Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 7
1.1. Использование микробиологических препаратов в промышленном скотоводстве 7
1.2. Защитная роль нормальной микрофлоры 10
1.3. Механизм действия пробиотиков 14
1.4. Перспективы применения пробиотиков в животноводстве 23
1.5. Иммунный статус организма. Влияние симбионтных микроорганизмов на становление иммунной системы 27
2. Объект и методы исследований 33
2.1. Объект исследований,схема и условия проведения опыта 33
2.2. Методы исследований 33
3. Результаты собственных исследований
3.1. Клинико-гематологические и иммунологические показатели, прирост живой массы телят при применении руменолакта
3.1-1. Гематологические показатели
3.1.2. Показатели неспецифической резистентности 46
3.1.3. Оценка иммунного статуса
3.1.4. Влияние руменолакта на прирост живой массы телят, оплату корма 50
3.1.5. Лечебно-профилактическое действие руменолакта 52
3.2. Клинико - гематологические, иммунологические показатели, рост телят при добавках в рацион биосана 55
3.2.1. Гематологические показатели 55
3.2.2. Показатели неспецифической резистентности 5?
3.2.3. Оценка иммунного статуса 58
3.2.4. Влияние биосана на прирост живой массы телят, оплату корма
3.2-5. Лечебно-профилактическое действие биосана 62
3-3. Клинико - гематологические, иммунологические и показатели роста телят при добавках бифидумбактерина 65
3.3.1. Гематологические показатели 65
3.3.2. Показатели неспецифической резистентности 67
3.3.3. Оценка иммунного статуса 68
3.3.4. Влияние бифидумбактерина на прирост живой массы телят. оплату корма 70
3.4. Сравнительное изучение влияния руменолакта, биосана и бифидумбактерина на исследуемые показатели 72
3.4.1. Гематологические показатели 72
3.4.2. Показатели неспецифической резистентности 80
3.4.3. Оценка иммунного статуса В?
3.4.4. Зоотехнические показатели 92
3.4.5. Экономическая эффективность применения пробиотиков 96
Заключение 100
Выводы 108
Практические предложения и рекомендации производству 110
Литература
- Защитная роль нормальной микрофлоры
- Методы исследований
- Показатели неспецифической резистентности
- Сравнительное изучение влияния руменолакта, биосана и бифидумбактерина на исследуемые показатели
Защитная роль нормальной микрофлоры
Таким образом, увеличение гамма-глобулиповой Фракции может являться следствием повышенного синтеза специфических иммуноглобулинов.
К числу положительных функций нормальной микрофлоры относят способность входящих в ее состав микроорганизмов связывать и в последующем выводить из организма соли тяжелых металлов CJ.Smith,1989).
В основе этого могут лежать физико-химические процессы (адсорбционные), либо физиолого-биохимические особенности инкорпорировать определенные химические соеденения или элементы. Установлено, что микроорганизмы, входящие в состав пробиотиков, способны усваивать и прочно связывать значительные количества радиоактивного цезия, стронцияСР. Porter, 1987). Их способность превышает таковую у кишечных палочек, энтеробактерий, стафилококков.
Вышеизложенные данные, характеризующие действие пробиотиков,позволяют заключить,что механизмы лечебно-профилактического действия про-биотических микроорганизмов носят многоплановый и многофакторный характер. После приема препарата начинают выделяться биологически активные вещества и функционировать системы микробных клеток, оказывающие как прямое действие на патогенные и условно-патогенные микроорганизмы, так и опосредованное, путем активации специфических и не-специФических систем защиты макрорганизма.
В этот же период времени бактериальные клетки биопрепарата могут рассматрироваться как биокатализаторы многих жизненных процессов в пищеварительном тракте, активно продуцирующие комплексы ферментов. аминокислот, антибиотических веществ и других Физиологически активных соединений, которые дополняют комплексное лечебно-профилактическое действие биопрепаратов.
Следует особо подчеркнуть,что ни один из описанных выше механизмов специфического действия пробиотиков не вызывают негативных последствий.
В публикациях, касающихся изучения влияний препаратов на экспериментальных животных и обобщающих материалах по применению пробиотиков на различных контингентах людей и сельскохозяйственных животных нет упоминаний о каких-либо неблагоприятных реакциях в результате их применения в обширной медицинской и ветеринарной практике.
