Содержание к диссертации
Введение
1 Обзор литературы 10
1.1 Современные представления о составе и процессе образования микровезикул 10
1.2 Влияние микровезикул на гемостаз 17
1.3 Влияние консервации на микровезикуляцию эритроцитов 20
1.4 Микровезикуляция эритроцитов при патологических состояниях 25
2 Материалы и методы 32
2.1 Предварительная обработка крови 32
2.2 Приготовление суспензии микровезикул 33
2.3 Методы оценки влияния эритроцитарных микровезикул на гемостаз 34
2.4 Методы оценки влияния эритроцитарных микровезикул на фибринолиз 36
2.5 Методы оценки фибринолитической активности эритроцитарных микровезикул без добавления бестромбоцитарной плазмы 38
2.6 Методы оценки количества гликированного гемоглобина (HbA1c) в эритроцитах, их мембранах и МВ 39
2.7 Методы оценки морфологии, деформируемости и электрофоретической подвижности эритроцитов 40
2.8 Метод исследования влияния эритроцитарных микровезикул на спонтанную (поток-индуцированную) агрегацию тромбоцитов и полимеризацию фибрин-мономеров. 41
2.9 Статистическая обработка результатов 44
3 Результаты и их обсуждение 45
3.1 Исследование влияния микровезикул, выделенных после 24 часов инкубации эритроцитов, на гемостаз 45
3.1.1 Влияние эритроцитарных микровезикул на процесс коагуляции плазмы крови з
3.1.2 Влияние эритроцитарных микровезикул на спонтанную (поток индуцированную) агрегацию тромбоцитов 51
3.2 Изучение влияния консервации эритроцитов на коагуляционную активность выделенных из них микровезикул 55
3.2.1 Влияние эритроцитарных микровезикул на процесс коагуляции плазмы крови 55
3.2.2 Влияние эритроцитарных микровезикул на спонтанную агрегацию тромбоцитов 60
3.2.3 Связь деформируемости эритроцитов с гликированием гемоглобина и образованием микровезикул 67
3.2.4 Изменение электрофоретической подвижности эритроцитов при их консервации 76
3.2.5 Влияние консервации эритроцитов на фибринолитическую активность выделенных из них микровезикул 80
3.2.6 Влияние консервации эритроцитов на антитромбиновую активность выделенных из них микровезикул 89
3.3 Изменение микровезикуляции эритроцитов и гемокоагуляционных свойств эритроцитарных микровезикул в ранний период ожоговой болезни 99
3.3.1 Влияние эритроцитарных микровезикул на плазменный гемостаз 99
3.3.2 Влияние микровезикул эритроцитов на спонтанную агрегацию тромбоцитов 105
3.3.3 Изменение электрофоретической подвижности эритроцитов и содержания в них гликированного гемоглобина 110
3.3.4 Влияние термической травмы на антитромбиновую и фибринолитическую активность эритроцитарных микровезикул115
Заключение 122
Выводы 127
Список литературы 129
- Влияние микровезикул на гемостаз
- Микровезикуляция эритроцитов при патологических состояниях
- Методы оценки фибринолитической активности эритроцитарных микровезикул без добавления бестромбоцитарной плазмы
- Изучение влияния консервации эритроцитов на коагуляционную активность выделенных из них микровезикул
Влияние микровезикул на гемостаз
Известно, что процесс коагуляции крови является важным механизмом, который останавливает кровотечение. Это жестко контролируемый, тщательно регулируемый процесс, который необходим для остановки кровотечения при повреждении сосуда. Основными компонентами, участвующими в активации процесса коагуляции, являются факторы свертывания плазмы крови, активированные тромбоциты, ионы Са2+ и прокоагулянтная поверхность мембраны. Известно, что активированные клетки крови и отделившиеся от них МВ имеют отрицательно заряженные мембраны и, считается, что таким образом они обладают прокоагулянтным свойством (Zwaal R. F., Schroit A. J., 1997). Присутствие отрицательно заряженных фосфолипидных мембран и ионов Са2+ является необходимым для сборки коагулянтных комплексов, таких как теназный или протромбиназный. Роль теназного комплекса заключается в конвертировании фактора X в фактор Ха, во внешнем и внутреннем путях. Теназный комплекс, образуемый по внешнему пути активации, состоит из тканевого фактора (ТФ) и фактор VIIа, в то время как теназный комплекс, образуемый по внутреннему пути, состоит из кофактора VIIIа и фактора IXа (Blostein M. D. et al., 2003; Furie B., Furie B. C., 2007). Функция протромбиназы, состоящей из кофактора Va и фактора Xа, заключается в преобразование протромбина в тромбин. Фактор IXа и фактор Xа могут конвертировать субстрат без их кофакторов, однако отрицательно заряженные мембраны являются катализаторами реакции в 3x105 раза ускоряя активность протромбиназы (Nesheim M. E. et al., 1979; Mertens K., Bertina R. M., 1984). Важность отрицательно заряженных фосфолипидов заключается в содействии сборке сложного комплекса, ускоряя ее примерно в 1000 раз, что значительно увеличивает эффективность гемостаза (Kini R. M., 2005). На рисунке 5 обозначено возможное место действия МВ в коагуляционном каскаде. Рисунок 5 – Каскад коагуляции крови и возможное место действия в нем МВ (Rubin O. et al., 2010a).
