Электронная библиотека диссертаций и авторефератов России
dslib.net
Библиотека диссертаций
Навигация
Каталог диссертаций России
Англоязычные диссертации
Диссертации бесплатно
Предстоящие защиты
Рецензии на автореферат
Отчисления авторам
Мой кабинет
Заказы: забрать, оплатить
Мой личный счет
Мой профиль
Мой авторский профиль
Подписки на рассылки



расширенный поиск

Влияние производных 1,3,4-тиадиазина на активность сукцинатдегидрогеназы митохондрий печени млекопитающих Алисултанова Надежда Жафаровна

Влияние производных 1,3,4-тиадиазина на активность сукцинатдегидрогеназы митохондрий печени млекопитающих
<
Влияние производных 1,3,4-тиадиазина на активность сукцинатдегидрогеназы митохондрий печени млекопитающих Влияние производных 1,3,4-тиадиазина на активность сукцинатдегидрогеназы митохондрий печени млекопитающих Влияние производных 1,3,4-тиадиазина на активность сукцинатдегидрогеназы митохондрий печени млекопитающих Влияние производных 1,3,4-тиадиазина на активность сукцинатдегидрогеназы митохондрий печени млекопитающих Влияние производных 1,3,4-тиадиазина на активность сукцинатдегидрогеназы митохондрий печени млекопитающих Влияние производных 1,3,4-тиадиазина на активность сукцинатдегидрогеназы митохондрий печени млекопитающих Влияние производных 1,3,4-тиадиазина на активность сукцинатдегидрогеназы митохондрий печени млекопитающих Влияние производных 1,3,4-тиадиазина на активность сукцинатдегидрогеназы митохондрий печени млекопитающих Влияние производных 1,3,4-тиадиазина на активность сукцинатдегидрогеназы митохондрий печени млекопитающих Влияние производных 1,3,4-тиадиазина на активность сукцинатдегидрогеназы митохондрий печени млекопитающих Влияние производных 1,3,4-тиадиазина на активность сукцинатдегидрогеназы митохондрий печени млекопитающих Влияние производных 1,3,4-тиадиазина на активность сукцинатдегидрогеназы митохондрий печени млекопитающих Влияние производных 1,3,4-тиадиазина на активность сукцинатдегидрогеназы митохондрий печени млекопитающих Влияние производных 1,3,4-тиадиазина на активность сукцинатдегидрогеназы митохондрий печени млекопитающих Влияние производных 1,3,4-тиадиазина на активность сукцинатдегидрогеназы митохондрий печени млекопитающих
>

Диссертация - 480 руб., доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Автореферат - бесплатно, доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Алисултанова Надежда Жафаровна. Влияние производных 1,3,4-тиадиазина на активность сукцинатдегидрогеназы митохондрий печени млекопитающих: диссертация ... кандидата Биологических наук: 03.03.01 / Алисултанова Надежда Жафаровна;[Место защиты: Институт физиологии Коми научного центра Уральского отделения Российской академии наук], 2016

Содержание к диссертации

Введение

Глава 1. Обзор литературы 11

1.1. Роль митохондрий в образовании энергии клетки 11

1.2. Особенности строения и функционирования сукцинатдегидрогеназы 14

1.2.1. Общая классификация ферментов суперсемейства сукцинатдегидрогеназы 15

1.2.2. Строение сукцинатдегдрогеназного комплекса эукариот 18

1.2.3. Химическая реакция, катализируемая сукцинатдегидрогеназой

1.2.4. Процесс сборки сукцинатдегидрогеназного комплекса и факторы его регуляции 24

1.2.5. Ингибиторы сукцинатдегидрогеназы и соединения, влияющие на ее активность 27

1.2.6. Патологии, ассоциированные с генетическими нарушениями структуры сукцинатдегидрогеназы 31

1.2.7. Функционирование сукцинатдегидрогеназы в условиях гипоксии 33

1.2.8. Участие комплекса II в генерации активных форм кислорода 37

1.3. Строение и физиологческая активность соединений класса 1,3,4 тиадиазина 39

ГЛАВА 2. Материалы и методы 42

2.1. Объекты исследования 42

2.2. Методы исследования 43

2.2.1. Выделение митохондриальной фракции из печени экспериментальных животных 44

2.2.2. Определение концентрации белка в суспензии митохондрий 44

2.2.3. Определение активности митохондриальной сукцинатдегидрогеназы 44

2.2.3.1. Определение активности сукцинатдегидрогеназы в суспензии з

нативных митохондрий 44

2.2.3.2. Определение активности сукцинатдегидрогеназы в суспензии

митохондрий после предварительной инкубации с тиадиазинами 46

2.3. Статистическая обработка данных 49

ГЛАВА 3. Результаты исследования 50

3.1. Изменение активности сукцинатдегидрогеназы митохондрий печени крыс

после воздействия производных 1,3,4-тиадиазина в условиях in vitro 50

3.1.1. Активность сукцинатдегидрогеназы митохондрий печени крыс до и после инкубации митохондрий с производными 1,3,4-тиадиазина 50

3.1.2. Половые различия в активности сукцинатдегидрогеназы митохондрий печени крыс до и после воздействия производных 1,3,4-тиадиазина 52

