Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 12
2.1 Функциональные особенности первичной соматосенсорной коры в процессе развития 12
2.1.1 Общее представление о формировании первичной соматосенсорной коры в онтогенезе 12
2.1.2 Апоптоз и механизмы его предотвращения 16
2.1.3 Типы электрической активности коры в период раннего развития 22
2.2 Эффекты и мишени действия этанола в нервной системе 27
2.2.1 Метаболизм этанола 27
2.2.2 Клеточные мишени действия этанола 31
2.2.3 Нарушения ЦНС, возникающие в результате пренатального воздействия этанола 35
2.2.4 Апоптогенные эффекты этанола на развивающийся мозг 40
2.3 Влияние общих анестетиков (изофлурана, кетамина, мидазолама) на развивающийся мозг 45
2.3.1 Наркоз новорожденных и детей младшего возраста 45
2.3.2 Мишени и механизмы действия общих анестетиков
2.3.2.1 Влияние кетамина на НМДА рецепторы и процессы нейродегенерации в неонатальном периоде 47
2.3.2.2 ГАМК рецепторы как мишень действия мидазолама 49
2.3.2.3 Апоптогенное воздействие комбинации общих анестетиков на ранних этапах развития 50
2.3.2.4 Влияние изофлурана на развивающийся мозг 51
3 Материалы и методы исследования 54
3.1 Подготовка животного к эксперименту 54
3.2 Внеклеточная регистрация электрической активности 55
3.3 Анализ данных 57
3.4 Статистика 59
3.5 Определение токсичных доз и концентраций этанола в крови з
3.6 Выявление нейроапоптогенных эффектов этанола в первичной
соматосенсорной коре крыс 60
4 Результаты исследования 62
4.1 Особенности электрической активности соматосенсорной коры крыс в течение первой недели жизни 62
4.2 Влияние этанола на электрическую активность и апоптоз в первичной соматосенсорной коре крыс
4.2.1 Токсикология и определение концентраций этанола в крови новорожденных крыс 64
4.2.2 Исследование влияния физиологического раствора на параметры электрической активности первичной соматосенсорной коры новорожденных крыс 67
4.2.3 Эффекты этанола на спонтанную электрическую активность первичной соматосенсорной коры крыс 68
4.2.4 Влияние этанола на сенсорно вызванную электрическую активность первичной соматосенсорной коры крыс 77
4.2.5 Исследование влияния этанола на апоптоз нейронов в первичной соматосенсорной коре крыс 84
4.3 Влияние общих анестетиков на электрическую активность первичной соматосенсорной коры крыс 90
4.3.1 Эффекты изофлурана на спонтанную электрическую активность первичной соматосенсорной коры крыс 90
4.3.2 Влияние изофлурана на сенсорно вызванную электрическую активность первичной соматосенсорной коры крыс 96
4.3.3 Исследование влияния комбинированного введения кетамина и мидазолама на электрическую активность первичной соматосенсорной коры новорожденных крыс 101
Обсуждение результатов 106
Выводы 117
Список литературы 118
- Нарушения ЦНС, возникающие в результате пренатального воздействия этанола
- Влияние кетамина на НМДА рецепторы и процессы нейродегенерации в неонатальном периоде
- Анализ данных
- Влияние изофлурана на сенсорно вызванную электрическую активность первичной соматосенсорной коры крыс
Введение к работе
Актуальность темы исследования
В настоящее время исследование особенностей развивающегося мозга и факторов, влияющих на нормальное функционирование нейрональных сетей в онтогенезе, является актуальной проблемой нейрофизиологии. Известно, что физиологический апоптоз во время критического периода развития нервной системы является необходимым условием для формирования нейрональных связей, путей и структур (Buss et al., 2006; Oppenheim et al., 1991). Вместе с тем массивная нейродегенерация, вызываемая различными повреждающими факторами, может привести как к морфологическим нарушениям, так и долговременным функциональным изменениям мозга и, как следствие, поведения (Rohn et al., 2009; Ribe et al., 2008; Mattson et al., 2006; Viswanath et al., 2001). Накопленные за последние десятилетия данные свидетельствуют о том, что вещества, которыми иногда злоупотребляют беременные женщины, такие как алкоголь, кетамин и бензодиазепины, а также некоторые классы лекарственных средств, часто используемых в педиатрии и у беременных, в том числе общие анестетики и антиэпилептические медикаменты на ранних этапах развития могут оказывать опасные вторичные эффекты, включая массивную запрограммированную смерть клеток мозга (Creeley et al., 2013; Lveill et al., 2010; Patel et al., 2009; Jevtovic-Todorovic et al., 2003; Ikonomidou et al., 2000). Так, воздействие этанола на этапе внутриутробного развития человека может привести к целому ряду нейроповеденческих дефектов, клинически объединяемых в фетальный алкогольный спектр нарушений, который может быть диагностирован с раннего детства, при этом его симптомы зачастую сохраняются на протяжении всей жизни (Sadrian et al., 2013). Фетальный алкогольный синдром является наиболее тяжелым состоянием, включающим характерные черепнолицевые пороки, замедление роста и аномалии развития нервной системы (Jones et al., 1973).
