенации здоровых животных в процессе нарастания гипероксической нагрузки (1-18 сеансов).
Исследовать динамику активности антиоксидантных ферментов (ка-талаза, суперокисиддисмутаза - СОД) и содержание метаболитов (мочевина, мочевая кислота) в легких, притекающей и оттекающей от них крови при ГБО на разных этапах оксигенации здоровых животных в процессе нарастания гипероксической нагрузки (1-18 сеансов).
Установить фазность развития проявлений окислительного стресса в легких в процессе нарастания числа сеансов ГБО (1-18 сеансов) по соотношению про- и антиоксидантных реакций и содержанию внеэритроцитарно-го гемоглобина в плазме крови и ткани легких.
4. Выявить последействие курсов с различным числом сеансов ГБО по динамике процессов ПОЛ и активности антиоксидантных реагентов (СОД и мочевины) в ткани легких.
Научная новизна. Впервые исследованы механизмы многократного действия ГБО в клинических режимах на легкие здорового организма с анализом взаимосвязи показателей прооксидантных (процессы ПОЛ) и антиоксидантных реакций. Установлено, что проявления окислительного стресса в легких на протяжении 18 ежедневных сеансов имели фазный характер: две фазы компенсации (после 1-го и 10-го сеанса) чередовались с двумя фазами декомпенсации (после 5-го и 18-го сеансов). Впервые проведено исследование последействия ГБО на оксидантные и антиоксидантные реакции в легких как одного сеанса, так и курсов из 5-ти и 10-ти сеансов и выявлено, что
10 процессы ПОЛ (по МДА), несмотря на активацию антиоксидантних реагентов, не нормализуются в течение 5-ти - 8-ми суток, и, следовательно, сохраняется состояние окислительного стресса.
Теоретическое значение работы. Теоретическое значение работы заключается в расширении представлений об адаптации здорового организма к гипероксической нагрузки. В ней показано, что к 10-му сеансу гипербарический кислород вызывал наивысшую степень активации антиоксидантных реакций и адаптации организма к гипероксии. С учетом феномена перекрестной адаптации при этом создаются перспективы использования ГБО в этом диапазоне при различных состояниях человека как в норме, так и при патологии. Напротив, к 18-му сеансу гипербарический кислород вызывает торможение активированных перед этим антиоксидантных реакций и вторичное повышение процессов ПОЛ, что свидетельствует об дазадаптирую-щем действии кислорода под повышенным давлением и снижении резистентности к гипероксии. Полученные результаты могут быть использованы для дальнейшего развития адаптационно-метаболической теории гипербарической оксигенации и концепции адаптационной медицины.
Практическая значимость работы связана с тем, что она на основе выявленного к 10-му сеансу мощного адапттогенного действия гипербарического кислорода (2 ата - 50 мин) обосновывает использование его у здоровых и у больных людей как фактор адаптационной профилактики и адаптационной терапии. Напротив, выявленное к 18-му сеансу ГБО резкое сни-жение резистентности легких к окислительному стрессу обосновывает более дифференцированное отношение к назначению длительных курсов ГБО при заболеваниях без выраженной гипоксии организма или локальной гипоксии легких. Наряду с этим выраженное последействие одного, 5, 10 сеансов ГБО в легких, характеризующееся сохранением проявления окислительного стресса в легких в течение 5-8 суток после заключительного сеан- са ГБО, ставит вопрос о целесообразности антиоксидантнои терапии после применения ГБО.
Основные положения исследования внедрены в лечебную работу Межклинического отделения ГБО Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова (Зав. отделением - Лауреат Государственной премии СССР, профессор В.Л. Лукич).
Положения, выносимые на защиту:
Динамика взаимоотношений процессов ПОЛ (по МДА) и антиоксидантних реакций легких характеризуется чередованием фаз компенсации окислительного стресса (после 1 -го и 10-го сеансов ГБО) и декомпенсации - после 5-го и 18-го сеансов ГБО (2 ата - 50 мин), последнюю из которых можно рассматривать как предтоксическую стадию хронического гипероксического воздействия.
