Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы 14
1. Гомеостаз слизистой оболочки желудка 14
1.1. Повреждающие факторы желудочного сока 15
1.1.1 Соляная кислота 15
1.1.2. Пепсин 21
1.2. Защитные факторы слизистой оболочки желудка 24
1.2.1. Слизь 24
1.2.2. Бикарбонаты 29
1.2.3. Особенности эпителиального слоя 36
1.2.4. Желудочный кровоток 40
2. Нарушение гомеостаза слизистой оболочки желудка. Язвенная болезнь желудка у человека 46
3. Характеристика некоторых коротких глицин- и пролинсодержащих пептидов 57
3.1. Глипролины 57
3.2. Семакс 66
Объекты и методы исследования 72
Результаты и их обсуждение 94
1. Исследование защитных свойств изучаемых пептидов в отношении слизистой оболочки желудка при воздействии различных повреждающих факторов 94
1.1. Изучение влияния PGP на повреждения слизистой оболочки желудка, вызванные этанолом, индометацином и стрессом 94
1.2. Изучение защитных свойств возможных метаболитов PGP-пептидов PG, GP и аминокислоте иР 98
1.3. Изучение зависимости защитных свойств PGP и его возможных метаболитов - PG и GP - от дозы вводимых препаратов 102
1.4. Изучение защитных свойств семакса 105
1.5. Изучение защитных свойств PGP и возможного экзогенного источника глипролинов — коллагена в форме желатина - при пероральном введении 107
2. Исследование возможных механизмов защитного действия изучаемых пептидов в отношении слизистой оболочки желудка 110
2.1. Изучение влияние PGP, семакса и амилина на желудочную секрецию 110
2.2. Изучение влияния пептидов на желудочный кровоток 119
2.3. Изучение влияния PGP, семакса и амилина на секреторную активность тучных клеток 127
2.4. Изучение влияния пептидов на степень воспаления и скорость заживления хронических язв 132
3. Изучение метаболизма PGP в организме 144
3.1. Изучение основных путей деградации PGP при разных способах введения 144
3.2. Изучение особенностей поступления PGP и его метаболитов в мозг и органы желудочно-кишечного тракта в норме и после кратковременного стресса 150
4. Обсуждение результатов 163
Заключение 199
Выводы 206
Список литературы 209
- Особенности эпителиального слоя
- Изучение влияния PGP на повреждения слизистой оболочки желудка, вызванные этанолом, индометацином и стрессом
- Изучение защитных свойств PGP и возможного экзогенного источника глипролинов — коллагена в форме желатина - при пероральном введении
- Изучение особенностей поступления PGP и его метаболитов в мозг и органы желудочно-кишечного тракта в норме и после кратковременного стресса
Введение к работе
Актуальность проблемы.
В последнее время появились основания для выделения в новое семейство регуляторных пептидов простейших пролин- и глицинсодержащих пептидов - глипролинов, - в том числе PGP, PG, GP (Ашмарин и др., 2002). Их биоактивность связана с торможением ряда элементов кровесвертывания и тромбоза (Ашмарин, Каразеева и др., 1998; Ашмарин, Пасторова и др., 1998), поддержанием гомеостаза слизистой оболочки желудка (СОЖ) (Абрамова и др. 1996; 1997; Ашмарин, Каразеева и др., 1998; Ашмарин, Самонина и др., 1999), регуляцией активности лейкоцитов (Haddox et al., 1999; Watanabe et al., 1994). Они также входят в состав ряда пептидов, относящихся к другим семействам регуляторных пептидов, например, энтеростатинов, р-казоморфинов и др. (Ашмарин и др., 2002).
Глипролины имеют два вероятных источника образования -эндогенный и экзогенный (Ашмарин и др., 2002). Первый связан с синтезом коллагена в фибробластах и с его катаболизмом. Коллаген чрезвычайно богат аминокислотами пролином и глицином в последовательности PG, GP, в меньшей степени PGP, GGP, GPG (Мазуров, 1974; Хилькин и др., 1976). Известно, что перед секрецией из коллагенсинтезирующих клеток коллаген проходит стадию созревания, состоящую в частичном разрушении уже собранных полипептидов. При этом около 90% деградированной части коллагена секретируется из клеток в виде малых пептидов, состоящих менее чем из 5 аминокислот (Bienkowski et al., 1978). Именно этот процесс может быть источником глипролинов, хотя прямых доказательств этому пока нет.