Первая неделя жизни у грызунов является ранней стадией «быстрого развития мозга», во время которой с наибольшей скоростью происходят морфологическая и функциональная дифференциация нейронов, а также формирование синаптических связей (Ben-Ari et al., 2001). Данный период приблизительно соответствует периоду от 20 до 30 недель гестации человеческого плода (Clancy et al., 2007; Clancy et al., 2001; Dobbing et al., 1979). Физиологическая активность в развивающемся мозге характеризуется уникальными паттернами электрической активности (Colonnese et al., 2012; Blankenship et al., 2010; Khazipov et al., 2006). У крыс во время первой недели после рождения активность коры головного мозга представлена вспышками осцилляторной активности в альфа-бета и гамма частотных диапазонах (Yang et al., 2013; Minlebaev et al., 2011; Yang et al., 2009; Khazipov et al., 2004), генерируемых в нейрональных таламокортикальных сетях, при этом в сенсорных зонах коры они эффективно запускаются входами с сенсорной периферии (Khazipov et al., 2004). Схожие паттерны активности характерны и для человеческого мозга во время второй половины внутриутробного развития (Colonnese et al., 2010; Andr et al., 2010; Milh et al., 2007). Мозг новорожденных
грызунов в этот временной промежуток так же, как и внутриутробно развивающийся мозг приматов особенно чувствителен к апоптогенным воздействиям этанола и общей анестезии (Olney, 2014; Creeley et al., 2013).
Известно, что ранняя нейрональная активность не только играет роль в синаптической пластичности, но и способствует выживанию нейронов, предотвращая апоптоз в процессе развития (Lveill et al., 2010; Heck et al., 2008; Mennerick et al., 2000). Действительно, вещества, ингибирующие рецепторы N-метил-D-аспарагиновой кислоты (НМДА) и усиливающие функции рецепторов гамма-аминомасляной кислоты (ГАМК), вызывали массивный апоптоз в мозге у новорожденных грызунов и у приматов в процессе внутриутробного развития (Olney, 2014; Jevtovic-Todorovic et al., 2003; Ikonomidou et al., 2000; Ikonomidou 1999).
Несмотря на интенсивные исследования мишеней действия этанола и общих анестетиков, данные об эффектах данных веществ на электрическую активность мозга в ранний период развития in vivo отсутствуют. С учетом критического влияния активности нейронов на выживание и нормальное формирование синаптических связей исследование нейротоксического воздействия этанола и общей анестезии на электрическую активность развивающегося мозга, несомненно, является актуальной задачей нейробиологии развития.
Цель исследования – изучение влияния этанола и общей анестезии на спонтанную и сенсорно вызванную электрическую активность первичной соматосенсорной коры головного мозга крыс.
В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:
-
Исследовать возрастную и концентрационную зависимость воздействия этанола на электрическую активность и апоптоз в первичной соматосенсорной коре крыс.
-
Охарактеризовать эффекты ингаляционного анестетика изофлурана на спонтанную и сенсорно вызванную электрическую активность первичной соматосенсорной коры крыс в процессе развития.
-
Изучить влияние комбинированного введения общих анестетиков кетамина и мидазолама на электрическую активность первичной соматосенсорной коры крыс в течение первой недели жизни.