В течение 18-ти дневного курса ГБО (2 ата, 50 мин, ежедневно) в проявлениях окислительного стресса в легких к 10 сеансу формируется период максимальной выраженности реакций антиоксидантнои защиты и адаптации к гипероксии, а к 18 сеансу - период торможения активированных перед этим реакций антиоксидантнои защиты и снижения адаптации и резистентности к гипероксии.
Как один, так и многократные (5 и 10) ежедневные сеансы ГБО оказывают выраженное последействие на процессы ПОЛ и реакции антиоксидантнои защиты в легких в течение 5-8 суток, что свидетельствует о сохранении в организме состояния компенсированного или некомпенсированного окислительного стресса.
Апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 8 научных работ. Основные положения работы доложены и обсуждены на XII научно-практической конференции по космической биологии и авиакосмической медицине (Москва, 2002); XXI международном симпозиуме «Эколо-го-физиологические проблемы адаптации» (Москва, 2003); V всеармейской
12 научно-практической конференции «Баротерапия в комплексном лечении раненых, пораженных и больных» (Санкт-Петербург, 2003); III всероссийской конференции с международным участием «Механизмы функционирования висцеральных систем» (Санкт-Петербург, 2003); VII международной конференции «Высокое давление в биологии и медицине» (Москва, 2003); научной конференции молодых ученых ВГМА (Воронеж, 2003).
Биохимический компонент антиоксидантной системы
Биохимический компонент антиоксидантной системы включает в себя два звена - ферментное и метаболитное.
Антиоксидантные ферменты специализированны на разрушении активных форм кислорода и органических гидроперекисей. Важнейшей из них является - СОД [218]. Она снижает в биосистемах уровень супероксидного анион-радикала, превращая его в менее реакцион носпособные молекулы перексида водорода в реакции дисмутации: О"2 + От. + 2Н+ — Н2О2+О2. Ввиду того, что СОД усиливает образование перекиси водорода в клетках, ее эффективность будет зависеть от взаимодействия с антиперекисными ферментами, разрушающими пероксид водорода — каталазой и глутатионпероксидазой. В организме имеется несколько изоферментных форм СОД: внутриклеточные формы - медь-цинковая (Cu,Zn-COД) содержится в цитозоле и межмембранном пространстве митохондрий, марганцевая форма (Мп-СОД) локализована в митохондриях, а также внеклеточная СОД — высокомолекулярная форма, представляющая собой тетрамер Си,2п-СОД, содержащаяся во внеклеточных жидкостях, обладающая сродством к гепарину и в связи с этим хорошо фиксирующаяся на гликокаликсе эндотелиоцитов, эпителио-цитах бронхов и альвеолоцитах [14, 115, 194]. Ее и-РНК (маркер синтеза) образуется в макрофагах легких, клетках стенки артериальных сосудов и альвеолярных перегородок. Супероксиддисмутаза обнаружена и бронхо-альвеолярной жидкости с уровнем активности, близким к ее внутриклеточным изоформам [A. Baritussio, 1988, цит. по 93]. В настоящее время исследуется возможность применения СОД, ковалентно связанной с белками, в эксперименте и клинике с целью получения защитного эффекта при различных патологических процессах: при дыхательной недостаточности, инфаркте миокарда, ишемии мозга, гипероксическом повреждении легких и др. [14, 178, 226, 236, 265 242]. Вместе с тем надо отметить, что СОД, содержащая металлы переменной валентности (Си+ -» Си2+), в определенных условиях может выступать в качестве прооксиданта, образуя радикалы О"\ и ОН [156]. Каталаза представляет собой гемсодержащий (Fe3+) фермент, локализованный преимущественно в пероксисомах клеток [14], катализирует ре 25 акцию: 2Н2О2 — 2Н20 + 