3.1.3. Возрастные различия активности сукцинатдегидрогеназы митохондрий печени крыс до и после воздействия производных 1,3,4-тиадиазина 54

3.2. Влияние производных 1,3,4-тиадиазина на активность митохондрий

печени кролика, кошки и свиньи 56

3.2.1. Активность сукцинатдегидрогеназы митохондрий печени кролика до и после воздействия производных 1,3,4-тиадиазина 56

3.2.2. Активность сукцинатдегидрогеназы митохондрий печени кошки до и после воздействия производных 1,3,4-тиадиазина 57

3.2.3. Активность сукцинатдегидрогеназы митохондрий печени свиньи до и после воздействия производных 1,3,4-тиадиазина 57

3.3. Межвидовые различия в активности сукцинатдегидрогеназы митохондрий печени крысы, кролика, кошки и свиньи до и после воздействия производных 1,3,4-тиадиазина 58

ГЛАВА 4. Обсуждение 60

4.1. Межвидовые различия в активности сукцинатдегидрогеназы митохондрий печени млекопитающих 60

4.2. Степень ингибирующего эффекта производных 1,3,4-тиадиазина на активность сукцинатдегидрогеназы митохондрий печени животных в условиях in vitro в зависимости от химической структуры этих соединений 66

4.3. Возможные сайты связывания сукцинатдегидрогеназы с производными 1,3,4-тиадиазина 71

4.4. Физиологическая роль изменения функционирования сукцинатдегидрогеназы в клетке 75

Заключение 78

Список сокращений 80

Список литературы

Введение к работе

Актуальность темы. Познание механизмов адаптации человека, попадающего в особые или экстремальные условия, а также разработка методов, позволяющих повысить устойчивость организма к пребыванию в таких условиях, является фундаментальной медико-биологической проблемой. При техногенных авариях и природных катастрофах человек часто оказывается в замкнутых помещениях в условиях недостаточного содержания кислорода (подводные лодки и аппараты, авиакосмические объекты, шахты, подземные сооружения) (Castellani et al., 2005; Faras, 2013; West, 2013; Wolf, 2014). Выживание организма в таких условиях во многом ограничено плохой переносимостью гипоксии головным мозгом. Известно, что в отсутствии кислорода резерв времени для сохранения полноценной мозговой деятельности не превышает 5-10 минут (Hochachka et al., 1994). Решение проблемы выживания в таких условиях возможно путем искусственного снижения потребления кислорода некритическими органами и системами (например, мышечной системой), а также относительного снижения чувствительности мозга к гипоксии. Для этого традиционно используют общее охлаждение организма, а также применение антигипоксических препаратов, улучшающих утилизацию кислорода органами и тканями (Чернилевский, 2008). Однако, в условиях нехватки кислорода в закрытых помещениях ни охлаждение, требующее сложного технического обеспечения, ни средства, повышающие утилизацию кислорода, не могут быть использованы. В таком случае важное практическое значение могут приобрести соединения, вызывающие гипометаболический эффект, что способствует сохранению функциональных резервов организма в условиях недостатка кислорода и повышению устойчивости к гипоксии.

Существуют сведения об особенностях и механизмах формирования таких гипометаболических состояний как гибернация (Staples, 2014), эстивация (Storey, Storey, 2012) анаэробиоз (Brooks, Storey, 1997), ангидробиоз (Erkut, 2012), которые широко распространены у животных для выживания в неблагоприятных условиях среды. При этом наблюдается снижение скорости метаболизма до 20-30%, или даже до 1-10% от нормы, что может продолжаться от нескольких дней до нескольких месяцев (Чернилевский, 2008; Daniels et al., 2010; Storey, Storey, 2007; Storey, Storey, 2012). Однако, есть мнение, что млекопитающие, не впадающие в спячку, включая человека, не могут формировать состояния, подобные гипобиозу, поскольку он сопровождается глубокой гипотермией, которая приводит к фибрилляции желудочков и остановке сердца (Чернилевский, 2008). Вместе с тем, ряд научных работ свидетельствуют о возможности формирования у мышей гипометаболических состояний, например, с помощью

метаболита 5'-аденозинмонофосфата (Daniels et al., 2010) или субтоксических концентраций газообразного сероводорода (Bos et al., 2009). При этом наблюдается снижение частоты сердечных сокращений, температуры тела практически до температуры окружающего воздуха, снижение образования СО2 на 60% и потребления О2 на 90 %. Кроме того, существует гипотеза о возможности формирования у человека гипоксического гипометаболизма, как в результате снижения образования макроэргических соединений, вследствие нарастающего дефицита кислорода в клетках, так и по причине снижения энергетического запроса в ответ на энергетическую недостаточность любой этиологии, что проявляется снижением интенсивности метаболизма (Гришин, 2011).

Несмотря на то, что в настоящее время существуют несколько методов получения искусственного гипобиоза, следует отметить, что у многих видов лабораторных животных гипобиоз достигается на ограниченное время с помощью трудоемкого комбинированного воздействия фармакологических средств (резерпин, орнид), газовых сред с повышенным содержанием СО2, голода и снижения температуры тела, и зачастую является неэффективным (Чернилевский, 2008). В связи с этим поиск безопасных химических соединений, способных с меньшими трудностями формировать гипометаболические состояния у млекопитающих, остается актуальным.