Научная новизна работы
В настоящей работе впервые было показано, что этанол подавляет спонтанную активность, а также сенсорно вызванные осцилляторные вспышки активности в первичной соматосенсорной коре новорожденных крыс в течение первой недели после рождения. В этот же период развития апоптоз, инициируемый этанолом, достигает своего пика. При этом наблюдается корреляция данных электрофизиологических экспериментов с концентрационной зависимостью апоптогенных эффектов этанола. Также впервые выявлено, что общие анестетики – изофлуран, кетамин и мидазолам угнетают электрическую активность в первичной соматосенсорной коре новорожденных крыс. При этом было показано, что эффекты изофлурана качественно отличаются у животных первой недели жизни и более взрослых особей. Так, на протяжении первой постнатальной недели изофлуран полностью угнетал спонтанную электрическую активность коры и подавлял сенсорно вызванные ранние осцилляторные
паттерны, в то время как у животных старших возрастов анестетик вызывал специфические паттерны эпилептиформных разрядов, чередующихся с периодами подавления активности. Кроме того, впервые показано, что комбинированное введение кетамина и мидазолама в дозах, эквивалентных применяемым при хирургической анестезии, вызывает практически полное подавление спонтанной электрической активности, а также значительное снижение осцилляторной составляющей вызванного сенсорной стимуляцией ответа в соматосенсорной зоне коры головного мозга новорожденных крыс.
Научно-практическая ценность работы
Полученные в работе данные имеют как фундаментальное, так и прикладное значение. Поскольку период первой недели после рождения крысы приблизительно соответствует периоду от 20 до 30 недель гестации человеческого плода (Clancy et al., 2007; Clancy et al., 2001; Dobbing et al., 1979), мозг новорожденных грызунов в этот временной промежуток, как и внутриутробно развивающийся мозг приматов, особенно чувствителен к апоптогенным воздействиям этанола и общей анестезии. Полученные результаты раскрывают причины нейротоксических эффектов продолжительной экспозиции к этанолу и анестетикам на ранних этапах развития, сопровождающейся возникновением долговременных психоневрологических нарушений. В настоящем исследовании приведено доказательство в пользу гипотезы о том, что в основе нарушений развития нервной системы, возникающих в результате воздействия этанола и общих анестетиков, может лежать подавление электрической активности, что является механизмом, стимулирующим апоптоз, и приводит к гибели значительного количества нейронов.
Кроме того, полученные данные могут иметь значение для практической медицины. Поскольку процедуры анестезии становятся все более сложными и продолжительными, минимизация рисков, возникающих в процессе использования общих анестетиков, является одним из наиболее важных аспектов в клинической практике. Полученные в настоящей работе данные предполагают возможность проведения дальнейших трансляционных исследований влияния препаратов общей анестезии на активность мозга плода и недоношенных новорожденных, что позволит отслеживать потенциально опасные эффекты для здоровья плода и новорожденного. Аналогично, выявленное в настоящем исследовании ингибирующее воздействие этанола на электрическую активность неонатального мозга, коррелирующее с его апоптогенными эффектами, предполагает возможность оценки потенциально повреждающего действия алкоголя на мозг плода и новорожденного посредством анализа изменений параметров кортикальной активности мозга.
Методы исследования
Исследование электрической активности мозга крыс, возникающей спонтанно и в ответ на сенсорную стимуляцию, проводилось с использованием электрофизиологических внутрикортикальных регистраций в условиях in vivo. Внеклеточная регистрация активности в области представительств конечностей и вибрисс первичной соматосенсорной коры крыс осуществлялась с помощью многоканальных электродов на кремниевой основе. Для характеристики нейроапоптогенных эффектов этанола в период постнатального развития крыс
применялся иммуногистохимический метод выявления активированной каспазы-3 и апоптотического разрушения ядер нейронов с помощью ДНК красителя DAPI.
Достоверность полученных данных
Достоверность полученных данных основана на большом объеме результатов экспериментальных исследований с использованием адекватных методологических подходов и статистической обработки результатов.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Этанол оказывает ингибирующие эффекты на электрическую активность первичной соматосенсорной коры мозга крыс, которые характеризуются концентрационной и возрастной зависимостями. Подавление кортикальной активности максимально выражено в период первой постнатальной недели, что коррелирует со степенью апоптотической нейродегенерации, возникающей в результате воздействия этанола.