02. Она эффективно работает при высоких концентрациях пероксида водорода [177]. В связи с этим каталазе принадлежит ключевая роль в защите клеток от окислительного стресса, вызванного высоким содержанием Н2Ог [177, 258]. Максимальное содержание каталазы обнаружено в эритроцитах, печени и почках [2]. Окисленная каталаза может работать как пероксидаза, катализируя окисление спиртов или альдегидов. Кроме того, каталаза может выступать и как источник образования активных радикалов кислорода: 0,5% кислорода, образующегося в при разложении пероксида водорода, возникает в синглетном состоянии [Н.В. Шинкаренко и др., 1982, цит. по 93]. Глутатионпероксидаза представляет собой селен-содержащий фермент, имеется во всех клетках, локализована в цитозоле (около 70%) и митохондриях (до 30%) всех клеток [14]. Недостаток поступления селена в организм с пищей приводит к снижению уровня глутатионпероксидазы, что снижает устойчивость организма к липопероксидации [H.J. Forman, 1990, цит. по 93]. Глутатионпероксидаза катализирует реакцию окисления глута-тиона, при этом происходит разложение перекиси водорода до воды: 2 Глутатион-SH + Н202 —» Глутатион-8=8-Глутатион + Н20. Обратное восстановление глутатиона происходит в реакции с глутатионредуктазой. Глутатионпероксидаза в качестве субстрата может использовать также гидроперекиси липидов (ROOH), превращая их в нетоксичные оксиформы. Сродство глутатионпероксидазы к пероксиду водорода выше, чем у каталазы. Поэтому она более эффективно работает при низких концентрацнґях субстрата [177]. Глутатионтрансферазы - это мультиферменты, использующие восстановленный глутатион для конъюгации с гидрофобными соединениями и восстановления органических перекисей с большим размером молекулы, они локализованы преимущественно в цитозоле клеток [64, 127]. В отличие от глутатионпероксидазы они не взаимодействуют с пероксидом водорода, но эффективно восстанавливают гидрофобные но эффективно восстанавливают гидрофобные гидроперекиси, например ненасыщенных жирных кислот фосфолипидов. Кроме того, конъюгируя токсические продукты ПОЛ (ноненаль, дециналь, холестерол-а-оксид) с восстановленным глутатионом, глутатионтрансферазы способствуют их удалению из организма [64, 107]. Антиоксидантные метаболиты оказывают свой эффект во всех водных и липидных фазах биосистем, в отличие от ферментных антиоксидан-тов, действующих преимущественно внутриклеточно. Большинство из них по механизму действия относится к трем группам соединений: 1) содержащие енольные группы, 2) содержащие сульфгидрильные группы и 3) хелат-ные соединения [93]. 1) Антиоксидантные соединения, содержащие енольную группу (НО-С=С-), включают в себя фенольные антиоксиданты и аскорбиновую кислоту.
Фенольные антиоксиданты. К наиболее важным представителям этой группы относятся вит. Е (а-токоферол), убихинон (коэнзим Q), вит. К (филлохинон), вит. А (ретинол) и каротины, ароматические аминокислоты (тирозин, фенилаланин и триптофан) и производные от них гормоны (мелатонин, тироксин) [1, 9, 15, 16, 40, 93, 98, 99, 206] Общим свойством этих соединений является способность прочно связываться с мембранами: витамины Е, К и убихинон это осуществляют с помощью изопреноидной боковой связи, вит. А и каротины - с помощью эфирной связи с жирными кислотами мембраны, ароматические кислоты в составе пептидной цепи белков мембраны [99]. Это формирует их ключевую роль в защите мембран от радикалов, возникающих в процессе ПОЛ. Показано, что в состав сур-фактанта, секретируемого альвеолоцитами II типа, входит вит. Е, который защищает его от реактивных форм кислорода [206].