В связи с тем, что МВ содержат ФС на своей мембране, они могут способствовать коагуляции, предоставляя дополнительную катализирующую отрицательно заряженную поверхность. Было показано, что МВ, образованные тромбоцитами, имеют от 50 до 100 раз большую прокоагулянтную активность, чем сами тромбоциты (Sinauridze E. I. et al., 2007). Тромбоцитарные МВ предоставляют большее количество сайтов связывания для растворимых белков, имеющих сродство к ФС, а именно для протромбина, фактора VIIа, фактора IXа, фактора Xа, протеина С, протеина S, 2-гликопротеина и аннексина на единицу площади поверхности мембраны, чем активированные тромбоцитов (Diamant M. et al., 2004). МВ, выделенные из тромбоцитарных концентратов длительных сроков хранения, несут на своей поверхности фактор Va (Зубаиров Д. М., Зубаирова Л. Д., 2009). Установлено, что в условиях in vitro, мембраны МВ поддерживают более эффективное образование тромбина, чем мембраны тромбоцитов, с учетом поправки на единицу поверхности (Morel O. et al., 2006; Furie B., Furie B. C., 2008). Тромбоцитарные МВ могут передавать GPIIb-IIIa нейтрофилам, способствуя связыванию ими фибриногена и их адгезии к эндотелию (Salanova B. et al., 2007). Кроме того, тромбоцитарные МВ содержат на своей мембране огромное разнообразие функциональных эффекторов, таких как интегрины, Р-селектин, фактор Виллебранда и тромбоксан А2, которые могут быть переданы в клетки-мишени, способствуя процессу коагуляции (Patchipulusu S. et al., 2010). Образование МВ активированными тромбоцитами или лейкоцитами может способствовать дистанционной контакт-опосредованной активации других тромбоцитов и моноцитов, и тем самым поддерживать каскад активации.
Тромбоцитарные МВ могут проявлять и антикоагуляционную активность in vitro, стимулируя протеолитическую инактивацию протромбиназного кофактора Vа через активированный протеин C (АПС). После связывания с рецептором эндотелиального протеина С, АПС проявляет антикоагулянтные, противовоспалительные и антиапоптотические свойства путем инактивации коагуляционных факторов Vа и VIIIa. Было показано, что АПC может индуцировать высвобождение из эндотелиальных клеток МВ с антикоагулянтными свойствами, содержащих рецептор к эндотелиальному протеину С (Perez-Casal M. et al., 2005).