Рзультаты многочисленных разносторонних морфологических, иммунологических, бактериологических, биохимических, патофизологических и других исследований свидетельствуют о их полной безвредности и безопасности
Это открывает широкие возможности для совершенствования схем и методов их применения, комбинирования с другими препаратами, создания на их основе новых лекарственных Форм, расширения сфер применения, т.е. дальнейшего повышения эффективности использования пробиотиков в медицинской и ветеринарной практике.
О существовании новых гипотетических оценок действия пробиотиков из живых микробных культур говорят данные, полученные Пирузяном Л. А. и Михайловским Е.А.С1992),которые рассматривают введение в организм микрофлоры, продуцирующей биологически активные вещества, как "микробиологическую подсадку "для так называемой "сапрофитной фармакотерапии". Эти авторы предполагают, что помимо воздействия на патогенную микрофлору с помощью таких методов можно будет достичь угнетения роста злокачественных опухолей, корректировать процессы обмена веществ, роста, оплодотворения, кровообращения.
Различные молочнокислые бактерии, в особенности L. acidophilus, были предложены в качестве возможных пробиотиков для лечения стрессовых диарей у молодых свиней(В.Ф.Каленюк,1992). Поросята наиболее восприимчивы к вызванным стрессом желудочно-кишчным расстройствам в течение первой недели жизни, во время перевода на искусственное вскармливание, а также,когда их впервые помещают в загоныСВ. ПП .апте-нок,1986).Принятая практика раннего отъема поросят лишает их естественных защитных средств, получаемых от матерей. Это ингибирует секрецию соляной кислоты в желудке,что обусловливает исключительную зависимость поросят от молочнокислых бактерий, снижающих рН желудка, подавляющих развитие патогенов и обеспечивающих эффективный уровень активности пепсина и переваримости белка С В. П. Литвин, 1986)) ККшеечые расстройства поросят в этом периоде, вызванные рядом микроорганизмов (преимущественно гемолитическими Е.соli),приводят к колибактериозам, нарушениям поведения и в конечном счете к гибели от обезвоживания(С. М. Макарова, 1990).
В то время, как микрофлора желудочного тракта здоровых свиней состоит в основном из молочнокислых бактерий,во время стресса происходит их замена гемолитическими Е.соll.В начале гастроэнтерита гемолитические Е.соП появляются в тощей и.подвздошной кишках молодых свиней (А.Кенворти, Ю.Кребб,1980). Увеличение численности Б сої і в этот период установлено С.Чопром(1979). У здоровых свиней в желудочно-кишечном тракте существует естественный баланс между молочнокислыми и кодиподобными бактериями, а при диарее этот баланс нарушается.
Методы исследований
Одним из наиболее важных критериев оценки функциональной активности В-системы иммунитета является определение концентрации иммуноглобулинов основных классов в сыворотке крови. Содержание иммуноглобулинов классов 3-,М-,и А определяли с помошью метода радиальной имму-нодиФФузии(МапсЬ1п1Д965) с использованием моноспецифических антисывороток к отдельным классам иммуноглобулинов. Сущность метода заключается в том, что иммуноглобулины радиально диффундируют в агар, в котором содержится моноспецифическая антисыворотка, образуя кольцо преципитации,диаметр которого прямо пропорционален концентрации иммуноглобулина, содержащегося в пробе.
Для этого использовались пластины 9x12 см, зажатые П-образной рамкой, пространство между которыми заливалось смесью агара и антисыворотки. После застывания агара в нем пробойником вырезались по трафарету ячейки диаметром 2 мм. В первый ряд лунок вносились двойные разведения стандартной сыворотки в объеме 1 мкл,в остальные-исследуемые пробы, после чего пластины в горизонтальном положении помещали во влажную камеру:для определения Jg 6 и Jg А - на 24 часа, а для Jg М-- на 48 часов.
Строили калибровочную кривую, где по оси абсцисс откладывали диаметры колец преципитации различных разведений стандартной сыворотки, по линии ординат-концентраций иммуноглобулинов, выраженные в мг/мл.
Определяли количество Т-лимф)цитов методом спонтанного розетко-образования с эритроцитами барана СЕ-РОЮСМ. Jondal, 1972). Метод основан на способности Т-клеток самопроизвольно агрегироваться с эритроцитами барана вследствие наличия на их поверхности рецеп торов-к этим эритроцитамСне менее 3-х эритроцитов с одним лимфоцитом) Выделение лимфоцитов проводили в градиенте плотности верографин -фиколлС1,077 г/см З).