Главный механизм действия фенольных антиоксидантов связан с гид-роксильной группой их ароматического ядра. Обобщенная система к 27 электронов ароматического кольца вызывает смещение отрицательного заряда на кислород, в результате чего происходит легкий отрыв атома водорода ОН-группы с образованием фенокси-радикалов. Однако эти радикалы антиоксидантов менее сильные, кроме того, в последующих реакциях (образование и распад хинолипидных перекисей) теряют радикальные свойства [93]. Показано, что фенольные антиоксиданты осуществляют эффективное ингибирование супероксидного аниона, гидроксильного радикала, синглетного кислорода и инициированных ими процессов ПОЛ [1, 2, 176, 264].
Обработка ткани легкого и взятие проб крови для определения содержания в них биохимических показателей
При ГБО-терапии заболеваний, не сопровождающихся системной гипоксией используются преимущественно режимы «малых» давлений от 1,3 ата до 2,5 ата, имеются единичные работы об использовании давления 3 ата [31]. Поэтому в данной работе был использован режим ГБО 2 ата в течение 50 мин изопрессии как средний из встречающихся в лечении заболеваний, не сопровождающихся системной гипоксией. Применение ГБО при терапии данных заболеваний бывает однократным и курсовым. При курсовом применении встречается различное число сеансов (до 15-20), имеются единичные работы с числом сеансов до 25 и более [21, 52, 54, 110].
Гипербарическую оксигенацию животных проводили медицинским кислородом (ГОСТ 5583-50, чистота не менее 99,2%) в барокамере объемом 90 л, в которой находилась натронная известь («Пи - 868», ГОСТ 4455-48), активированный уголь (ОЧ марки «Б» ГОСТ 4453) для поглощения СОг и других газообразных продуктов жизнедеятельности животных, силикагель марки «КСК» ГОСТ 3956-54 для поглощения водяных паров.
Кислород подавался в барокамеру из баллона, снабженного редуктором газовым медицинским. Перед созданием компрессии барокамера вентилировалась в течение 2-3 минут, что достаточно для замены воздуха кислородом в камерах малого объема [38, 109]. После вентиляции барокамеры и ее герметизации проводили компрессию со скоростью 20,25 кПа/мин, которую прекращали через 5 минут, создав давление в 2 ата (202,6 кПа). Давление регистрировали по манометру со шкалой до 5 кг/см (6 ата). Скорость декомпрессии также составляла 20,25 кПа/мин, длительность - 5 минут. Через 30 мин от начала компрессии проводилась вентиляция барокамеры, не снижая давление в ней. Таким образом, в течение сеанса ГБО общей продолжительностью 60 минут, время изопрессии составляло 50 минут.
Забой животных для получения легочной ткани производили с учетом «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приказ МЗ СССР №755 от 12.08.1977 г.). В качестве обезболивания использовали ингаляционный наркоз медицинским эфиром. После вскрытия грудной клетки и взятия притекающей к легким крови, проводили дека-питацию и перфузию легких (in situ) изотоническим раствором хлорида калия (температура +1 — (+3)С) объемом 10 мл. Легкие выделялись на льду, после чего брали две навески ткани. Первую гомогенизировали в 0,25М растворе трис-HCl буфере при температуре +1 — (+3) С. Вторая навеска экстрагировалась в 17% растворе трихлоруксусной кислоте при такой же температуре. Затем пробы центрифугировались в течение 10 мин при 3000 об/мин. Надосадочную жидкость использовали для определения биохимических показателей.
В качестве «оттекающей» от легких (артериальной) крови была исследована кровь из бедренной артерии. Данный методический прием основан на положении об одинаковом химическом составе артериальной крови на всем протяжении крупных и средних артерий [119, 151].