Стоит отметить, что не только МВ, выделенные тромбоцитами принимают участие в процессе коагуляции, но также МВ, выделенные эритроцитами и другими клетками, также обладают прокоагулянтными свойствами, благодаря наличию на их мембранах ФС (Diamant M. et al., 2004; Chung S. M. et al., 2007; van Beers E. J. et al., 2009). Хотя это остается спорным, но некоторые авторы утверждают, что МВ поддерживают процесс свертывания не только благодаря их отрицательно заряженным мембранам, но и экспрессируя на своей поверхности неактивные формы ТФ. Происхождение и механизм действия ТФ является предметом обсуждений, тем не менее, авторы предположили, что МВ могут быть его резервуаром (Osterud B. et al., 2009). Furie и соавторы определили «путь накопления МВ», как часть коагуляционного каскада (Furie B., Furie B. C., 2008). МВ могут быть связаны с формированием сгустков в сосудах и с высвобождением активного ТФ, который способствует усилению коагуляции. Было показано наличие ТФ на МВ, образованных эндотелием (Shet A. S. et al., 2003), тромбоцитами (Trappenburg M. C. et al., 2009; Mobarrez F. et al., 2010) и даже эритроцитами (Biro E. et al., 2003). Однако другие исследователи не обнаружили ТФ на эритроцитарных МВ (van Beers E. J. et al., 2009). Предполагается, что эти противоречия связаны с разным дизайном исследования, методами выделения МВ, и другими факторами. Можно заключить, что наиболее изученными, в настоящее время, являются МВ, имеющие тромбоцитарное происхождение. Это связано, с ведущей ролью в гемостазе именно тромбоцитов, а также с тем, что именно тромбоцитарные МВ были открыты первыми. Роль МВ, выделяемых другими видами клеток, в частности эритроцитами, в этом процессе остается мало изученной.
Микровезикуляция эритроцитов при патологических состояниях
Влияние МВ на фибринолитическую активность донорской БП определяли согласно инструкции к набору Фибринолиз-Тест («Технология Стандарт», Россия) на коагулометре.
Определение фибринолитической активности эритроцитарных МВ по скорости лизиса фибринового сгустка, полученного из эуглобулинов плазмы, проводили по следующей схеме:
Эуглобулины, получали из обработанной 0,05% каолином смеси БП и трис-HCl буфера (pH 7,4) в соотношении 1:1, в которую добавляли 180 мкл 1% уксусной кислоты и 7,5 мл дистиллированной воды. Смесь инкубировали в течение 30 мин. при +37 оС и затем центрифугировали при 650g в течение 6 мин. Эуглобулиновый осадок растворяли в трис-HCl буфере и добавляли 0,277% раствор СаСl2 в соотношении 1:1. Регистрировали время с момента добавления СаСl2 до полного растворения сгустка при +37 оС на коагулометре. В опыте вместо трис-HCl буфера к плазме добавляли МВ, ресуспендированные в трис-HCl буфере. Разница в скорости лизиса эуглобулинового сгустка, полученного без участия МВ и с МВ, характеризовала фибринолитическую активность МВ.
Определение фибринолитической активности эритроцитарных МВ, индуцированной стрептокиназой проводили следующим образом:
Эуглобулины плазмы получали описанным выше способом, но без добавления каолина. Инкубировали в течение 30 мин. при +4 оС и центрифугировали при 650g в течение 6 мин. Затем к раствору эуглобулинов добавляли 100 мкл стрептокиназы («Технология Стандарт», Россия.) и 100 мкл тромбина («Технология Стандарт», Россия.). Регистрировали время с момента добавления этих компонентов до полного растворения сгустка при +37 оС на коагулометре. Определяли время лизиса сгустка в опыте (с МВ, которые добавляли в донорскую плазму до добавления уксусной кислоты) и в контроле (без МВ). Кроме того, определяли влияние эритроцитарных МВ на хромогенный субстрат, оптическим способом согласно инструкции, к набору ХромоТех Плазминоген («Технология Стандарт», Россия) на спектрофотометре. Исследование проводили по следующей схеме: Опыт 1 (ОП 1):
В связи с тем, что цвет плазмы и эритроцитарных МВ, содержащих Hb, могут оказывать влияние на результаты спектрофотометрии, мы в начале исследования проводили уравнивание опорного значения при = 405 нм смесью, содержащей 250 мкл донорской плазмы, предварительно разведенной в 20 раз в трис-HCl буфере, 250 мкл суспензии МВ, приготовленных описанным выше способом в трис-HCl буфере, 250 мкл Трис-буфера (вместо стрептокиназы), 250 мкл хромогенного субстрата и 500 мкл 30% уксусной кислотой.
Далее мы проводили исследование влияния смеси эритроцитарных МВ и плазмы на расщепление хромогенного субстрата. К 250 мкл донорской плазмы, предварительно разведенной в 20 раз в трис-HCl буфере, добавляли 250 мкл суспензии МВ, приготовленных описанным выше способом в трис-HCl буфере, 250 мкл стрептокиназы, инкубировали 10 мин при +37 оС и добавляли 250 мкл хромогенного субстрата в трис-HCl буфере. Регистрировали ОП продуктов расщепления хромогенного субстрата под влиянием смеси эритроцитарных МВ и плазмы на спектрофотометре Spekol UV VIS (Zeiss, Германия) при = 405 нм через 2 мин. после добавления 500 мкл 30% уксусной кислоты напротив установленного ранее опорного значения.