Катаболизм коллагена (а также другого белка, богатого GP и PG фрагментами - эластина), по-видимому, также может приводить к
б образованию глипролинов. Этот процесе в здоровом организме практически не изучен. На сегодняшний день существуют данные о значительном увеличении GP (и других дипептидов, содержащих на С-конце пролин или оксипролин) в моче при заболеваниях кожи (Faull et al., 1976; Le et al., 1999) и об образовании PGP при разрушении сетчатки глаза (Pfister et al., 1995).
Экзогенным источником глипролинов могут служить коллаген и эластин, поступающие в организм с пищей. Известно, что часть ди- и трипептидов проникают из кишечника в энтероциты в неизменном виде (Addison et al., 1975; Bai, Amidon, 1992). Есть прямые указания на проникновение в кровь из кишечника значительных количеств гидроксипролинсодержащих пептидов при приеме препаратов коллагена в форме желатина (Ашмарин и др., 2002).
Было показано, что прием желатина крысами в течение 5-10 дней, также как и пероральное введение PGP, приводит к уменьшению агрегации тромбоцитов (Ляпина и др., 2002). В связи с этим заслуживает изучения и способность коллагена в виде желатина проявлять не только антитромботические, но и гастропротективные качества, присущие глипролинам.
По-видимому, экзогенными источниками глипролинов могут являться и искусственно синтезированные пептиды, имеющие в своем составе последовательность PGP, такие как семакс и селанк. Они были получены путем присоединения последовательности PGP к С-концу таких нестабильных in vivo регуляторных пептидов, как АКТГ4-7 и тафцин соответственно. Наличие пролина в молекулах синтетических пептидов привело к значительно большей их устойчивости к действию протеаз, что позволило существенно увеличить длительность действия пептидов и оптимально решить проблему реализации их лекарственного потенциала (Ашмарин и др., 1997; Бойко и др., 1998; Potaman et al., 1991).
Изучение влияния семакса на процессы кровесвертывания и тромбоза показало, что присоединение последовательности PGP к АКТГ4-7 не только усилило его изначальную биологическую активность, но и дополнило ее эффектами самого PGP. Так, in vivo семакс обладает несколько меньшей, чем у глипролинов, но достаточно выраженной антикоагулянтной, фибринолитической и антитромбоцитарной ативностью. In vitro семакс нейтрален по отношению к параметрам гемостаза, что наводит на мысль о том, что для осуществления влияния на процессы фибринолиза и тромбоза необходим протеолиз семакса до PGP (Ашмарин и др., 1996; Ашмарин, 2001).
Защитные свойства глипролинов в отношении СОЖ ранее были показаны на крысах только для дозы 1 мг/кг при внутрибрюшинном введении (Абрамова и др. 1996). До сих пор не были изучены ни физиологические механизмы действия этих пептидов на гомеостаз СОЖ, ни, тем более, молекулярные. В связи с этим, актуальными являлись исследования влияния глипролинов как на устойчивость СОЖ к повреждающим агентам, так и на основные параметры гомеостаза слизистой оболочки желудка: секрецию кислоты, пепсина, бикарбонатов, желудочный кровоток и т.д. Большой интерес представляло также изучение влияния на гомеостаз СОЖ семакса и выявление доли участия PGP в гастропротективных эффектах этого гептапептида.
В настоящее время в литературе нет данных о содержании и преимущественной локализации эндогенных глипролинов, за исключением цикло-PG (эндогенного анксиолитика), обнаруженного в мозге крыс и мышей (Гудашева и др. 1996; Середенин и др., 2002; Gudasheva et al., 1996). Динамика концентраций глипролинов в тканях и жидкостях организма после их перорального и парентерального введения также неизвестна. В связи с открывающейся перспективой
использования глипролинов и/или их предшественников в качестве антитромботических и противоязвенных агентов назрела необходимость целенаправленных исследований этих концентраций как в экспериментах на животных, так и у людей.
С другой стороны хочется отметить, что актуальным является не только комплексное изучение глипролинов, как нового класса регуляторных пептидов, но и сама проблема сохранения целостности слизистой оболочки желудка при воздействии на нее различных повреждающих факторов. Это связано с тем, что у людей язвенная болезнь относится к числу наиболее часто встречающихся заболеваний внутренних органов. По данным клиницистов ее распространенность среди взрослого населения составляет в настоящее время 7%-10%. Еще более высокой (14%-16%) оказывается частота язвенной болезни по материалам патологоанатомических исследований (Рысс, Звартау, 1998).