Притекающую (венозную) кровь к легким брали из правого желудочка сердца после вскрытия грудной клетки. Исследование ферментов и метаболитов крови было проведено в равной доле участия совместно с аспирантом кафедры номальной физиологии ВГМА Шепелевой Я.В., которая в своей работе использовала аналогичные серии опытов и биохимические показатели крови, что позволило в соответствии с требованиями биоэтики (этические проблемы отношения экспериментатора к подопытным животным) уменьшить количество жертв эксперимента. Содержание мочевины в легких и плазме крови определяли колориметрическим методом [55] с использованием набора реактивов фирмы «Ла-хема» (Чехия). Принцип метода: мочевина с диацетилмоноксимом при наличии тио-семикарбазида и ионов железа в сильнокислой среде образует комплекс красного цвета, при этом интенсивность окрашивания раствора прямо пропорциональна концентрации мочевины в нем. Условия определения. К инкубационной смеси, содержащей 2,0 мл раствора тиосемикарбазид-диацетилмоноксима и Ш раствор серной кислоты в пропорции 1:1, добавляли 0,1 мл кислого экстракта ткани легкого или 0,01 мл плазмы крови. В контрольном опыте экстракт ткани легкого (плазму) заменяли равным количеством раствора трихлоруксусной кислоты. Калибровочную кривую сроили с помощью стандартных растворов мочевины. Пробы инкубировали при 100 С в течение 10 мин, быстро охлаждали и не позднее 10 мин определяли оптическую плотность при длине волны 525 нм на спектрофотометре «СФ-46» (СССР). Содержание мочевины вычисляли с помощью калибровочного графика и выражали в ммоль/кг сырой ткани и в ммоль/л плазмы крови. Коэффициент вариации в параллельных пробах данного метода составил 3,24%. Содержание мочевой кислоты в легких и плазме крови определяли колориметрическим методом с использованием набора реактивов фирмы «Vital Diagnostics» (Санкт-Петербург, Россия). Принцип метода: метод основан на восстановлении фенантролинового комплекса мочевой кислотой. Условия определения. К инкубационной смеси, содержащей 1,8 мл глицеринового буфера (100 ммоль/л) и 0,2 мл железо-фенантролиновый реагента (ортофенантролин гидрохлорид 61,5 ммоль/л и хлорное железо 12,2 ммоль/л) добавляли 0,05 мл гомогената ткани легкого или плазмы крови. В контрольном опыте гомогенат ткани легкого (плазму) заменяли 0,05 мл дистиллированной водой. Калибровочную кривую строили с помощью стандартного раствора мочевой кислоты. Пробы инкубировали при комнатной температуре 20-25 С в течение 5 мин, и определяли оптическую плотность при длине волны 500 нм в кювете с толщиной поглощающего слоя 10 мм на спектрофотометре «СФ-46». Содержание мочевой кислоты вычисляли с помощью калибровочного графика и выражали в мкммоль/кг сырой ткани и в мкммоль/л плазмы крови. Коэффициент вариации в параллельных пробах данного метода составил 5,86%.
Динамика изменений МДА и внеэритроцитарного гемоглобина в легких, притекающей к ним и оттекающей от них крови при курсовом применении ГБО
Одной из задач настоящей работы явилось изучение содержания МДА и внеэритроцитарного гемоглобина в легочной ткани. МДА является наиболее токсичным для организма вторичным продуктом ПОЛ. Его избыток в ткани легких свидетельствует об увеличении продукции активных кислородных метаболитов и может приводить к нарушению структурной целостности мембран аэрогематического барьера, о чем можно судить по нарастанию концентрации внеэритроцитарного гемоглобина в ткани легких.
Общее количество животных, изученных по данным показателям, представлено в табл. 1 в пяти сериях опытов (их характеристику см. главу 2). Примечание: МДА - малоновый диальдегид, ОК - оттекающая от легких кровь, ПК - притекающая к легким кровь; достоверное различие результатов по сравнению с 1-й серией; - со 2-й серией, - с 3-й серией; -с 4-й серией, количество животных в сериях см. табл. 1.