В Институте органического синтеза им. И.Я. Постовского УрО РАН (г. Екатеринбург) синтезированы производные 1,3,4-тиадиазина, и в лабораторных экспериментах на мелких теплокровных животных (мыши, крысы) показано, что тиадиазины проявляют общий гипометаболический эффект, сопровождающийся снижением потребления кислорода. Кроме того, из данных литературы известно, что соединения, принадлежащие к классу тиадиазинов, обладают широким спектром фармакологической активности (Логвинова и др., 2010; Almajan et al., 2010; Shehry et al., 2010). Например, среди производных 1,3,4-тиадиазина существуют соединения, обладающие миорелаксирующей, антиспазмолитической активностью (Novikova et al., 1992), гиполиподемическим и гипергликемическим эффектами (Бойко и др., 2009), вещества, снижающие агрегацию тромбоцитов (Campillo et al., 2000) и благотворно влияющие на течение системного воспаления при остром инфаркте миокарда (Sarapultsev P. et al., 2012) и остром панкреатите (Sarapultsev A. et al., 2012), производные с антибактериальными, противовирусными (Yang et al., 2011), противогрибковыми и антиоксидантными (ai et al., 2014) эффектами. Однако, несмотря на разнооообразие биологической активности тиадиазиновых соединений механизм их действия на клеточном уровне остается мало изученным.

Среди обсуждаемых клеточных механизмов развития гипометаболизма выделяют снижение митохондриальных процессов энергообразования, поскольку в покое именно в митохондриях генерируется до 2/3 необходимой энергии в виде макроэргических соединений, и используется до 90% поступающего в организм кислорода (Титов, 2012; Osellame et al., 2012; Smith et al., 2012). Центральным звеном энергетического метаболизма клетки выступают ферментные системы электрон транспортной цепи и цикла Кребса митохондрий. Одним из таких ферментов является сукцинатдегидрогеназа (СДГ; КФ 1.3.99.1), которая относится к классу оксидоредуктаз и локализуется на внутренней мембране митохондрий. СДГ является единственным митохондриальным ферментом, который участвует, как в реакциях цикла Кребса, где он катализирует окисление сукцината до фумарата, так и в переносе электронов в составе комплекса II дыхательной цепи митохондрий (Saraste, 1999; Ackrell, 2000; Cecchini, 2003; Rutter et al., 2010; Iverson, 2013). Поэтому, регулируя ее активность можно корректировать характер протекания метаболических процессов в клетке с целью приспособления организма к условиям окружающей среды.

В соответствии с выше изложенным, особый интерес представляет поиск оптимального соединения, способного оказывать гипометаболический эффект на организм, возможно, в результате действия на активность митохондриальных ферментов, в частности, на активность ферментов цикла Кребса, для сохранения жизненно важных функций организма в экстремальных условиях существования, таких как гипоксия. Поэтому тестирование новых производных 1,3,4-тиадиазина на их способность изменять активность митохондриальной сукцинатдегидрогеназы млекопитающих является актуальным.

Цель исследования. Изучить влияние производных 1,3,4-тиадиазина на активность сукцинатдегидрогеназы митохондрий печени млекопитающих в условиях in vitro.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Определить активность сукцинатдегидрогеназы в суспензии нативных
митохондрий печени млекопитающих.

2. Определить активность сукцинатдегидрогеназы в суспензии митохондрий,
инкубированных с растворами производных 1,3,4-тиадиазина.

3. Оценить степень физиологического воздействия производных 1,3,4-тиадиазина
на сукцинатдегидрогеназу митохондрий печени млекопитающих в зависимости от
химической структуры этих соединений.

Научная новизна исследования. Впервые выявили способность производных 1,3,4-тиадиазина ингибировать активность СДГ митохондрий печени млекопитающих в условиях in vitro. В результате скрининга тиадиазиновых соединений обнаружили вещества с минимальным и максимальным ингибирующим эффектом на активность фермента. Установили характер влияния структуры тиадиазиновых соединений на степень их воздействия на СДГ митохондрий печени экспериментальных животных. Определили возможные участки молекулы производных 1,3,4-тиадиазина, отвечающие за их физиологическую активность. Расширили данные об активности СДГ митохондрий печени млекопитающих в зависимости от возраста и вида животного.

Научно-практическая значимость исследования. Полученные результаты расширяют знания о химических соединениях, способных влиять на метаболические пути клетки, которые могут быть использованы с целью сохранения жизнеспособности организма в неблагоприятных условиях среды. Кроме того, результаты нашего исследования обеспечивают начальную базу в области разработки и тестирования фармакологических препаратов с гипометаболическим эффектом на основе новых производных 1,3,4 – тиадиазина.

Основные положения, выносимые на защиту:

  1. Активность сукцинатдегидрогеназы нативных митохондрий печени зависит от видовой принадлежности млекопитающих.

  2. Производные 1,3,4-тиадиазина ингибируют активность сукцинатдегидрогеназы митохондрий печени млекопитающих в условиях in vitro.