Широкая распространенность заболевания, хроническая форма болезни с постоянной угрозой осложнений, неэффективность современных лекарственных средств в плане предупреждения рецидивов, требует поиска более эффективных профилактических и лечебных противоязвенных средств. В связи с этим изучение гастропротективных свойств и механизмов действия глипролинов на гомеостаз СОЖ может иметь прямой выход в фармакологию. При этом несомненными преимуществами глипролинов и/или их источников перед другими лекарственными средствами могли бы стать комплексность воздействия, низкая токсичность, отсутствие привыкания и побочных эффектов.
Цель и задачи исследования.
Целью настоящей работы было изучение влияния глипролинов — пептида PGP и его метаболитов (PG и GP), а также вероятных источников глипролинов — коллагена и семакса - на повреждения
СОЖ различной этиологии; определение основных механизмов действия PGP и семакса на гомеостаз желудка; изучение метаболизма PGP в организме при разных способах введения.
Исходя из этого, были поставлены следующие задачи:
В экспериментах на животных исследовать влияние PGP и его метаболитов - PG, GP, пролина и глицина — на целостность слизистой оболочки желудка при воздействии на нее различных повреждающих факторов.
Изучить возможность проявления защитных свойств глипролинов в отношении СОЖ при введении их в составе семакса и коллагена.
Для определения основных механизмов защитного действия глипролинов в отношении слизистой оболочки желудка исследовать влияние PGP и семакса на
секрецию кислоты, бикарбонатов и пепсиногена в желудке;
базальный и уменьшенный повреждающими факторами кровоток в СОЖ;
базальную и стимулированную секрецию тучных клеток;
процессы воспаления и регенерации при повреждении слизистой оболочки желудка.
Определить время жизни PGP в крови и основной путь его деградации при разных способах введения в организм.
Исследовать возможность проникновения PGP и его метаболитов через гематоэнцефалический барьер, а также возможность накопления их в тканях желудочно-кишечного тракта и перераспределения между органами при кратковременном иммобилизационном стрессе.
Научная новизна.
В экспериментах на животных показаны гастропротективные свойства PGP и его метаболитов - PG и GP - в широком диапазоне
концентраций при воздействии различных повреждающих факторов. Впервые выявлены защитные свойства в отношении слизистой оболочки желудка веществ, имеющих в своем составе последовательность PGP - семакса и коллагена в форме желатина.
Установлено, что PGP и семакс уменьшают как базальную, так и вызванную раздражением блуждающего нерва секрецию соляной кислоты в желудке. Семакс одновременно уменьшает секрецию пепсиногена и кратковременно стимулирует базальную секрецию бикарбонатов.
Для PGP, PG и семакса обнаружена способность нормализовать желудочный кровоток, нарушенный ульцерогенными агентами.
Выявлено, что PGP, GP, PG и семакс активизируют процессы рубцевания и эпителизации в зоне повреждений СОЖ, вызванных уксусной кислотой. Для PGP и GP продемонстрирована способность уменьшать степень воспаления в зоне язвенного дефекта на 5-й день после аппликации уксусной кислоты.
Впервые показано, что PGP и семакс могут стабилизировать тучные клетки при стрессе.
С помощью меченого тритием PGP установлена относительно высокая устойчивость трипептида к протеолизу. Впервые получены прямые доказательства прохождения PGP через стенку кишечника в неизменном виде, определены основные пути его деградации при разных способах введения.
Показано проникновение радиоактивной метки в мозг и накопление ее в желудочно-кишечном тракте после внутрибрюшинного введения в виде [3H]PGP. Установлено, что кратковременный иммобилизационный стресс может изменять распределение радиоактивной метки между органами через 30 мин после введения [3H]PGP, увеличивая ее содержание в мозге и желудке и уменьшая в кишечнике.
Положения, выносимые на защиту.