Исследование влияния плазмы (без эритроцитарных МВ) на расщепление хромогенного субстрата проводили по описанной выше схеме (включая уравнивание опорного значения), но вместо суспензии эритроцитарных МВ использовали 250 мкл трис-буфера. Количество продуктов расщепления хромогенного субстрата под влиянием эритроцитарных МВ определяли по следующей формуле: ОП = ОП 1 - ОП 2 (1) 2.5 Методы оценки фибринолитической активности эритроцитарных микровезикул без добавления бестромбоцитарной плазмы
Исследовали фибринолитическую активность МВ, индуцированную стрептокиназой с помощью набора Фибринолиз-Тест («Технология Стандарт», Россия.). Эуглобулины получали из суспензии МВ, в которую добавляли 100 мкл фибриногена с концентрацией 1 мг/мл («Технология Стандарт», Россия), 7,5 мл дистиллированной воды и 180 мкл 1% уксусной кислоты. Инкубировали в течение 30 мин. при +4 оС и затем центрифугировали при 650g в течение 6 мин. Эуглобулиновый осадок растворяли в трис-HCl буфере. Затем к раствору эуглобулинов добавляли 100 мкл стрептокиназы и 100 мкл тромбина. Регистрировали время с момента добавления этих компонентов до полного растворения сгустка при +37 оС на коагулометре. Определяли время лизиса сгустка в опыте (с МВ) и в контроле (без МВ).
Определяли наличие в МВ активаторов плазминогена клотинговым методом: Эуглобулины получали описанным выше способом. К раствору эуглобулинов добавляли 100 мкл (1 M) плазминогена (Sigma, США) и 100 мкл тромбина (50 ед. NIH/мл) («Технология Стандарт», Россия.). Регистрировали время с момента добавления этих компонентов до полного растворения сгустка при +37 оС на коагулометре. Определяли время лизиса сгустка в опыте (с МВ) и в контроле (без МВ).
Фибринолитическую активность самих МВ, определяли оптическим методом ХромоТех-Плазминоген («Технология Стандарт», Россия.) с помощью хромогенного субстрата и стрептокиназы. Для этого к 500 мкл суспензии МВ, приготовленных описанным выше способом (с помощью центрифугирования и ультрацентрифугирования), добавляли 250 мкл стрептокиназы, инкубировали 10 мин при +37 оС и добавляли 250 мкл хромогенного субстрата в трис-HCl буфере. Регистрировали ОП на спектрофотометре при = 405 нм через 2 мин. после добавления 500 мкл 30% уксусной кислоты. В контроле вместо МВ использовали 250 мкл трис-буфера.
Для исключения влияния Hb МВ на результаты спектрофотометрии проводили уравнивание опорного значения смесью МВ с буфером (вместо стрептокиназы), хромогенным субстратом и уксусной кислотой.
Наличие в эритроцитарных МВ активаторов фибринолиза определяли с помощью хромогенного субстрата и плазминогена. Для этого к 500 мкл суспензии МВ, приготовленных описанным выше способом, добавляли 250 мкл (1 M) плазминогена (Sigma, США), инкубировали 10 мин при +37 оС и добавляли 250 мкл хромогенного субстрата в трис-HCl буфере. Регистрировали ОП на спектрофотометре при = 405 нм через 2 мин. после добавления 500 мкл 30% уксусной кислоты. В контроле вместо МВ использовали 250 мкл трис-буфера.
Для исключения влияния Hb МВ на результаты спектрофотометрии проводили уравнивание опорного значения смесью МВ с буфером (вместо плазминогена), хромогенным субстратом и уксусной кислотой.