  3. Наибольший ингибирующий эффект производных 1,3,4-тиадиазина зависит от наличия в их структуре морфолинового кольца. Характер заместителя в 5-м положении тиадиазинового кольца влияет на степень физиологического воздействия производных 1,3,4-тиадиазина.

Апробация диссертации. Материалы исследования были представлены на молодежной научной конференции ФГБУН Института физиологии Коми научного центра УрО РАН (Сыктывкар, 2014); на Уральском научном форуме «Современные проблемы органической химии» (Екатеринбург, 2014).

Личное участие автора в получении результатов. Автором самостоятельно выполнены экспериментальные процедуры и статистическая обработка полученных данных. Материалы представленной работы обсуждались и публиковались лично, совместно с сотрудниками рабочей группы и с научным руководителем.

По материалам исследования опубликованы 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК, и 2 работы в рамках докладов материалов конференций.

Легитимность исследования. При обращении с животными соблюдали все правила биоэтики (Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, изложенные в публикации – The National Institute of Helth. NIH No. 85-23, в редакции 1996 г.). Протоколы экспериментов одобрены независимым локальным комитетом по этике Института физиологии Коми НЦ УрО РАН (протокол № 34 от 10 мая 2016 г.).

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 108 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, главы результатов исследования и их обсуждения, общих выводов по работе. Список цитируемой литературы включает 40 отечественных и 172 зарубежных источников. Работа содержит 22 рисунка и 12 таблиц.

Работа выполнена в отделе экологической и медицинской физиологии Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института физиологии Коми научного центра Уральского отделения Российской академии наук в период прохождения аспирантуры (2011-2014) совместно с ФГАОУ ВПО «Уральский федеральный университет» имени первого Президента России Б.Н. Ельцина» и с Институтом органического синтеза им. И.Я. Постовского Уральского отделения Российской академии наук, г. Екатеринбург при поддержке Программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Фундаментальные науки – медицине» (проект ФНМ 12-П-4-1031) и программы ориентированных фундаментальных исследований УрО РАН (проект 12-43-003-ВМА) «Исследование механизмов действия производных тиадиазинов при регулируемом снижении потребления кислорода в организме млекопитающих».

Общая классификация ферментов суперсемейства сукцинатдегидрогеназы

Сборка сукцинатдегидрогеназного комплекса начинается с импорта его субъединиц из цитозоля в митохондрии с помощью белков ТОМ и TIM23, что опосредовано N-терминальной сигнальной последовательностью каждой белковой субъединицы ферментного комплекса. Важным процессом сборки СДГ является удаление сигнальной последовательности протеазами (Schmidt et al., 2010), так как ФАД связывается исключительно с протеолитически обработанным белком СдгА (Robinson et al., 1992). После импорта и процессинга происходит связывание СдгА с ФАД в митохондриальном матриксе с участием АТФ, ионов магния, сукцината/фумарата, белкового фактора Сдг5, при этом СдгА складывается в промежуточную структуру. (Walsh, 1980; Decker, 1993). Из работы Sun F. et al. (2005) следует, что сборка и функционирование СДГ зависит от аминокислотного состава С-терминального домена СдгА, который состоит из двух петель, связанных между собой двумя Р-листами, и находится на поверхности СдгА. Расстояние между С-терминальным доменом и ФАД составляет 17 А. Удаление 70-ти аминокислотных остатков (Robinson et al., 1996) или мутация по набору ключевых аминокислотных остатков (цистеин аргенин вместе с аланином) (Kim et al., 2012) С-терминального домена приводит к прекращению ковалентного связывания СдгА с ФАД и, следовательно, к нарушению сборки тетрамерного комплекса СДГ. Следующим этапом сборки комплекса служит связывание СдгА с СдгВ, что обуславливает стабилизацию СдгА и предотвращает его деградацию и агрегацию, особенно на свету. Заключительным процессом в образовании структуры СДГ является взаимодействие СдгС с СдгД. Механизм взаимодействия каталитического домена с мембранным остается не известным (Sun et al., 2005).

Известно, что сборка и активность комплексов ЭТЦ контролируется большим количеством специфических белковых факторов, синтезируемых клеткой (Rutter et al., 2010). Одним из известных факторов, регулирующих работу СДГ, является белковый комплекс Тст 62 с молекулярной массой от 200 до 850 кДа, сходный по строению с белками класса шаперонов Hsp 60, который выполняет функцию поддержания стабильности митохондриальных белков в условиях стресса, например, термостабильности функционирования митохондриального дыхания (Klanner et al., 2000). Исследования показали, что повышенная экспрессия Тст62 в клетках млекопитающих ингибирует апоптоз, обусловленный отсутствием фактора роста (VanderHeiden et al., 2002). Точная структура и биохимическая роль Тст62 в функционировании клетки в настоящее время до конца не изучены (Rutter et al., 2010).