Для постановки реакции розеткообразования в центрифужные пробирки отбирали равные количестваСпо 0,2 мл)суспензии лимфоцитов и взвеси эритроцитов барана, инкубировали 15 мин. при 37 С и осаждали образовавшиеся комплексы центрифугированием в течении 5 мин, при 1000 об/ /мин. Затем инкубировали в течение 18 часов при 4 С, добавляли 0,05 мл 0,6% раствора глютарового альдегида и фиксировали 20 минут. Затем розетки осаждали центрифугированием при 300 об/мин 5 мин и сливали большую часть надосадочной жидкости.
Готовили мазки на предметных стеклах. Фиксировали в этаноле, окрашивали водным раствором эозина.
Для получения более полной информации о состоянии иммунитета определяли абсолютное количество лимфоцитов в крови, а также субпопуляции Т-лимфоцитов: теофиллинрезистентные Т-лимфоциты Схелперные клетки) и теофиллинчувствительныеСсупрессорные)клетки.
Теофиллинрезистентные Т - лимфоциты определяли по чувствительности к теоФиллинуСА.Ьіта1:іЬи1,1978): 0,1мл взвеси лимфоцитов соединяли с 0,1 мл теофиллина, инкубировали 60 мин. при 37 С. Дальнейший ход реакции такой же, как при определении Т-лимфоцитов.
Число теофиллинчувствительных определяли по разности общего числа Т-лимфоцитов и числа теофиллинрезистентных Т-клеток.СА.ААЯрилинЛ985)
Статическая обработка. Все полученные результаты экспериментальных исследований подвергали статической обработке с использованием критерия Стьюдента по правилам вариационной статистикиСГ. Ф. Лаккин ,1990)
Гематологические показатели Использование в качестве добавки в рацион телят пробиотика румено-лакта вызвало изменение гематологических показателей. Одной из важных физиологических характеристик состояния животных являются показатели красной крови. Хотя пробиотическая добавка в различных дозах
Показатели неспецифической резистентности
Методы гематологических исследований в настоящее время широко внедряются в экспериментальную и животноводческую практику. Они позволяют достаточно полно и информативно охарактеризовать изменения в организме, происходящие под влиянием различных Факторов, в данном случае, изменение показателей красной и белой крови у телят при включении в их рацион пробиотических препаратов.
Как показали результаты исследований, добавки в рацион телят пробиотических препаратов оказали положительное влияние на морфологическую картину крови. При этом оптимальными дозами мы считали 0,5г руменолакта, 3 дозы биосана и биФидумбактерина на голову в сутки. У животных контрольных групп количество эритроцитов было в пределах 7,12 0,43 - 7,63 0,13 млн/мьГЗ (таблица 23). В первой серии опытов, при использовании руменолакта в количестве 0,5г на голову в сутки наблюдается повышение количества эритроцитов на 7,44%, при добавках 3 доз биосана - на 9,15% (Р 0,05), при введении в рацион 3 доз биФидумбактерина - 3,4%.
В наших исследованиях установлено также увеличение количества гемоглобина у животных опытных групп, получавших пробиотические препараты: при скармливании руменолакта - на 3,98% (Р 0,05), биосана - на 4,11%, биФидумбактерина - на 1,73%.
Повышение количества эритроцитов и уровня гемоглобина в крови подопытных животных при использовании пробиотических добавок мы Леи ко. форму Ї5її с("0 в - 74 ваем со стимулированием гемопоэтических функций организма под действием алиментарного раздражителя. По данным Ф. Палфий, 33 .Гмкало о др. (1986), микрофлора рубца оказывает влияние на процессы кроветворения у крупного рогатого скота прежде всего за счет синтеза витаминов группы В, в частности цианкобаламина.
В работах А. Н.Маянского и Д.Р.Маянского(1983) рассматривается влияние микрофлоры желудочно - кишечного тракта на гемопоэтические функции организма через стимуляцию процессов секреции желудочного сока и содержащегося в нем так называемого "антианемического Фактора" метаболитами молочнокислого и пропионовокислого брожения, усилением расщепления и всасывания минеральных соединений и аминокислот в желудке и кишечнике.