-
Изофлуран полностью угнетает электрическую активность первичной соматосенсорной коры крыс во время первой постнатальной недели, при этом эффекты анестетика изменяются в процессе развития от полного ингибирования до инициации паттернов эпилептиформных разрядов, чередующихся с периодами подавления активности.
-
Общая анестезия с использованием комбинированного введения кетамина и мидазолама приводит к практически полному подавлению электрической активности в первичной соматосенсорной коре головного мозга новорожденных крыс.
Личный вклад диссертанта в исследования
Приведенные в работе данные получены при личном участии соискателя на всех этапах работы, включая составление плана исследования, проведение экспериментов, обработку полученных данных и оформление публикаций.
Апробация и реализация результатов исследования
Основные результаты диссертационной работы представлены на Международных научных конференциях Казанского федерального университета «From Neuron to Brain» (Казань, 2013), «Современные технологии в нейробиологии» (Казань, 2013) и «Трансляционная медицина, настоящее и будущее» (Казань, 2016); научно-практической конференции Института высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН «Доклинические исследования: современные методы и возможности» (Москва, 2014); Международной научной конференции «Science of the Future» (Санкт-Петербург, 2014).
По теме диссертации опубликовано 13 печатных работ, в том числе – 5 статей в ведущих рецензируемых научных журналах, включенных в систему цитирования Web of Science и рекомендованных ВАК.
Работа выполнена при поддержке грантом Правительства РФ ведущим ученым №11.G34.31.0075, грантом РФФИ № 14-04-31344, а также программы повышения конкурентоспособности Казанского (Приволжского) федерального университета.
Структура и объём диссертации
Диссертация изложена на 145 страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания методики исследования, результатов, их обсуждения, выводов, списка сокращений и условных обозначений, а также списка
цитируемой литературы. Диссертация иллюстрирована 30 рисунками и 1 таблицей. Список цитируемой литературы включает 272 источника, из них 272 – иностранных авторов.
Нарушения ЦНС, возникающие в результате пренатального воздействия этанола
Целью настоящего исследования являлось изучение влияния этанола и общей анестезии на спонтанную и сенсорно вызванную электрическую активность первичной соматосенсорной коры головного мозга крыс.
В соответствии с целью были поставлены следующие задачи: Исследовать возрастную и концентрационную зависимость воздействия этанола на электрическую активность и апоптоз в первичной соматосенсорной коре крыс. Охарактеризовать эффекты ингаляционного анестетика изофлурана на спонтанную и сенсорно вызванную электрическую активность первичной соматосенсорной коры крыс в процессе развития. Изучить влияние комбинированного введения общих анестетиков кетамина и мидазолама на электрическую активность первичной соматосенсорной коры крыс в течение первой недели жизни. Научная новизна работы
В настоящей работе впервые было показано, что этанол подавляет спонтанную активность, а также сенсорно вызванные осцилляторные вспышки активности в первичной соматосенсорной коре новорожденных крыс в течение первой недели после рождения. В этот же период развития апоптоз, инициируемый этанолом, достигает своего пика. При этом наблюдается корреляция данных электрофизиологических экспериментов с концентрационной зависимостью апоптогенных эффектов этанола. Также впервые выявлено, что общие анестетики – изофлуран, кетамин и мидазолам угнетают электрическую активность в первичной соматосенсорной коре новорожденных крыс. При этом было показано, что эффекты изофлурана качественно отличаются у животных первой недели жизни и более взрослых особей. Так, на протяжении первой постнатальной недели изофлуран полностью угнетал спонтанную электрическую активность коры и подавлял сенсорно вызванные ранние осцилляторные паттерны, в то время как у животных старших возрастов анестетик вызывал специфические паттерны эпилептиформных разрядов, чередующихся с периодами подавления активности. Кроме того, впервые показано, что комбинированное введение кетамина и мидазолама в дозах, эквивалентных применяемым при хирургической анестезии, вызывает практически полное подавление спонтанной электрической активности, а также значительное снижение осцилляторной составляющей вызванного сенсорной стимуляцией ответа в соматосенсорной зоне коры головного мозга новорожденных крыс.