Другим белковым фактором СДГ является мембранный низкомолекулярный белок Flxl, который относится к суперсемейству митохондриальных переносчиков, обеспечивающих обмен субстратами между цитозолем и матриксом, и участвует в транспорте ФАД в митохондрии (Rutter et al., 2010). Это семейство характерно исключительно для эукариот, причем транспортируемыми субстратами могут быть нуклеотиды, аминокислоты, неорганические ионы и промежуточные соединения ЦТК, такие как сукцинат, оксалоацетат, манат. Flxl является гомологом переносчика витамина В9 (фолата) и гомологом растворимого белкового переносчика в клетках млекопитающих, который осуществляет транспорт АТФ/АДФ в митохондриальной внутренней мембране. Структурная модель Flxl, основанная на гомологии этих транспортных белков, предполагает присутствие 6-ти трансмембранных петель, которые вместе формируют пору для транспорта субстрата (Robinson et al, 2006). Исследования in vitro на очищенных митохондриях показали, что дефекты соответствующего гена приводят к снижению транспорта ФАД и, соответственно, к ослаблению митохондриального дыхания в целом (Tzagoloffet al., 1996). Однако, существует мнение, что данный переносчик осуществляет не импорт, а экспорт ФАД, а снижение активности СДГ митохондрий при повреждении гена, кодирующего Flxl, происходит, так как Flxl, как предполагают, регулирует посттранскрипционную экспрессию СдгА (Bafunno et al., 2004).

Нестабильным компонентом комплекса СДГ является небольшой (115 аминокислот) растворимый белок SDHAF1 (Ghezzi et al, 2009). Существуют сведения, что дефекты соответствующих генов приводят к развитию прогрессивной инфантильной энцефалопатии, тяжелого генетического заболевания, сопровождающегося значительным снижением активности СДГ (Bugiani et al, 2006). Однако, точная роль данного фактора остается до конца неизвестной, но есть мнение, что он участвует в введении и удержании железо-серных центров СДГ, что обусловлено наличием LYR мотива в структуре фактора SDHAF1 (Ghezzi et al., 2009), который в других белках отвечает за метаболизм железо-серных центров (Shi et al., 2009).

В организации структуры СДГ принимает участие еще один митохондриальный фактор, такой как Сдг5 - это маленький (около 19 кДа) растворимый белок, который локализуется в митохондриальном матриксе эукариотических клеток и в цитозоле клеток бактерий. В настоящее время не известна точная природа его функционирования, однако, делеция соответствующего гена у дрожжей показывает, что Сдг5 необходим для ковалентного связывания ФАД с СдгА в условиях in vivo (Walsh, 1980; Decker, 1993). Сдг5 является нестабильным компонентом СДГ комплекса, поэтому образует с Сдг А гетеродимер, обеспечивая стабильность обоим белкам, которая является результатом белок-белкового взаимодействия между СдгА и Сдг5 (Нао et al., 2009). Общая структура центра Сдг5 является высоко консервативной и представлена плотным пучком из пяти а-спиралей, на поверхности которого сконцентрированы остатки аминокислот. Этот участок является функционально значимым, так как изменение заряда высоко консервативного аргенина68 (Apr68) этого участка приводило к полному отсутствию связи ФАД с СдгА (Rutter et al., 2010). Фактически, клетки дрожжей, подвергшиеся мутации по гену Сдг5, являются дефективными и не способны к росту в дыхательной среде, что обусловлено отсутствием функционирования СДГ. Мутации двух других аминокислотных остатков (мало консервативного тирозина и неконсервативного її? триптофана ) на периферии высоко консервативного региона также приводили к снижению ковалентного связывания СдгА с ФАД (Eletski et al, 2012).

Активность СДГ при экстремальных и патологических воздействиях на организм может сопровождаться ее компенсаторным ограничением. Ингибирование является естественным механизмом предупреждения чрезмерной активности процесса окислительного фосфорелирования. Неконтролируемая активация СДГ может приводить к гиперэргической реакции системы продукции и повреждению митохондрий (Петрова и др., 2010).

Классическими конкурентными ингибиторами СДГ являются соединения, схожие по строению с сукцинатом, поэтому они способны конкурировать за взаимодействие с активным центром СДГ. К таким соединениям относят малат, оксалацетат (Ackrell, 1974; Gutman et al., 1975; Kenney et al., 1976; Huang et al., 2006), малонат (Ленинджер, 1985; Amaral et al., 2012; Toyoshima et al., 2012), 3-нитропропионат (Alston et al., 1977; Coles et al., 1979; Brouillet et al., 1998; Francis et al., 2013), дигликоевую кислоту (Landry et al., 2013) (рисунок 6). Кроме того, известными соединениями, взаимодействующими с активным центром СДГ и приводящими к ее инактивации, являются бромпируват и этилмалеимид (Felberg, Hollocher, 1972, Kenney, 1975).

Определение активности митохондриальной сукцинатдегидрогеназы

Митохондриальную фракцию клеток печени получали методом дифференциального центрифугирования (Jacobus, Saks, 1982). Все процедуры по выделению митохондрий из печени животных осуществляли на льду при температуре 0-4 С, рабочие растворы, инструменты и лабораторную посуду охлаждали и содержали в рамках данного температурного диапазона. Для получения суспензии митохондрий использовали следующие среды выделения, которые готовили на бидистиллированной воде: 1. ледяная среда выделения: 0,25 М сахароза, 0,001 М динатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА-Маг) (рН = 7,4); 2. 0,25 М раствор сахарозы.