Представитель глипролинов PGP обладает выраженным защитным действием в отношении повреждений слизистой оболочки желудка различной этиологии. Его метаболиты - PG и GP - обладают собственной дифференцированной гастропротективной активностью. PG более эффективен на моделях повреждения слизистой оболочки желудка, вызванных нарушением в основном периферических механизмов поддержания желудочного гомеостаза, GP - центральных. Различия в эффективности PG и GP как защитных агентов слизистой оболочки желудка исчезают при увеличении дозы дипептидов.
Наличие в составе пептидов и белков последовательности PGP может наделять их биоактивностью глипролинов, что убедительно показано для семакса и коллагена в форме желатина.
Гастропротективный эффект глипролинов и семакса носит комплексный характер. Он связан с уменьшением повреждающих факторов желудочного сока (кислоты и пепсина), уменьшением воспаления в зоне повреждений слизистой оболочки желудка, стабилизацией тучных клеток, при одновременном увеличении таких защитных компонентов слизистой оболочки желудка как кровоток и бикарбонаты.
Величина противоязвенного эффекта PGP сопоставима с таковой у уже известных гастропротективных веществ, таких как атропин и новый панкреатический гормон амилин. Несомненным преимуществом PGP перед амилином является то, что последний имеет ярковыраженную гормональную активность, что может приводить к побочным эффектам при его использовании.
PGP относительно устойчив к протеолизу в желудочно-кишечном тракте и внутренних средах организма. Он способен в неизменном виде проникать из кишечника в кровь. Основным устойчивым метаболитом PGP в организме является дипептид PG. Обнаружение
радиоактивной метки в мозге после системного введения меченного тритием PGP, свидетельствует о способности трипептида и/или его метаболитов проникать через гематоэнцефалический барьер и действовать на центральном уровне. Стресс может изменять распределение метки между органами, увеличивая ее концентрацию в мозге и желудке.
Практическое значение.
Показанное в экспериментах на животных гастропротективное действие может дать обоснование необходимости предклинических исследований PGP и/или его метаболитов — PG и GP — в качестве противоязвенных препаратов. Высокая устойчивость трипептида в крови, способность проникать из желудочного тракта в неизменном виде, сохранение противоязвенных эффектов при пероральном введении делает возможным применение препарата в виде удобных для приема человеком таблетированных и капсулированных форм. Положительное влияние PGP и его метаболитов на широкий спектр механизмов, принимающих участие в поддержании гомеостаза слизистой оболочки желудка (секрецию, кровоток, воспалительные процессы) делает его применение не зависимым от этиологии и типа патогенетических факторов, приведших к язвообразованию.
В связи с тем, что профилактические противоязвенные свойства показаны и для вероятного пищевого источника глипролинов -коллагена (в виде желатина) - открываются широкие перспективы профилактики нарушений гомеостаза слизистой оболочки желудка путем регулирования пищевого рациона человека и/или применения белков соединительной ткани в виде пищевых добавок.
Проведенные исследования также могут расширить спектр применения семакса. До сих пор этот препарат применялся в клинике только в качестве ноотропного и антигипоксического перепарата. Наличие у него гастропротективных свойств сделало возможным
применение семакса в комплексной терапии язвенной болезни (Иваников и др., 2002).
Особенности эпителиального слоя
Слизе-бикарбонатный барьер лежит вне клеток эпителия, но секреция веществ, его составляющих, зависит от нормального метаболизма в эпителиальных клетках. Эти клетки должны быть устойчивы к перевариванию.
СОЖ состоит из эпителия с высоким электрическим сопротивлением и почти непроницаемого для желудочного содержимого, в том числе и для воды. Особую роль в защите субэпителиальных тканей желудка от кислоты, по-видимому, играют плотные межклеточные контакты между эпителиальными клетками. Агенты, разрушающие эти контакты, такие как этанол и мочевина, а также отсутствие кальция, приводят к увеличению проницаемости СОЖ и ее повреждению (Allen et al., 1993; Flemstrom, Isenberg, 2001; Wallace, 1985).
Другой особенностью эпителиальных клеток СОЖ является то, что их апикальная мембрана (но не базолатеральная) необычайно устойчива к низким рН. Такие же свойства апикальной мембраны наблюдаются и у главных и у париетальных клеток. Это позволяет поверхностным клеткам СОЖ сохранять нормальный внутриклеточный рН даже при длительном воздействии кислоты (Boron et al., 1994; Sanders et al., 1985; Waisbren et al., 1994).