Научно-практическая ценность работы
Полученные в работе данные имеют как фундаментальное, так и прикладное значение. Поскольку период первой недели после рождения крысы приблизительно соответствует периоду от 20 до 30 недель гестации человеческого плода [18–20], мозг новорожденных грызунов в этот временной промежуток, как и внутриутробно развивающийся мозг приматов, особенно чувствителен к апоптогенным воздействиям этанола и общей анестезии. Полученные результаты раскрывают причины нейротоксических эффектов продолжительной экспозиции к этанолу и анестетикам на ранних этапах развития, сопровождающейся возникновением долговременных психоневрологических нарушений. В настоящем исследовании было приведено веское доказательство в пользу гипотезы о том, что в основе нарушений развития нервной системы, возникающих в результате воздействия этанола и общих анестетиков, может лежать подавление электрической активности, что является механизмом, стимулирующим апоптоз, и приводит к гибели значительного количества нейронов. Кроме того, полученные данные могут иметь значение для практической медицины. Поскольку процедуры анестезии становятся все более сложными и продолжительными, минимизация рисков, возникающих в процессе использования общих анестетиков, является одним из наиболее важных аспектов в клинической практике. Полученные в настоящей работе данные предполагают дальнейшие трансляционные исследования влияния препаратов общей анестезии на активность мозга плода и недоношенных новорожденных, что позволит отслеживать потенциально опасные эффекты для здоровья плода и новорожденного. Аналогично, выявленное в настоящем исследовании ингибирующее воздействие этанола на электрическую активность неонатального мозга, коррелирующее с его апоптогенными эффектами, предполагает возможность оценки потенциально повреждающего действия алкоголя, которым иногда злоупотребляют беременные женщины, на мозг плода и новорожденного, посредством мониторинга активности мозга.
Методы исследования
Исследование электрической активности мозга крыс, возникающей спонтанно и вызванной сенсорной стимуляцией, проводилось с использованием электрофизиологических внутрикортикальных регистраций в условиях in vivo. Посредством многоканальных электродов на кремниевой основе осуществлялась регистрация внеклеточной активности в области представительств конечностей и вибрисс первичной соматосенсорной коры крыс. Для характеристики нейроапоптогенных эффектов этанола в период постнатального развития крыс применялся иммуногистохимический метод выявления активированной каспазы-3 и выявление апоптотического разрушения ядер нейронов с помощью ДНК красителя DAPI.
Влияние кетамина на НМДА рецепторы и процессы нейродегенерации в неонатальном периоде
Новая кора (неокортекс) млекопитающих, состоящая из шести слоев, функционально и анатомически может быть поделена на несколько зон, включая три первичных сенсорных области: первичную соматосенсорную кору, первичную зрительную кору и первичную слуховую кору [41].
В первичной соматосенсорной коре (S1) головного мозга происходит обработка тактильной, проприоцептивной и болевой информации, поступающей от тела. У взрослых крыс S1 организована в виде топографической карты тела и является самой большой сенсорной областью [41]. Известно, что существует точное топографическое соответствие между периферической частью соматосенсорной системы и кортикальными картами коры головного мозга [42, 43], однако вопросы о том, каким образом устанавливается это соответствие, а также, какова роль внутренних генетических механизмов и внешней сенсорно управляемой активности в формировании архитектонических и функциональных карт, на протяжении долгого времени являются актуальными вопросами нейробиологии [41, 44, 45].
В качестве модельной системы для изучения развития соматосенсорной коры головного мозга, а также ее организации широко используется бочоночная кора (баррел кортекс) грызунов, кроме того, данная модель применяется для выявления механизмов обработки и передачи корктикальной информации [46, 47]. Баррел кортекс содержит упорядоченно расположенные клеточные скопления в виде бочонков (баррелов), находящиеся в четвертом слое (L4) соматосенсорной коры, при этом каждый баррел, связан с определенной ограниченной областью поверхности тела. Заднемедиальная часть баррел кортекса, физиологически связанная с вибриссами [48], состоит из пяти четко определяемых рядов баррелов, соматотопически соответствующих пяти рядам больших вибрисс, расположенных на контралатеральной стороне головы. Каждый баррел в ряду, являющийся представительством одной вибриссы, отделен от соседней с помощью промежуточных пространств, называемых септами (перегородками). Кроме того, были определены области представительств нижней губы, щек и конечностей [49], а также зона, предположительно ассоциированная с туловищем [47].