Непосредственно после извлечения печень максимально быстро трижды промывали в ледяной среде выделения и измельчали в чашке Петри. После трехкратного промывания к измельченной ткани добавляли около 40 мл ледяной среды выделения и гомогенизировали на гомогенизаторе Potter S (Sartorius, Germany). Полученный гомогенат центрифугировали 10 минут при 600 g и температуре 0-4С в высокоскоростной центрифуге Avanty J-301 (Beckman Coulter, USA). Супернатант сливали в центрифужные стаканы и центрифугировали при 14000 g в течение 10-ти минут, после чего к осадку добавляли 0,5 мл ледяной среды выделения и суспендировали, затем добавляли 40 мл среды и вновь центрифугировали 10 мин при 14000 g. Полученный осадок суспендировали в 0,5-ти мл 0,25 М раствора сахарозы и центрифугировали 10 мин при 14000 g. Конечный осадок промывали три раза путем наслоения 0,3-х мл 0,25 М сахарозы, затем к нему добавляли 0,5 мл 0,25 М сахарозы и после суспендирования получали суспензию митохондрий, которую замораживали при температуре -20 С.

Определение концентрации белка в суспензии митохондрий осуществляли биуретовым методом (Gornall et al.,1949). Принцип метода состоит в том, что белки в суспензии митохондрий, реагируя в щелочной среде с сернокислой медью, образуют соединения, окрашенные в фиолетовый цвет.

Для определения концентрации белка в суспензии митохондрий к 5-ти мл рабочего раствора биуретового реактива добавляли 0,1 мл митохондрий. Через 30 минут пробу колориметрировали на фотоколориметре КФК-2МП в кювете с длиной оптического пути 10 мм при длине волны 540 нм против оптического контроля, который содержал 5 мл рабочего биуретового реактива и 0,1 мл изотонического раствора хлорида натрия. Расчет концентрации белка вели по калибровочной кривой.

Перед процедурой определения активности СДГ суспензию митохондрий подвергали трехкратному замораживанию/размораживанию для нарушения целостности мембраны и высвобождения фермента. Для оценки активности фермента применяли метод, в котором в качестве конечного акцептора электронов выступает феррицианид калия (Singer, Kearney, 1957). Принцип метода заключается в восстановлении феррицианида калия K3[Fe(CN6], раствор которого имеет желтую окраску, до бесцветного феррицианида калия K4[Fe(CN6] сукцинатом под действием СДГ. Активность фермента пропорциональна количеству восстановленного феррицианида калия. Реакция протекает по следующей схеме: сукцинат + 2 [Fe(CN)6f - фумарат + 2FT + 2 [Fe(CN)6]4 Для определения активности СДГ в суспензии митохондрий готовили растворы опытной и контрольной проб, содержащие 1,48 мл 0,1 М фосфатного буфера (рН=7,8) и по 0,1 мл следующих реактивов: 0,1 М янтарной кислоты (рН=7,8), 25 мМ ЭДТА (рН=7,8), 150 мМ азида натрия, дисстилированной воды. В контрольную пробу добавляли 2 мл 20% трихлоруксусной кислоты (ТХУ), которая приводит к денатурации СДГ с начала инкубации, что препятствует специфическому восстановлению феррицианида калия сукцинатом. Затем в обе пробы вносили по 20 мкл суспензии митохондрий и инкубировали в течение 5-ти минут при комнатной температуре для ингибирования цитохромоксидазы азидом натрия.

Реакцию начинали добавлением 0,1 мл 25 мМ феррицианида калия, затем пробы инкубировали в течение 15-ти минут при температуре 30 С, после чего в опытную пробу добавляли 2 мл охлажденной 20% ТХУ для остановки реакции. Растворы центрифугировали при 3000 об/мин 15 минут для осаждения денатурированного митохондриального белка. Надосадочную жидкость опытной и контрольной проб фотометрировали на фотоколориметре при длине волны 440 нм в кюветах с длиной оптического пути 10 мм против оптического контроля, которым служила смесь растворов 20% ТХУ и 0,1 М фосфатного буфера в соотношении 1:1.

По разности экстинций контрольной и опытной проб (Ек - Еоп) определяли количество феррицианида калия, восстановленного за время инкубации, используя калибровочную кривую. Калибровочную кривую строили по результатам фотометрирования проб, содержащих от 100 до 1000 мкг феррицианида калия в 4-х мл раствора. Учитывая, что реакция протекает стехиометрически и 1 моль сукцината восстанавливает 2 моля феррицианида калия, можно выразить активность СДГ количеством окисленного субстрата в нмолях сукцината/мин на мг белка по следующей формуле: А= 1000m/2Mat, где m - количество восстановленного феррицианида калия в пробе, мкг; а -содержание белка в пробе, мг; М - молекулярная масса феррицианида калия, 329,4 г/моль; t - время инкубации проб с феррицианидом калия, 15 мин.

Половые различия в активности сукцинатдегидрогеназы митохондрий печени крыс до и после воздействия производных 1,3,4-тиадиазина

Известно, что в расчете на единицу веса ткани активность окислительных ферментов в тканях мелких животных более высока. Однако это верно лишь в самом общем виде, поскольку даже у одного животного исходный уровень дыхания разных тканей может быть весьма различным. Отсюда следует, что существуют тонкие механизмы, регулирующие работу ферментных систем в определенных клетках в соответствии с потребностями всего организма (Проссер, 1977).