Одним из механизмов устойчивости апикальных мембран клеток СОЖ к воздействию кислоты считается наличие отрицательного заряда на мембране, удерживающего катионы, в том числе и Н . Другой механизм - гидрофобность мембран. Гидрофобные поверхности (графит, полиэтилен, парафин) часто применяют в технике для того, чтобы предотвратить коррозию кислотами. Возможно, что апикальные мембраны клеток СОЖ имеют особый липидный состав, отличный от такового у других клеток, и наиболее эффективный в защите от кислоты (Allen et al., 1993).
Перевариванию мембран может препятствовать наличие гликопротеинов в их составе. Так, известно, что р-субъединица ІҐ",К+-АТФазы на 70% состоит из олигосахаридов и все они находятся на внеклеточном участке АТФазы. Она устойчива к действию различных протеаз. Дегликозилирование р-субъединицы значительно уменьшает ее устойчивость к протеолизу (Thangarajah et al., 2002). На сегодняшний день недостаточно сведений о наличии в составе других пептидов апикальных мембран олигосахаридов на участках, открывающихся в полость желудка, но, по-видимому, они могут иметь такую же защиту от переваривания пепсином, как и Р-субъединица Н+,К+-АТФазы.
Если слизе-бикарбонатный барьер и особенность строения мембран не спасает клетки от закислення, то стабильный внутриклеточный рН поддерживается за счет электрохимического градиента натрия. В норме за экспозицией НС1 на изолированную СОЖ и закислением клеток следует частичное восстановление внутриклеточного рН. Оно сопровождается увеличением натрия внутри клетки, то есть ионы Н выкачиваются против своего электрохимического градиента в обмен на Na+. Удаление натрия из внеклеточной среды и применение веществ, нарушающих работу H7Na+ обменника, приводит к быстрому закисленню внутриклеточного содержимого при воздействии кислоты и гибели клеток (Allen et al., 1993).
Еще одной особенностью эпителиального слоя СОЖ является его быстрая обновляемость. Средняя продолжительность жизни эпителиальных клеток желудка 1-2 дня. Клетки, отшелушивающиеся в полость желудка, постоянно заменяются новыми. Полная замена эпителиальных клеток СОЖ происходит за 2-4 дня, клеток желудочных желез - за несколько месяцев (Allen et al., 1993; McDonald et al., 1964). Пролиферация ускоряется гастрином, простагландинами, цитокинами, бомбезином, холецистокинином, глюкагоном, ВИП (Allen et al., 1993; Atay et al., 2000; Friis-Hansen et al., 1998, 2002; Larsson et al., 1986; Nagata et al., 1996).
Если эпителий все же поврежден, в желудке существует хорошо развитый механизм восстановления СОЖ в зоне поверхностных повреждений. В ответ на травму умершие клетки отшелушиваются и вместе со слоем слизи и экссудатом фибрина образуют желатинозную и/или слизистую шапочку очень большой толщины (до 1 мм), обильно орошаемую щелочным экссудатом. Она создает идеальные условия для локальной нейтрализации кислоты. Поврежденный участок восстанавливается за счет миграции клеток из собственной пластинки СОЖ. Этот процесс идет с огромной скоростью и сопровождается восстановлением как морфологической, так и электрической целостности с восстановлением плотных контактов между клетками (Allen et al., 1993).
Миграция оставшихся в живых клеток для восстановления поверхностных повреждений происходит очень быстро (скорость 2 мкм/мин), поэтому ни один агент не может ускорить этот и без того уже быстрый процесс (Allen et al., 1993). Глубокие повреждения (с повреждением базальной мембраны) могут существовать длительное время и заживают наподобие кожных ран. Репаративный процесс включает в себя усиление активности макрофагов, очищение области повреждения от некротических тканей, синтез нового межклеточного матрикса, ангиогенез и реэпителизацию (Allen et al., 1993; Tarnawski, Halter, 1995). Заживление глубоких повреждений ускоряется агентами, усиливающими пролиферацию клеток СОЖ (Allen et al., 1993; Milani, Calabro, 2001), активацией афферентных нейронов (Holzer, Pabst, 1999), антисекреторными препаратами (Рысс, Звартау, 1998; Allen et al., 1993; Feldman, 1996).
Изучение влияния PGP на повреждения слизистой оболочки желудка, вызванные этанолом, индометацином и стрессом
Наличие защитных свойств у PGP в отношении СОЖ было изучено на трех моделях язвообразования, отличающихся по основным механизмам повреждающего действия - этаноловой, индометациновой и стрессорной.