Из экспериментальных данных следует,что наибольшее влияние на кроветворные функции телят в раннем постнатальном периоде оказали препараты руменолакт в дозе О,5г на голову в сутки и биосан в количестве 3 доз на голову в сутки.
В наших экспериментах добавки пробиотических препаратов оказали влияние на показатели белой крови,то есть на количество лейкоцитов и соотнашение различных групп лейкоцитов в лейкоцитарной Формуле.
По результатам исследований В.Н. Никитина (1956), A.A. Кудрявцева (1979), Г.А.Симоняна,(1995) кровь новорожденных телят имеет нейтро-фильный профиль. В этот период в лейкоцитарной Формуле гранулоциты достигают 80 и более процентов с высоким (до 25%) содержанием юных и палочкоядерных Форм. Эозинофилы у телят до шестимесячного возраста встречаются редко. К месячному возрасту в гематограмме телят превалируют лимфоциты. По данным А. А-КудрявцеваС1976),абсолютное количество лейкоцитов на 30-й день жизни телят составляет 9,12 тыс/ммл3, в работе А-А. Лоскутова (1974) приводится средний показатель 7,12 тыс/ /мкГЗ.
Повышенное содержание лейкоцитов у животных контрольных групп объясняется их изначальным физиологическим состоянием: у телят были симптомы диспепсии, а, вследствие этого, увеличение количества лейкоцитов в крови под влиянием инфекционного раздражителя.Поскольку телята контрольных групп с признаками заболевания получали антибиотики,а телята опытных групп -- пробиотические препараты, терапевтическое действие как антибиотиков, так и пробиотиков сопровождалось снижением напряженности инфекционного процесса,то есть клиническим выздоровлением животных и снижением количества лейкоцитов в крови.
Вследствие того, что выздоровление животных опытных групп при использовании пробиотиков проходило быстрее, уровень лейкоцитов у них был ниже, чем в контрольных группах,на 11,15% при скармливании руме-нолакта и на 4% при добавках биосана. Наши данные согласуются с результатами И. П. Краснова (1973), который указывает, что у телят при желудочно-кишечных инфекциях наблюдается выраженный лейкоцитоз.
По результатам исследований 0.И.Кальницкой (1995),у телят с кишечными инфекциями количество лейкоцитов в крови высокое: 12,27 0,13 тыс/мм 3,а при использовании пробиотиков оно снижается до 10,23 0,16 тыс/мьГЗ.
В третьей серии опытов пробиотический препарат бифидумбактерин использовался с профилактической целью. Количество лейкоцитов в крови телят опытной группы, по сравнению с контрольной, напротив, повысилось на 5,34%.
По данным Косолаповой В.Г.(1997),изучавшей влияние пробиотика лак-тоамиловорина на организм телят молочного периода, количество лейко 76 цитов у телят опытных групп возрастало на 9,3-24,1%.
В лейкоцитарной Формуле во всех опытных вариантах, по сравнению с контрольными, наблюдается снижение эозинофилов, повышение сегменто-ядерных нейтрофилов и лимфоцитов (от 0,8% до 4,37%),что также свидетельствует о положительном влиянии пробиотиков на организм животных в раннем постнатальном периоде.
Сравнительное изучение влияния руменолакта, биосана и бифидумбактерина на исследуемые показатели
Становление защитных функций организма, продуктивность и воспроизводительная способность, последукщая адаптация к условиям содержания и хозяйственной эксплуатации животных в значительной степени определяется особенностями внутриутробного и неонатального развития.
В этой связи, как пишет П. А. Емельяненко (1980), изучение биологии развивающихся животных, действия на них различных веществ, стимулирующих защитные функции организма, объективная характеристика жизнеспособности организма на ранних этапах онтогенеза имеет определяющее значение.
Формирование естественной резистентности, становление иммунного статуса млекопитающих во многом определяется инокуляцией желудочно-кишечного тракта микроорганизмами, составляющими биоценоз нормальной, т.е.постоянно существующей симбиотической микрофлоры. Этот этап можно считать пусковым механизмом в создании естественного иммунитета. У гнотобионов вследствие отсутствия нормальной микрофлоры, резко нарушаются процессы Формирования защитных свойств организма. При этом наблюдается гипоплазия лимфоидной ткани и лимФоидных органов, недостаточность иммунокомпетентных эффекторных систем.