Методы оценки фибринолитической активности эритроцитарных микровезикул без добавления бестромбоцитарной плазмы
Известно, что важнейшей причиной образования МВ является дестабилизация липидного комплекса мембраны родительской клетки. В результате этого происходит перераспределение фосфолипидов – нейтральные фосфолипиды (прежде всего ФХ) с внешней стороны мембраны переходят на внутреннюю, а несущие отрицательный заряд (например, ФС) – с внутренней на внешнюю. При этом мембрана, обогащенная ФС, приобретает дополнительный отрицательный заряд (Zwaal R. F., Schroit A. J., 1997). Ускорение коагуляции плазмы под действием эритроцитарных МВ, при этом, связано с тем, что имеющиеся на их мембранах фосфатидилсериновые кластеры предоставляют дополнительную каталитическую поверхность для внутренней и внешней теназы и протромбиназного комплекса. Это один из механизмов прокоагулянтного действия для МВ, предлагаемый рядом исследователей (Sinauridze E. I. et al., 2007; Rubin O. et al., 2010a). При этом больший эффект наблюдался под действием крупных МВ (р 0,05), что могло быть связано с большей площадью их мембран и, соответственно, большим количеством доступного ФС.
В значительно меньшей степени эритроцитарные МВ активировали внешний механизм гемостаза. В его реализации ключевую роль играет наличие ТФ. Большинство исследователей считают, что эритроциты не содержат на своей поверхности ТФ (Horne M. K. 3rd. et al., 2006; Tissot J. D. et al., 2010; Van Der Meijden P. E. et al., 2012). Хотя, есть данные, что мембраны эритроцитарных МВ несут ассоциированный ТФ (Biro E. et al., 2003). По нашим данным действие эритроцитарных МВ на внешний путь коагуляции плазмы было слабовыраженным. Одним из возможных объяснений этого может служить гипотеза, согласно которой ТФ на мембране МВ находится в «неактивной» форме (Furie B., Furie B. C., 2008). Таким образом, он может способствовать усилению коагуляции лишь при определенных условиях, после активации.
Результаты исследования конечного этапа свертывания крови показали, что эритроцитарные МВ обладают не только прокоагулянтными, но и антикоагулянтными свойствами. Увеличение времени коагуляции в данном случае может быть связано либо с замедлением процесса образования фибрин-мономеров, либо с замедлением их полимеризации.
Известно, что время рекальцификации плазмы отражает в целом её коагуляционную способность. Исходя из полученных данных, можно полагать, что сокращение времени рекальцификации плазмы в присутствии МВ, выделенных после 24-часовой инкубации эритроцитов, связано с активацией, прежде всего, внутреннего пути коагуляции. Замедление фибринообразования под действием МВ вносит, вероятно, менее значительный вклад в общий процесс свертывания плазмы крови.
При изучении действия эритроцитарных МВ на показатели свертывающей системы крови, кроме клотинговых мы использовали и инструментальные методы исследования. Для этого нами оценивалось влияние эритроцитарных МВ на показатели тромбоэластограммы (ТЭГ).
Как показали проведенные исследования, МВ, выделенные после 24-часовой инкубации эритроцитов, на 33% (р 0,05) уменьшали параметр «R» – отражающий время с момента, когда образец плазмы крови был помещен в анализатор, до момента образования первых нитей фибрина (Таблица 5).
Установлено, что влияние эритроцитарных МВ на параметр «К», характеризующий время с момента начала образования сгустка до достижения фиксированного уровня прочности сгустка, крайне незначительно и составило менее 5%. Кроме того, была отмечена разница между действием МВ на параметры «К» и «». С одной стороны, скорость образования сгустка (показатель «К»), имела тенденцию к замедлению, в то время как угол «», отражающий скорость роста фибриновой сети и ее стуктурообразование, увеличивался на 10% (р 0,05).
«МА» - максимальная амплитуда ТЭГ, характеризует максимальную прочность сгустка и зависит, прежде всего, от тромбодинамических свойств тромбоцитов и концентрации фибриногена. В связи с тем, что в нашем эксперименте исследовалась бедная тромбоцитами плазма, а концентрация фибриногена практически не менялась, разницы между опытом и контролем не отмечено (Таблица 5).
Известно, что показатель «R» характеризует активацию плазменных факторов свертывания и соответствует фазе инициации, включающей в себя активацию по внешнему и внутреннему механизму, результатом которой, является образование протромбиназы. В связи с тем, что мембрана МВ содержит отрицательно заряженный ФС, можно полагать, что усиление коагуляции плазмы под действием эритроцитарных МВ связано с тем, что имеющиеся на их мембранах фосфатидилсериновые кластеры предоставляют дополнительную каталитическую поверхность для внутренней и внешней теназы и
протромбиназного комплекса. Активация по внешнему пути свертывания крови реализуется при наличии ТФ. Полученные нами данные и данные литературы могут свидетельствовать либо об отсутствии его на мембранах эритроцитов, а отсюда – на высвобождающихся из них МВ (Van Der Meijden P. E. et al., 2012), либо о наличие его в «неактивной форме».