По литературным данным одним из основных механизмов повреждающего действия этанола является прямое вазоконстрикторное действие в отношении кровеносных сосудов СОЖ с увеличением их проницаемости, что приводит к уменьшению желудочного кровотока (Kalia et al., 1997). В патогенез стрессорных повреждений желудка вовлечено множество как центральных, так и периферических механизмов. Особая роль при этом принадлежит гиперактивации симпатической и парасимпатической систем (Tanaka, 1995; Zhang, Zheng, 1997). Повреждающий эффект индометацина связан в основном с нарушением синтеза простагландинов в желудке, которое ведет к уменьшению образования слизи и бикарбонатов, нарушению кровотока, увеличению базальной продукции соляной кислоты (Atay et al., 2000). В наших экспериментах внутрижелудочное введение крысам 96 этанола приводило к появлению повреждений СОЖ, которые проявлялись в виде геморрагических областей большой протяженности, расположенных в основном на гребнях складок. Внутрибрюшинное введение индометацина вызывало повреждения СОЖ в виде многочисленных округлых геморрагических областей, диаметр большинства из которых не превышал 0,2-0,4 мм2. Средняя площадь индометациновых повреждений у контрольных животных составляла 1,3+0,3 мм . Холодовой иммобилизационный водоиммерсионный стресс также вызывал у крыс повреждения в желудке гораздо меньшей интенсивности, чем этанол. Они представляли собой небольшие округлые геморрагические участки СОЖ, которые в литературе принято рассматривать как стрессорные язвы (Overmier, Murison, 2000). Их средняя площадь в контроле не превышала 1,2+ 0,4 мм2 (табл. 2). Внутрибрюшинное введение PGP (1 мг/кг) за час до введения этанола или начала стресса, или через 10 мин после введения индометацина приводило к достоверному уменьшению площади повреждений у опытных животных по сравнению с контрольными на всех трех используемых моделях вызова повреждений СОЖ. При этом эффективность защитного действия PGP на разных моделях была одинаковой: пептид уменьшал площадь повреждений примерно на 60% (табл. 2, рис. 7). и амилин. Атропин - М-холинолитик с выраженной антисекреторной и противоязвенной активностью, показанной как в экспериментах на животных, так и при лечении людей с язвенной болезнью (Рысс, Звартау, 1998; Tarnok et al., 1986). Пептидные препараты пока не нашли широкого применения в лечении язвенной болезни, поэтому в качестве вещества сравнения пептидной природы нами был выбран амилин. Амилин - новый панкреатический гормон, в последнее десятилетие вызывающий большой интерес у исследователей в связи с его эндокринными функциями (регуляцией метаболизма углеводов) и возможным участием в таких патологиях как диабет, ожирение, образование амилоидных отложений в Р-клетках поджелудочной железы при старении (Cooper, 1994; Cooper, Tse, 1996). В нашей и зарубежных лабораториях для амилина были показаны выраженные противоязвенные эффекты на разных моделях язвообразования (Герман и др., 1997; Guidobono, 1998). В наших экспериментах внутрибрюшинное введение атропина (1 мг/кг) и амилина (0,5 мкг/кг) за час до начала действия этанола в дозах, для которых ранее были показаны выраженные противоязвенные эффекты (Герман и др., 1997; Tarnok et al., 1986), приводило к уменьшению площади повреждений на 34% и 48% соответственно. PGP в изучаемой концентрации на этаноловой модели защищал СОЖ от повреждений примерно в 2 раза эффективнее, чем атропин (р 0,05) и показывал тенденцию к более выраженному противоязвенному действию по сравнению с амилином (р 0,05) (рис. 8). Таким образом " полученные нами данные подтверждают показанные ранее Абрамовой и соавторами (1996) защитные свойства PGP в отношении СОЖ при воздействии различных повреждающих факторов.
Изучение защитных свойств PGP и возможного экзогенного источника глипролинов — коллагена в форме желатина - при пероральном введении
При длительном приеме лекарств наиболее удобными для человека лекарственными формами являются те из них, которые применяются перорально. В связи с этим в следующей серии экспериментов PGP в дозе 1 мг/кг (3,7 мкмоль/кг) вводили за 1 ч перед индукцией этаноловых повреждений внутрижелудочно. Пероральное введение PGP уменьшало суммарную площадь язв примерно на 40% (рис. 16).