Как видно из табл. 2, однократные сеансы ГБО в режиме 2 ата - 50 мин изопрессии (2-я серия) не привели к достоверному изменению концентрации МДА в легких относительно неоксигенированных животных. При увеличении числа сеансов ГБО до пяти происходило нарастание содержания МДА в легких на 58% по сравнению с неоксигенированными животными и на 92% по сравнению с однократным сеансом ГБО. Легочная ткань животных, взятых в эксперимент сразу же после 10 сеансов ГБО, характеризовалась достоверным снижением МДА (на 40%) по сравнению с животными 3-й серии (пять сеан 60 сов) и не отличалась от контрольных животных. Дальнейшее увеличение ги пероксической нагрузки (18 сеансов ГБО) приводило к повторному нарастанию содержания МДА в легочной ткани на 51% относительно неоксигениро-ванных животных и животных после меньшей гипероксической нагрузки.
Концентрация МДА в плазме притекающей и оттекающей от легких крови была без изменений при одно- и пятикратных сеансах ГБО. В четвертой серии опытов (10 сеансов) обнаружено снижение МДА по сравнению с животными 1-й серии в артериальной оттекающей от легких крови на 14%, содержание его в притекающей (венозной) крови не отличалось от контроля. Отсутствие достоверных изменений ПОЛ в плазме крови больных с дистрофическими тазобедренных суставов при курсовом применении ГБО (1,4 ата в течение 5-10 сеансов) было показано в работе Буйволовой и др. [52]. После 18 сеансов ГБО происходило дальнейшее снижение в плазме оттекающей крови от легких и снижение МДА в плазме притекающей к легким венозной крови относительно неоксигенированных животных на 33% и 25% соответственно. Различия в концентрации МДА после 18 сеансов выявлены также в оттекающей от легких крови по сравнению с животными с 1, 5 и 10 сеансами, а в притекающей крови - с 10 сеансами. Достоверных изменений содержания МДА по артерио-венозной разнице не выявлено.
Исследование динамики внеэритроцитарного гемоглобина в легких, плазме притекающей к ним и оттекающей от них крови (см. табл. 3) показало отсутствие достоверного изменения динамики на протяжении всего курса ГБО.
Таким образом, увеличение концентрации МДА в легких в процессе увеличения гипероксической нагрузки происходило в 2 фазы: после 5 и 18-го сеансов, тогда как между 5 и 18-м сеансами (после 10-ти сеансов) уровень МДА нормализовался. Эти данные свидетельствуют о фазности усиления процессов ПОЛ в легких в течение длительных курсов ГБО. Содержание МДА в плазме притекающей и оттекающей от легких крови при нарастающей гипероксической нагрузке не повторяло динамику содержания ПОЛ в легких.
В соответствии с задачами работы в легких произведено исследование ферментного и метаболитного звеньев антиоксидантной системы по следующим показателям. В ферментативном звене изучали активность СОД и ката-лазы, в метаболитном - определяли концентрацию мочевины и мочевой кислоты. Общее количество животных, изученных по данным показателям представлено в табл. 4 в пяти сериях опытов (их характеристику см. главу 2). Динамика изменений концентрации СОД, каталазы, мочевины и мочевой кислоты в легких, притекающей к ним и оттекающей от них крови представлены в табл. 4, 5 и рис. 3.
Как видно из рис. 3, изменения ферментативного и метаболитного звеньев антиоксидантной системы происходили неодинаково. Однократный сеанс оксигенации животных (2-я серия) привел к резкой активации всех изученных показателей антиоксидантной системы в их легких. Содержание СОД, катала 62 зы, мочевины и мочевой кислоты увеличилось на 74, 79, 83 и 128% соответственно.