Известно, что параметры «К» и «» отражают конечный этап свертывания крови. Как показали проведенные исследования, тенденции эритроцитарных МВ на эти параметры были разнонаправленными. Можно предположить, что эритроцитарные МВ могут с одной стороны замедлять скорость генерации тромбина, а с другой – ускорять процесс образования нитей фибрина. Это в свою очередь может быть обусловлено влиянием эритроцитарных МВ или на антитромбиновую активность или на процесс полимеризации фибрин-мономеров. Однако с помощью тромбоэластографии оценить механизм действия эритроцитарных МВ на конечный этап свертывания не представляется возможным.
С целью выявления возможного действия МВ на процесс полимеризации фибрин-мономеров было проведено исследование влияния МВ эритроцитов на этот процесс. По нашим данным статистически значимой разницы между контролем (трис-HCl буфер) и опытом (суспензия эритроцитарных МВ) не выявлено. Это подтверждает выдвинутую гипотезу о том, что замедление конечного этапа коагуляции под действием эритроцитарных МВ, по-видимому, связано с наличием в них антитромбиновой активности. Подводя итог, можно заключить, что полученные результаты свидетельствуют о том, что эритроцитарные МВ обладают не только про-, но и антикоагуляционной активностью. Более подробно вопрос о наличии антикоагулянтной активности в эритроцитарных МВ будет рассмотрен в разделе «Влияние консервации эритроцитов на антитромбиновую активность выделенных из них микровезикул».
Изучение влияния консервации эритроцитов на коагуляционную активность выделенных из них микровезикул
Это проявлялось в снижении процентного содержания сильно деформированных (вытянутых в искусственном сдвиговом потоке) клеток на 7 сутки консервации – в среднем в 1,9 раза по отношению к свежевыделенным эритроцитам (р 0,05). В процессе консервации эритроцитов их деформируемость продолжала ухудшаться, а к 28 суткам она практически сравнивалась между неотмытыми и предварительно отмытыми эритроцитами, как по процентному содержанию деформированных, так и по количеству максимально вытянутых эритроцитов (Таблица 13, Рисунок 10,11).
Известно, что в процессе старения эритроциты теряют часть мембраны за счет образования МВ. Ключевым событием в этом процессе является ослабление взаимодействия между цитоскелетом и плазматической мембраной (Tissot J. D. et al., 2010). Центральную роль в этом играет повышение концентрации внутриклеточного Са2+, что ведет к ингибированию флиппазы, поддерживающей асимметрию липидов, активации скрамблазы, ответственной за обмен липидов между внутренней и внешней сторонами мембраны (Cerella C. et al., 2010). Менее изученным остается вопрос о роли увеличения концентрации мембранного Hb, прежде всего HbА1с, в образовании МВ. Особенно важной становится эта проблема при консервации эритроцитов, при которой происходит значительное увеличение везикуляции (Lawrie A. S. et al., 2009). В наших исследованиях показано, что в процессе консервации эритроцитов в них увеличивается концентрация HbА1с, причем в большей степени в предварительно отмытых эритроцитах. Можно полагать, что, вероятнее всего, это связано с повреждением эритроцитов при их отмывании, а отсюда – с более ранними и более выраженными изменениями, происходящими в процессе консервации. Образование МВ, по литературным данным, представляет собой защитный механизм для удаления молекул, связанных с участками мембраны эритроцита, в том числе и измененного мембраносвязанного Hb. Высказывается предположение, что связывание денатурированного Hb c Band 3 может вызывать снижение взаимодействия плазматической мембраны с цитоскелетом (Willekens F. L. et al., 2008). Известно, что разрушение связи плазматической мембраны с цитоскелетом является важным событием в образовании МВ (Piccin A. et al., 2007).