Представительство конечностей в S1 грызунов получает соматотопический вход от ладонной и тыльной поверхностей конечностей. Ладонная поверхность характеризуется четырьмя хорошо развитыми пальцами и одним небольшим, а также тремя подушечками, их возвышениями и большой областью ладони. Каждая часть ладонной поверхности кожи соответствует отдельным баррелам в представительстве конечностей S1 [46, 47, 49], что делает данную систему полезной для изучения взаимосвязи между периферией и корой головного мозга.
Размер представительства той или иной части тела в контралатеральной области S1 зависит от плотности иннервации и степени ее использования [41, 43]. Например, несмотря на то, что вибриссы крыс занимают небольшой участок поверхности тела, они сильно иннервированы и служат в качестве основных эффекторов для сенсомоторного исследования. Таким образом, представительство вибрисс доминирует в S1 головного мозга крыс [41].
Развитие топографических карт у крыс представляет особый интерес в виду значительных изменений, которые происходят в головном мозге и в организме в течение раннего постнатального периода. На протяжении первых трех недель жизни вес крысы увеличивается в четыре раза, при этом размер, форма и ориентация ее тела кардинально меняется. Во время раннего постнатального развития происходят также нейрохимические изменения. Наиболее значительным является изменение функции гамма-аминомасляной кислоты (ГАМК) с возбуждающей на тормозную [50]. В результате возникновения кортикального торможения может происходить ограничение и перенаправление сигналов некоторых «неадекватно» ориентированных нейронов во всем пространстве S1, что приводит к усовершенствованию топографического соответствия.
Известно, что нейрогенез в основном завершается ко дню рождения, однако процесс миграции нейронов достаточно интенсивно идет в первую неделю после рождения [41]. Считается, что первая неделя жизни у грызунов является ранней стадией «быстрого развития мозга». В это время с наибольшей скоростью происходят морфологическая и функциональная дифференциация нейронов, а также формирование синаптических связей и усиление процесса синаптогенеза [17]. Данный период приблизительно соответствует периоду от 20 до 30 недель гестации человеческого плода, поскольку в отличие от крыс, формирование соматосенсорных карт представительства различных участков тела у человека в норме происходит еще внутриутробно [18–20]. В связи с этим организация коры головного мозга недоношенных и доношенных детей существенно отличается. Кроме того, известно, что в перинатальный и постнатальный периоды развития человека кора претерпевает значительную структурную и функциональную реорганизацию [51].
Анализ данных
На протяжении нескольких последних десятилетий продолжается интенсивное изучение причин и механизмов разрушительного воздействия на развивающийся мозг человека древнейшего анестетика, а также самого распространенного в мире наркотика – этанола.
Наиболее важными факторами, которые могут влиять на степень острой алкогольной интоксикации, помимо количества употребленного этанола, веса тела и индивидуальной толерантности к алкоголю, являются период его употребления, а также процент содержания спирта в напитке [104, 105]. Алкогольная интоксикация может оказывать эффекты на поведение, сердечнососудистую систему, желудочно-кишечный тракт, органы дыхания и процессы метаболизма [104–107]. Симптомы интоксикации обычно связаны с концентрацией этанола в крови. При концентрации этанола в крови выше 300 мг/дл (65,1 мМ/л), существует повышенный риск угнетения дыхания и сердцебиения. Смерть при острой алкогольной интоксикации, как правило, наступает при концентрации этанола в крови выше 500 мг/дл (108,5 мМ/л), однако смертельная доза может варьировать, в частности, смертельные случаи наблюдались при более низких уровнях этанола в крови (300 мг/дл; 65,1 мМ/л) у субъектов, не обладающих толерантностью к этанолу, а также наблюдались случаи выживаемости при более высоких уровнях ( 1200 мг/дл; 260.4 мМ/л) [105]. Вместе с тем, у больных с алкогольной зависимостью, обладающих толерантностью к алкоголю в результате его неоднократного воздействия, эти эффекты могут ослабляться [108]. Предполагается, что данное явление связано с компенсационными изменениями возбуждающей функции НМДА и ингибирующей функции ГАМК [108].