В работе Alp et al. (1976) по изучению межвидовых особенностей ферментативной активности цикла Кребса в мышцах различных позвоночных и беспозвоночных животных, показано, что у млекопитающих значения активности некоторых ферментов снижаются с увеличением массы тела. Так, например, активность фермента цитратсинтазы в мышцах мыши составила в среднем 146 мкмоль/ мин на г ткани, что на 34%, 53%, 60%, 65% и 63% больше по сравнению с активностью фермента мышц крысы, кролика, овцы, свиньи и быка соответственно. Однако существуют такие митохондриальные ферменты, например, НАД-зависимая изоцитратдегидрогеназа, работа которых определяется метаболическими запросами и особенностями ткани млекопитающих и не соответствует зависимости от массы млекопитающего (таблица 10). Read et al. (1977) показали отсутствие тенденции к снижению активности фермента 2-оксоглутаратдегидрогеназы митохондрий сердца и молочных желез лактирующих млекопитающих (крысы, мыши, кролика, морской свинки, коровы, овцы) и, следовательно, максимальной скорости цикла трикарбоновых кислот, с увеличением массы тела животного. Однако, установлено, что в молочных железах кролика и морской свинки поток гликолитически образованного пирувата для формирования жирных кислот значительно ниже, чем у крыс, и средние значения для активности пируватдегидрогеназы молочных желез кормящих животных уменьшается в ряду крыса кролик морская свинка корова. Таблица 10 - Активности ферментов цикла Кребса в мышцах млекопитающих (М (min-max), в мкмоль/мин на г ткани) Объект Активность цитратсинтазы Активность НАД-зависимойизоцитратдегидроге-назы Активность НАДФ-зависимойизоцитратдегидрогеназы Мышь 146 (136-155) 15(13.9-17,3) 91(79-104) Крыса 96 (89-103) 5.0 (2.7-7.0) 72 (68-75) Кролик 69 (51-104) 2.2 (1.7-2.5) 32 (26-46) Овца 58(36-77) 2.6 (0.7-5.7) 19 (8.8-33) Свинья 50 (44-55) 1.6 (1.3-1.9) 12(10-13) Бык 54 (48-60) 2.9 (1.6-4.2) 23 (19-26) Примечание - цит. по Alp P.R., Newsholme Е.А., Zamrnit V.A. Activities of Citrate Synthase and NAD+-Linked and NADP+-Linked Isocitrate Dehydrogenase in Muscle from Vertebrates and Invertebrates // Biochem. J. 1976. V. 154. P. 689-700).

В классическом исследовании, посвященном изучению особенностей функционирования ферментов энергетического метаболизма в сердце и диафрагме млекопитающих (мышь, крыса, кролик, бык), установлено, что активности ферментов гексокиназы и сукцинатоксидазы снижаются с увеличением массы тела животного (Burleigh, Schimke, 1969). Кроме того, Gauthier and Padykula (1966) показали преобладание красных волокон с большим количеством митохондрий в диафрагме мелких млекопитающих, что связано с более высокой частотой дыхания и частотой сердечных сокращений небольших животных (таблица 11). Таблица 11 - Активности ферментов энергетического метаболизма сердца и диафрагмы различных млекопитающих, показатели их частоты сердечных сокращений (ЧСС) и частоты дыхания (ЧД)

Таким образом, неодинаковая ферментативная активность клеток различных млекопитающих обусловлена генетическими особенностями их морфофункциональной организации. Генетическая информация, заключенная в молекулах ДНК, характеризует морфологические, физиологические и биохимические особенности каждой клетки, которые реализуются в ходе её развития и взаимодействия с окружающей средой. Адаптация живых существ к различным средам обитания, условиям существования, обуславливает различия метаболической активности, связанной с работой многочисленных ферментов (Проссер, 1977; Куценко, 2002). 4.2. Степень ингибирующего эффекта производных 1,3,4-тиадиазина на активность сукцинатдегидрогеназы митохондрий печени млекопитающих в условиях in vitro в зависимости от химической структуры этих соединений Учитывая теоретическую и практическую значимость фармакологически активных соединений, нами проведено исследование по изучению влияния новых производных класса 1,3,4-тиадиазина, известных своей способностью изменять характер некоторых физиологических процессов живого организма (Логвинова и др., 2010; Sarapultsev et al., 2012), на активность СДГ митохондрий печени млекопитающих в условиях in vitro.

Тиадиазиновое кольцо В результате исследования выявлен ингибирующий эффект различной степени производных 1,3,4-тиадиазина, таких как L-2, L-4, L-5, L-7, L-8, L-9, L-10, L-14, L-17, L-29, ТД-100, на активность СДГ митохондрий печени экспериментальных животных, который, очевидно, обусловлен особенностями химической структуры этих соединений. В то же время мы показали, что среди тестируемых производных 1,3,4-тиадиазина соединение L-6 не оказывает влияния на активность фермента митохондрий печени крыс (Алисултанова и др., 2014), поэтому можно предположить, что ингибирующий эффект тиадиазиновых веществ определяется характером заместителей во втором и пятом положениях тиадиазинового кольца (рисуноке 11).