Процесс везикуляции значительно сильнее в отмытых эритроцитах, при этом в большей степени удаляется из эритроцитов и переходит в МВ связанный с мембранами HbА1с. Доля HbА1с в МВ, выделенных из эритроцитов в процессе их консервации, постоянно нарастает (р 0,05). Однако принципиальной разницы в содержании HbА1с по отношению к общему Hb, или выраженное в г/л в МВ, выделенных из отмытых и неотмытых эритроцитов, не обнаружено. Связано это, вероятно, прежде всего, с разницей в их концентрации. Количество МВ, выделенных из отмытых эритроцитов, как установлено нами, в 1,3 раза превышает количество МВ, выделенных из неотмытых эритроцитов на 7 сутки консервации (р 0,05), и в 1,5 раза – на 28 сутки консервации (р 0,05). При пересчете концентрации HbА1с на равное число МВ оказывается, что она значительно выше в МВ, выделенных из отмытых эритроцитов. Это подтверждает важную защитную роль образования МВ для предотвращения удаления эритроцитов из кровотока (Bosman G. J. et al., 2005). В условиях банка крови МВ не удаляются, что приводит к их накоплению. Это может играть определенную роль в возникновении посттрансфузионных осложнений (Koch C. G. et al., 2008; Spinella P. C. et al., 2009).
Разница в степени увеличения концентрации HbА1с в эритроцитах и в их мембранах, выраженная в г/л и в процентах по отношению к общему Hb, объясняется следующим. В процессе консервации размер эритроцитов существенно уменьшается, о чем свидетельствуют результаты наших морфологических исследований (количество сфероцитов к 28 суткам консервации в неотмытых эритроцитах выросло в 13,5 раз по сравнению с контролем (р 0,05), а в неотмытых в 6 раз по сравнению с контролем (р 0,05)) (Таблица 15), и при центрифугировании суспензии эритроцитов осаждается большее число консервированных эритроцитов, по сравнению со свежевыделенными. Поэтому увеличение концентрации HbА1с в эритроцитах и их мембранах в процессе консервации, выраженное в г/л, происходит в большей степени, чем выраженное в процентах по отношению к общему Hb (р 0,05).
Одним из проявлений изменения эритроцитов в процессе консервации является ухудшение их деформируемости (Cluitmans J. C. et al., 2012; Frank S. M. et al., 2013). В связи с существенной ролью Hb, особенно HbА1с, в деформируемости эритроцитов (Cluitmans J. C. et al., 2012), изучение ее и взаимосвязь с содержанием общего и мембранносвязанного Hb в процессе консервации красных клеток крови представляется важным и актуальным.
При исследовании динамики деформируемости эритроцитов в процессе их консервации установлено ее прогрессивное и значительное снижение, причем более выраженное в предварительно отмытых и хранящихся в консерванте эритроцитах (р 0,05). Одной из причин этой разницы является, по-видимому, нарушение структуры мембран эритроцитов, связанное с более значительным образованием МВ в отмытых эритроцитах. В условиях in vivo этот процесс носит защитный характер и снижает скорость их удаления из кровотока, а в условиях банка крови на первый план в изменении деформируемости выступает уменьшение объема эритроцитов, связанное с потерей части мембраны на образование МВ. Ухудшение деформируемости эритроцитов в процессе их консервации, вероятно, происходит параллельно с увеличением гликирования Hb как в самих эритроцитах, так и в их мембранах. Еще в 1987 году было показано, что существенным фактором ухудшения деформируемости эритроцитов при сахарном диабете является значительное увеличение внутриэритроцитарной вязкости, связанное с изменением свойств Hb вследствие его гликирования (Sorette M. P. et al., 1987). Такой же процесс происходит, как показано нами, и при консервации эритроцитов. Не менее важную роль в снижении деформируемости эритроцитов играет повышение содержания HbА1с в мембранах эритроцитов при их консервации, что обуславливает ухудшение их вязкоэластических свойств. Нами установлена высокая корреляционная взаимосвязь между изменением деформируемости эритроцитов и содержанием HbA1c, как в самих эритроцитах, так и в их мембранах. В процессе консервации красных клеток крови сильная корреляционная связь выявлена между деформируемостью эритроцитов в процессе консервации и изменением концентрации HbА1с как в самих эритроцитах, так и в мембранах отмытых эритроцитов r = –0,95 (р 0,05). Чуть меньший коэффициент корреляции выявлен между этими показателями в неотмытых эритроцитах r = –0,87 (р 0,05).