Этанол (CH3CH2OH) представляет собой водо- и жирорастворимое соединение, которое способно диффундировать во все органы, быстро проникая через клеточные мембраны, в результате чего происходит уравновешивание его внутри- и внеклеточных концентраций [106, 109]. Поглощение этанола происходит в основном в проксимальном отделе желудочно-кишечного тракта, в частности, в желудке (70%) и в двенадцатиперстной кишке (25%) [106]. Алкогольдегидрогеназа (АДГ) желудка отвечает за 10% метаболизма этанола и имеет существенные различия гендерного характера [110]. Остальные 90% поглощаемого этанола метаболизируются в ацетальдегид (высокотоксичный промежуточный продукт метаболизма этанола, образующийся в результате первого этапа его окисления) в печени посредством трех ферментативных путей: (1) АДГ печени (90%), (2) микросомальной этанол-окислительной системы (8-10%) и (3) каталазы (0-2%) [111]. Кроме того, имеются сведения о том, что метаболизм этанола происходит локально в мозге [112]. Однако соотношение вклада ферментативных механизмов в процесс окисления этанола в мозге остается до конца неясным. Несмотря на то, что ацетальдегид, образующийся в результате метаболизма этанола в печени, способен проникать через гематоэнцефалический барьер, он не достигает головного мозга в значительном количестве в основном из-за присутствия альдегиддегидрогеназы в микроциркуляторном русле мозга. Поэтому ацетальдегид, образующийся в периферических отделах в результате умеренного потребления этанола, быстро метаболизируется в гематоэнцефалическом барьере и не проникает в мозг [113]. Однако было показано, что после потребления этанола, данный метаболит также образуется непосредственно в мозге [112, 114]. Ферментативный механизм, необходимый для метаболизма этанола в головном мозге, состоит из нескольких ферментов (каталазы, цитохрома P450 2E1 (CYP2E1) и АДГ), которые также участвуют в метаболизме этанола в печени [113]. В отличие от печени, определяющее значение в окислении этанола в головном мозге имеет фермент каталаза (60%), при этом АДГ мозга не принимает существенного участия в процессах его метаболизма [114]. CYP2E1 имеет более низкую каталитическую эффективность в процессах окисления этанола, чем каталаза, однако данный цитохром инициируется этанолом и его вклад в метаболизм этанола в мозге увеличивается вследствие хронического употребления этанола [114]. Дальнейшую трансформацию ацетальдегида в менее токсичное соединение – ацетат опосредует альдегиддегидрогеназа, присутствующая во всех клеточных компартментах [115]. Вместе с тем, этанол метаболизируется неокислительным путем с образованием этиловых эфиров жирных кислот в результате действия синтазы этиловых эфиров жирных кислот, однако данный механизм играет незначительную роль в кинетике элиминации этанола [113, 116]. Кроме биотрансформации путем метаболических реакций, этанол может быть выведен без изменений с помощью выделений через кожу, легкие и почки. Кожная элиминация, как правило, незначительна (0,1%) и может зависеть от состояния гидратации и уровня активности [117]. Количество этанола, выводимого за счет легочных выделений у взрослого человека, составляет от 0,7 до 3% при низких концентрациях этанола и от 6 до 8% при более высоких концентрациях; элиминация посредством почечной экскреции составляет от 0,3 до 10% [113, 116]. Поскольку этанол является широко известным тератогенным фактором для плода, важно отметить, что спустя 1-2 часа после употребления этанола беременной женщиной концентрация этанола в крови плода становится практически эквивалентной его концентрации в крови матери [118]. Пренатальное воздействие этанола наносит особенно значительный вред ЦНС в связи с продолжительностью периода ее развития, при этом патофизиологические механизмы этого воздействия остаются в полной мере неизученными.
Элиминация этанола плодом нарушается по причине сниженного метаболического потенциала. Ферменты, используемые плацентой, плодом и новорожденным в процессах метаболизма этанола, аналогичны материнским, однако их концентрации и уровни активности отличаются. Несмотря на то, что плацента является метаболически активным органом, она способна метаболизировать лишь незначительное количество этанола, что приводит к неограниченной диффузии этанола через плаценту к плоду [119]. Скорость окисления этанола плацентой в 3900 раз ниже скорости окисления спирта в печени взрослого человека [119]. После проникновения этанола в кровь плода он усваивается посредством механизмов, аналогичных тем, которые использует взрослый организм, однако фетальная метаболическая емкость сильно снижена и функционирует при скорости, составляющей приблизительно 5-10% от активности взрослого организма, что объясняется меньшим количеством, а также пониженной активностью ферментов P450 в печени, что ограничивает способность плода использовать микросомальное окисление для удаления этанола [116, 120]. Таким образом, вследствие неэффективности фетальных процессов метаболизма этанола, его выведение из организма плода зависит от метаболических способностей матери.