В последние годы накапливается все больше фактов, свидетельствующих о том, что иммунная система оказывает влияние на другие функциональные системы организма. Продукты иммунной системы являются мощными регуляторными факторами, действующими на функцию органов кроветворения, нервную, эндокринную и другие системы. Как утверждает Ю.Н.Федоров (1996), от того, насколько функционирует иммунная система, зависят многие процессы нормальной жизнеспособности организма.
Поэтому, в раннем постнатальном онтогенезе, в период Формирования адаптогенных иммунных реакций целесообразно использовать средства, стимулирующие развитие отдельных звеньев иммунной системы. В настоящее время в ветеринарную практику широко внедряются препараты из молочнокислых и бифидобактерий для лечения и профилактики желудочно-кишечных заболеваний у молодняка сельскохозяйственных животных и птицы, которые обладают иммуностимулирующим действием.
Иммуномодулирующее действие пробиотиков связано со способностью микроорганизмов, входящих в их состав, транслоцироваться, то есть проникать в органы и ткани. Было установлено, что после перорального введения пробиотиков при контакте со слизистой ротоглотки, пищевода и желудка примерно 1,0% от общего числа микроорганизмов, в первые минуты проникают в кровь, а затем в паренхиматозные органыСТ.Н.Nguyen, 1989). Это явление, квалифицируемое как бессимптомная транслокация микробов, следует рассматривать в качестве одного из начальных звеньев естественного механизма стимулирования резистентности макро-организмаСА.В.Вьюницкая,,Р..Резник, ,991)1
Было отмечено, что у животных, получавших перорально биопрепараты, параллельно с процессами транслокации, которые регистрировались в динамике с бактериологическими исследованиями крови, наблюдалось повышение фагоцитарной активности клетокСЛ. Novak, 1992). При электронном микроскопировании препаратов крови телят на четвертые сутки после введения биопрепаратов выявлено изменение структуры моноцитов, что свидетельствует об их активацииСВ. В. ССмрннов 1993).
Цитохимическими исследованиями установлено повышение активности неспецифических Фосфотаз и сукцинат - дегидрогеназ в макрофагах. Это доказывает влияние пробиотических препаратов на стимуляцию защитных реакций организма.
Использованные в наших исследованиях пробиотики - руменолакт,био - 102 сан, биФидумбактерин,путем их добавок в рацион телят окзали влияние, прежде всего, на уровень обменных процессов в организме животных, проявили лечебно-профилактический эффект. Так, у телят,ооытных ггруп с признаками диспепсии (учащении дефекации, повьшении температуры) полное выздоровление наступало на 3-4 сутки с момента перорального введения пробиотиков, тогда как у телят контрольных групп, получавщих традиционные антибиотики в случае заболевания, клинические признаки инфекции исчезали на 6-8 сутки.
Необходимо отметить различия в течении заболевания у животных контрольных и опытных групп. Поскольку у телят контрольных групп заболевание носило затяжной характер, они были более вялы, малоподвижны, чем телята опытных групп, у них наблюдалась учащенная дефекация и отсутствие аппетита.
Лечебное действие пробиотиков и быстрое выздоровление телят сопровождалось улучшением аппетита животных,лучшей поедаемостью ими корма и повышением прироста их живой массы. Так, у телят, получавших руме-нолакт, в сравнении с контрольными, прирост живой массы увеличился на 10-15,1%, биосан - на 4,0-7,0%, биФидумбактерин - на 4,15-7,2%.
Применение пробиотиков, в конечном счете,повышало эффективность использования кормов. Затраты корма на 1кг прироста живой массы снижались в эксперименте на О,16-0,54 кормовые единицы, что говорит об экономической эффективности применения препаратов. В исследованиях А.Е.ЕрзикянаС1971) и И. ГГ ПивнякаС 1982) )становлвлен что обобащещие пищеварительного тракта молочнокислыми и бифидобактериями активизирует секреторную ФуНКЦИю пищеварительной системы, благоприятствует всасыванию кальция и железа. Все это благотворно сказывается на обменных процессах в организме. По данным этих авторов прирост живой массы у телят опытной группы был на 16,6-19% выше,в сравнении с контрольными а затраты корма на 1кг прироста живой массы снижались