Таким образом, эффективность гастропротективного действия трипептида при энтеральном и парентеральном введении (рис. 7, 16) были вполне сопоставимы друг с другом, что косвенно может свидетельствовать о высокой способности глипролинов проникать в неизменном виде из желудочно-кишечного тракта в кровь.
Теоретически источником глипролинов при поступлении в организм с пищей и переваривании в желудочно-кишечном тракте могут служить белки соединительной ткани - эластин и коллаген. Они богаты такими аминокислотами как пролин и глицин и имеют в своем составе последовательности GP, PG, PGP, PPG, GPG, GPGGP и др. (Мазуров, 1974; Хилькин и др., 1976). В связи с этим в настоящей работе были изучены защитные свойства желатина (частично разрушенного коллагена) на этаноловой модели язвообразования. Было показано, что желатин, добавляемый в течение 7 дней к корму в соотношении 1:9, имел сходный по величине противоязвенный эффект с PGP, введенным внутрижелудочно за 1 ч до этанола (рис. 16).
Начиная с 50-х годов, длительное время считалось, что белки и короткие пептиды полностью гидролизуются до аминокислот, которые переносятся затем через апикальную мембрану кишечных клеток. В последнее время получены данные о том, что некоторые малые пептиды (глицилглицин, дипептиды, состоящие из остатков пролина и оксипролина, и некоторые другие малогидролизуемые или резистентные к гидролизу ди- и трипептиды) всасываются частично или полностью в нерасщепленном виде (Тимофеева и др., 2000). Не исключено, что показанный нами гастропротективный эффект желатина связан с расщеплением входящих в его состав белков до ди-и трипептидов, в том числе и до GP, PG и PGP, и всасыванием их в неизменном виде в кровь
Изучение возможных механизмов защитного действия исследуемых пептидов в отношении слизистой оболочки желудка 2.1. Изучение влияние PGP, семакса и амилина на желудочную секрецию.
К настоящему моменту ни у кого не вызывает сомнения, что повреждения СОЖ возникают при нарушении равновесия между факторами кислотно-пептической агрессии желудочного содержимого и элементами защиты СОЖ (Рысс, Звартау, 1998; Hqjgaard et al., 1996). Агрессивное звено язвообразования включает в себя повышение выработки соляной кислоты и пепсина. Ослабление защитных факторов слизистой оболочки желудка может возникать в результате снижения выработки и нарушения качественного состава желудочной слизи, уменьшения концентрации бикарбонатов, ухудшения процессов регенерации и нарушения кровоснабжения СОЖ (Рысс, Звартау, 1998; Allen et al., 1993; Flemstrdm, Isenberg, 2001). Особо хочется отметить, что даже в тех случаях, когда язвы развиваются на фоне нормальной секреции кислоты и пепсина, антисекреторные препараты имеют выраженный лечебный эффект (Рысс, Звартау, 1998).
С целью выяснения возможных механизмов защитных эффектов в отношении СОЖ PGP, семакса и амилина (в качестве вещества для сравнения), в настоящем исследовании было изучено влияние внутрибрюшинного введения этих пептидов на базальную и вызванную раздражением блуждающего нерва секрецию кислоты, бикарбонатов и пепсиногена в желудке наркотизированных крыс.
Базальная секреция кислоты у наркотизированных крыс в наших экспериментах изменялась в пределах 10%-20% от исходного уровня. Исследование влияния PGP, семакса и амилина на базальную секрецию соляной кислоты показало, что все три пептида в той или иной мере уменьшают продукцию НС1 в желудке (рис. 17).
Изучение особенностей поступления PGP и его метаболитов в мозг и органы желудочно-кишечного тракта в норме и после кратковременного стресса
Начиная с 50-х годов, длительное время считалось, что белки и короткие пептиды полностью гидролизуются до аминокислот, которые переносятся затем через апикальную мембрану кишечных клеток. В последнее время получены данные о том, что некоторые малые пептиды (глицилглицин, дипептиды, состоящие из остатков пролина и оксипролина, и некоторые другие малогидролизуемые или резистентные к гидролизу ди- и трипептиды) всасываются частично или полностью в нерасщепленном виде (Тимофеева и др., 2000). Что касается PGP, то исследований в области деградации в желудочно-кишечном тракте и возможности проникновения в неизменном виде в кровь именно для этого пептида ранее не проводилось.