Влияние изофлурана на сенсорно вызванную электрическую активность первичной соматосенсорной коры крыс
В экспериментах по определению токсичных доз этанола было использовано 78 крыс в возрасте P1-7. Инъекции этанола (20% в физиологическом растворе, в/б) производились одиннадцати группам животных в концентрациях: 2,5; 3,7; 6; 6,7; 7,4; 8,2; 9; 11; 12,5; 13,7 и 15 г/кг. Наблюдение за крысами осуществлялось в течение 6 часов с момента введения вещества.
Отдельной группе животных вводился этанол (20%, в/б) в концентрации 6 г/кг с целью исследования его влияния на уровень насыщения кислородом (SpO2) частоту дыхания и сердечный ритм посредством пульсового оксиметра MouseOx (Starr Life Science, США). Измерение параметров оксигенации артериальной крови производилось в период максимального эффекта этанола в течение 1 часа.
Для определения концентраций этанола в крови крыс было использовано 25 животных в возрасте от Р5 до Р7. Инъекции этанола (20% в физиологическом растворе, в/б) производились в концентрациях: 1 г/кг, 1+3 г/кг (с интервалом в 1 час) и 6 г/кг. Каждая концентрация вводилась 8 крысам. Контрольным животным инъецировали физиологический раствор (в/б) в объеме, эквивалентном объему вводимого этанола. Каждая группа была поделена на 2 подгруппы по 4 крысы. У животных первой подгруппы интракардиальный забор крови осуществлялся через 1 час после инъекции этанола, у животных второй подгруппы – через 4 часа. Полученные образцы крови перемещались в вакуумные пробирки и замораживались. Затем они отправлялись на химическое исследование с целью количественного определения этанола в крови в судебно-химическое отделение Государственного автономного учреждения здравоохранения «Республиканское бюро судебно-медицинской экспертизы Министерства здравоохранения Республики Татарстан». Исследование проводилось с помощью газового хроматографа «Кристаллюкс-4000М» (НПФ «Мета-хром», Россия).
Характеристика нейроапоптогенных эффектов этанола в S1 крыс в период постнатального развития осуществлялась посредством иммуногистохимического метода выявления активированной каспазы-3 [13, 173]. По истечении 8 часов после введения этанола (20% в физиологическом растворе, в/б), крысы глубоко анестезировались инъекцией уретана (Sigma-Aldrich, США) (2 г/кг, в/б) и перфузировались параформальдегидом (4%) через левый желудочек сердца. Мозг извлекался и погружался в 4% раствор параформальдегида для дальнейшей фиксации при комнатной температуре. Затем он промывался с помощью фосфатно-солевого буферного раствора (PBS) (Sigma-Aldrich, США) (3 х 30 мин) и заливался агар-агаром. Для нарезки корональных срезов толщиной 50 мкм использовался виброслайсер Microtome HM 650 V (Thermo scientific, Германия). Полученные срезы выдерживались в блокирующем растворе (PBS, Тритон x-100 (0,3%) (Panreac, ЕС), нормальная козья сыворотка (5%) (Life Technologies, США) в течение 1-2 часов. Далее осуществлялась их инкубация при 4 С в растворе PBS с содержанием первичных антител к активированной каспазе-3 (ASP 175) (Cell Signalling Tecnology Inc., США), разведенных в 1000 раз, Тритона x-100 (0,3%) и нормальной козьей сыворотки (1%). После этого срезы отмывались (4 х 5 мин в PBS) и выдерживались в течение 1 часа при комнатной температуре в растворе PBS, содержащем вторичные флуоресцентные Су3 антитела осла аффинной очистки к IgG (H+L) кролика (secondary fluorescent antibodies Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L); Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., США), разведение 1:1000. По окончании инкубации срезы промывались водой и фиксировались в гистологической среде, содержащей ДНК краситель DAPI (Vector Laboratories Inc., США).