У животных 3-й серии опытов (5 сеансов ГБО) были получены следующие данные. Активность СОД снижалась на 60% по сравнению с однократно оксигенированными животными и не отличалась от ее активности у животных контрольной серии. Активность каталазы достоверно не отличалась от неоксигенированных животных, а по сравнению с животными 2-й серии имела тенденцию к уменьшению (0,05 р 0,1). Концентрация изученных антиок-сидантных метаболитов оставалась повышенной по сравнению с контрольными животными, но степень ее увеличения была ниже, чем у животных 2-й серии: 57% Для животных 4-й серии опытов (10 сеансов ГБО) было характерно повторное повышение активности ферментного звена антиоксидантной защиты легких по сравнению с животными 1 и 3-й серии. Активность СОД была увеличена на 74% , каталазы - на 140% относительно интактных животных, а по сравнению с животными 3-й серии на 60 и 103% соответственно. Содержание мочевины и мочевой кислоты в легких оставалось повышенным относительно контроля на 45 и 80%о соответственно.
У животных 5-й серии опытов (18 сеансов) обнаружено повторное снижение активности СОД в легких по сравнению с животными 2-й серии (1 се 64 анс ГБО) и 4-й серией (10 сеансов ГБО), она достоверно не отличалась от контрольной величины. Активность каталазы в легких также уменьшалась по сравнению с животными 4-й серии (10 сеансов), однако была выше активности у контрольных животных (на 59%). Содержание мочевины и мочевой кислоты в легких уменьшается относительно одно- и пятикратной оксигенации (2 и 3-я серия). Однако концентрация мочевой кислоты оставалось повышенной по сравнению с контрольными животными животных 1-й серии (на 31%).
Динамика и взаимодействие оксидантных и антиоксидантных реакций в легких в процессе увеличения гипероксической нагрузки
Анализ данных литературы, проведенных в главе 1, показал, что легкие млекопитающих различных видов являются главной мишенью для токсического длительного или дискретно-многократного воздействия гиперок-сии при давлении кислорода, не превышающих 3 ата [39, 57, 255, 60, 171-173, 181, 245, 246, 235, и др.]. При этом было показано, что время 50% смертности показывает гиперболическую зависимость между давлением кислорода и продолжительностью экспозиции: от 76 часов при 1 ата до 9 часов при 3 ата [60, 171-173, 181, 245]. При действии кислорода под давлением 2,5 - 4 ата была отмечена возможность более раннего наступления как симптомов поражения нервной системы, так и легких [33, 34, 60, 113, 138], при давлениях выше 4 ата характерны токсические проявления со стороны нервной системы.
Проведенный анализ литературных данных показал, что при курсовом применении ГБО при давлении 1,5-2,5 ата (40-60 мин) число используемых сеансов гипероксии обычно находится в диапазоне 5-20 (иногда достигает 25, изредка больше). При этом суммарное время, проведенное человеком в гипероксических условиях, может превысить время 50% смертности, например, в опытах на животных при 2 ата оно равно 17,4 часа [196]. Еще больше это суммарное время превышает допустимое «безопасное» время пребывания человека в гипероксических условиях: при 2 ата оно, по мнению разных авторов, составляет около 5 часов [39, 145]. Конечно, можно предположить, что дискретные (в виде сеансов) многократные воздействия ГБО сопровождаются адаптацией организма к гипероксии, но поскольку этот вопрос практически не исследован, допустима возможность и кумуляции токсических реакций ГБО. Особенно сложные условия создаются для легких при многократных сеансах ГБО, применяемых у здоровых людей в связи с их профессиональной деятельностью и у больных, в организме которых нет общей гипоксии. В этой связи интересно отметить, что в Приказе Министерства здравоохранения СССР №977 от 04.11.1975 г. среди 76 нозологических форм заболеваний, при которых рекомендуется применение ГБО, имеется 25 заболеваний без общей гипоксии организма, при которых кислородный режим легких соответствует норме. Для лечения таких заболеваний используются, как правило, курсовые режимы многократных сеансов ГБО.