В связи с вышеизложенным, а также в связи с обнаружением у PGP защитных свойств в отношении СОЖ, а, значит, и с появившейся перспективой его использования в медицинской практике, был изучен метаболизм пептида в экспериментах на кроликах при трех разных способах введения: внутрибрюшинном, внутрижелудочном и внутрикишечном. Первый способ введения был выбран исходя из того, что в экспериментах на животных при изучении противоязвенных свойств пептида в основном было использовано внутрибрюшинное введение PGP. Что касается человека, то при длительном применении лекарственных препаратов предпочтительно пероральное введение. Предполагалось, что внутрикишечное введение PGP в капсулах, нерастворимых в желудке, позволит избежать разрушения пептида под действием желудочного сока. Использование кроликов позволило получить большее количество крови (по сравнению с крысами), без нанесения вреда животному.
Для проведения экспериментов был использован PGP, меченый радиоактивным тритием. Исследования метаболизма PGP показали, что при внутрибрюшинном введении пик концентрации трипептида в плазме крови достигается через 30 мин (рис. 38) после введения и его содержание в плазме не превышает при этом 4,5% от общего количества введенного пептида (табл. 7).
С другой стороны часть пептида (примерно 2% от введенного) сохраняется в неизменном виде в течение 5 ч после введения (рис. 38, табл. 7), что существенно превышает время существования в крови большинства других олигопептидов, время жизни которых обычно не превышает нескольких минут (Бойко и др., 1998; Bowyer et al., 1991). Длительное существование PGP в неизменном виде, по-видимому, объясняется наличием в его молекуле остатков пролина, который устойчив к действию протеаз (Ашмарин и др., 2002; Тимофеева и др., 2000; Cunningham, O Connor 1997). Основным метаболитом PGP является дипептид PG, т.е. деградация пептида идет за счет отщепления пролина с С-конца трипептида. GP образуется примерно в 4-4,5 раза меньше, чем PG (рис. 38). При внутрижелудочном введении максимальная концентрация PGP в плазме крови достигается также на 15-30 мин после введения [H3]PGP (рис. 39). Она примерно в 2,5 раза меньше, чем при внутрибрюшинном введении, что скорей всего связано с разрушением PGP протеазами желудочно-кишечного тракта. Основным метаболитом при данном способе введения также является дипептид PG. При внутрибрюшинном введении во время максимальной концентрации изучаемых пептидов в крови соотношение исходного пептида к метаболитам составляло 1:1,1:0,3 для PGP, PG и GP соответственно, тогда как при внутрижелудочном введении это соотношение изменяется в сторону увеличения образования как PG, так и GP и становится равным 1:3,2:1,3. Введение PGP в капсулах, нерастворимых в желудке, приводит к замедлению всасывания пептида и его метаболитов в кровь: через 15 мин их в плазме еще не обнаруживается, максимум концентрации достигается на 60 мин после введения (рис. 40). Вероятнее всего задержка поступления пептидов в кровь связана с тем, что для растворения капсулы в кишечнике необходимо определенное время. Вопреки ожиданиям, максимальная концентрация PGP в плазме при внутрикишечном введении оказалась примерно равной таковой при внутрижелудочном, несмотря на то, что пептид не подвергался воздействию желудочных протеаз. С другой стороны, при внутрикишечном введении значительно уменьшились по сравнению с внугрижелудочным введением максимальные концентрации дипептидов PG и GP. Обобщение этих данных наводит на мысль, что частичное всасывание дипептидов может происходить уже в желудке и/или они больше подвержены разрушению ферментами кишечного сока, чем PGP. Соотношение PGP:PG:GP в точке их максимальной концентрации в плазме крови при внутрикишечном введении составило 1:1,1:0,3. При всех трех способах введения большая часть пептида быстро гидролизуется ферментами желудочно-кишечного тракта и плазмы крови до аминокислот, из которых синтезируются собственные белки, в том числе и белки, циркулирующие в плазме крови. Измерение радиоактивности осаждаемых при центрифугировании плазмы белков показало, что в первые 60 мин после введения PGP, количество метки в белках плазмы сопоставимо с количеством метки, связанной с PGP и его метаболитами - PG и GP (табл. 8).