Распространено мнение, что пусковым фактором формирования физиологических, патогенетических и саногенетических реакций организма в условиях ГБО является активация свободно радикальных процессов (включая ПОЛ) и взаимодействующих с ними реакций антиоксидантной системы, которые в целом оцениваются как состояние «окислительного» стресса [37,39, 60, 76-78,94, 113,269]. Особенностью этого стресса по сравнению с другими является то, что среди стресс-лимитирующих систем главную роль играет антиоксидантная система организма. В связи с этим результаты, полученные в работе по реакциям легких при гипероксии, будут обсуждены с учетом динамики соотношения проокисдантных и антиоксидант-ных реакция, а также с позиции общего адаптационного синдрома [123], развивающегося в организме в ответ на действие стрессорного фактора гипербарического кислорода. При оценке полученных результатов используется также классификация А.П. Мясниковой [104]. Она предлагает выделять дотоксическую стадию воздействия кислорода, при которой преобладают компенсаторные реакции, предтоксическую стадию кислородного воздействия, при которой наряду с реакциями компенсации развиваются и реакции декомпенсации, и токсическую стадию, когда имеется преобладание декомпенсаторных реакций, вызывающих функциональные и структурные нарушения органов. Диалектику этих реакций хорошо подметил А.Г. Жиронкин [39]; по его мнению, физиологические реакции на гипербарический кислород, хотя и являются приспособительными, одновременно включают в себя и начальные проявления токсического действия кислорода.
Действие одного сеанса ГБО (2 ата - 50 мин) на легкие здоровых крыс (2-я серия опытов). Отметим, что в этих условиях (с учетом напряжения водяных паров и углекислого газа) напряжение кислорода в альвеолярном воздухе ив клетках альвеол равно приблизительно 1400 мм рт. ст. [113], т.е. оно в 14 раз превышает нормальную величину. Однократная ок-сигенация не сопровождалась повышением процессов ПОЛ (по уровню МДА) в легких, в плазме притекающей и оттекающей от них крови. Об отсутствии выраженных нарушений мембраны эритроцитов и мембран диффузионного аэрогематического барьера в легких свидетельствует и нормальное содержание внеэритроцитарного гемоглобина в плазме крови, а также отсутствие его нарастания и в легочной ткани по сравнению с контролем. Блокаду перекисного окисления липидов мембран у животных этой группы можно объяснить резко выраженной стимуляцией (на 78-128%) в легких всех изученных антиоксидантных реагентов, как ферментных (СОД и каталаза), так и метаболитов (мочевина и мочевая кислота). В крови была увеличена активность СОД и концентрация мочевой кислоты.
Интересно отметить, что при более высоком давлении кислорода (3 ата мин) активация антиоксидантних реакций в легких здоровых крыс (СОД, каталаза, мочевина, мочевая кислота) не смогла предотвратить увеличение процессов ПОЛ: происходило увеличение МДА и гидроперекисей липидов [58]. При еще более высоких уровнях гипероксии (7 ата до судорог) процессы ПОЛ в легких увеличивались в 3,3 раза [67]. Вероятно, диапазон давления в 2-3 ата (при оксигенации в течение часа) является тем рубежом, на котором антиоксидантные процессы в легких ещё могут предотвратить активацию процессов ПОЛ.
Выявленное по результатам работы взаимодействие антиоксидантных и оксидантных реакций в легких животных после однократного сеанса ГБО позволяет считать, что приспособительные (антиоксидантные) реакции при этом резко преобладают над патологическими (прооксидантными по процессам ПОЛ) реакциями, практически блокируя их. Следовательно, окислительный стресс по его проявлениям в легких находится в фазе компенсации, а по классификации А.П. Мясниковой [104] - в дотоксической стадии действия ГБО. С позиций общего адаптационного синдрома Г. Се-лье [123] его проявления соответствуют 1-й стадии - стадии «тревоги» (см. рис. 8). С учетом анализа результатов последующих серий опытов (см. ниже) проявление окислительного стресса в легких при однократном сеансе ГБО можно обозначить как первичную фазу компенсации. Интересно отметить, что реакция второго органа мишени для гипербарического кислорода - головного мозга, изученная Я.В. Шепелевой [141] при аналогичных режимах оксигенации, также соответствовала компенсированному окислительному стрессу.