Степень ингибирующего эффекта производных 1,3,4-тиадиазина на активность сукцинатдегидрогеназы митохондрий печени животных в условиях in vitro в зависимости от химической структуры этих соединений

После обнаружения нами ингибирующего эффекта производных 1,3,4-тиадиазина по отношению к активности СДГ митохондрий печени млекопитающих актуальность приобретает вопрос относительно механизма действия этих соединений.

В литературных источниках описаны различные ингибиторы СДГ и механизмы действия многих из них. Установлено, что одни ингибиторы СДГ взаимодействуют с субстрат-связывающимся сайтом фермента, такие как оксалоацетат, малонат, 3-нитропропионат и т.п., другие - с убихинон-связывающимся сайтом фермента, такие как карбоксин, [4,4,4-трифтор-1-(2-тиенил)-1,3-бутандион], и 2-гептил-4-оксихинолин-М-оксид (Miyaderaetal., 2003).

В работе Landry М. et al. (2013) описано, что дигликоевая кислота обладает схожим строением с сукцинатом и ингибирует СДГ, взаимодействуя с активным сайтом фермента. Подобно сукцинату карбонильные атомы кислорода дикарбоксилатных фрагментов дигликоевой кислоты способны образовывать водородные связи с остатком цистеина и аминогруппами активного центра СДГ. Однако вместо одинарной связи между дикарбоксилатными фрагментами в молекуле сукцината, которую окисляет СДГ до двойной связи фумарата, в молекуле дигликоевой кислоты находится эфирная связь, поэтому в данном случае не происходит дальнейшего окисления, что приводит к ингибированию фермента (рисунок 18). вая кислота Сукиинат

Химическое строение дигликоевой кислоты и сукцината Alston et al. (1977) предложили возможный механизм взаимодействия СДГ с 3-нитропропионатом, который состоит в том, что его карбанион атакует флавиновую группу фермента в положении N-5, образуя промежуточное соединение, от которого быстро отсоединяется нитрит с формированием высокореакционного тетраэдрического N-5-имино-аддукта, необратимо ингибирующего фермент. Данная реакция возможна в результате того, что 3 нитропропионат является изоэлектронным относительно сукцината и легко взаимодействует с активным центром фермента (рисунок 19).

Примечание - цит. по. Francis К., Smitherman С, Nishino S.F., Spain J.С, Gadda G. Critical Review: The Biochemistry of the Metabolic Poison Propionate 3-Nitronate and Its Conjugate Acid, 3-Nitropropionate // International Union of Biochemistry and Molecular Biology. 2013. V 65 (9). P. 759-768. днако, несколько позднее Coles et al. (1979) попытались опровергнуть реакцию формирования необратимого аддукта и предложили альтернативный механизм ингибирования СДГ 3-нитропропионатом. Эта гипотеза заключается в медленном окислении 3-нитропропионата до 3-нитроакрилата, который затем может взаимодействовать с ферментом, мгновенно и необратимо инактивируя его. На первом этапе происходит дегидрирование 3-нитропропионата до 3-нитроакрилата путем передачи двух электронов на ФАД СДГ, на втором этапе - нуклеофильное добавление тиольной группы фермента к двойной связи 3-нитроакрилата с образованием тиоэфира и ингибированием СДГ (рисунок 20).

Другими соединениями, обладающие инактивирующим эффектом на фермент СДГ, являются бромпируват и этилмалеимид, которые, как показано в работе Felberg и Hollocher (1972), проявляют схожую кинетику по отношению к ферменту. Авторы предполагали, что ингибирование фермента происходит в результате алкилирования остатка цистеина флавопротеидовой субъединицы СДГ вне активного центра фермента. Однако позднее в исследовании активированной и дезактивированной формы СДГ было показано, что взаимодействие этилмалеимида с сульфгидрильными остатками полностью активированной формы фермента происходит в субстрат-связывающем сайте активного центра СДГ, поскольку использование субстрата и конкурентных ингибиторов фермента, таких как оксалоацетат и малонат, предотвращало связывание фермента с этилмалеимидом (Кеппеу, 1975).

Среди ингибиторов СДГ также выделяют соединения, механизмом действия которых является их взаимодействие с убихинон связывающим сайтом фермента, что приводит к блокированию переноса электронов с сукцината на убихинон и далее в ЭТЦ. В работе Miyadera et al. (2003) на изолированных митохондриях быка показано частичное ингибирование СДГ атпенинами, которые обладают некоторым сходством в химическом строении с убихиноном, что объясняет возможность их взаимодействия с сайтом связывания убихинона (рисунок 21).

Химическое строение ингибитора СДГ атпенина А5 и убихинона Примечание - цит. по Miyadera Н., Shiomi К., Ui Н., Yamaguchi Y., Masuma R., Tomoda H., Miyoshi H., Osanai A. Kita K., Omura S.Atpenins, potent and specific inhibitors of mitochondrial complex I (succinateubiquinone oxidoreductase) // PNAS. 2003. V. 100 (1). P. 473-477.

Несмотря на то что в литературе описаны способы взаимодействия химических соединений с СДГ, механизм ингибирующего воздействия производных 1,3,4-тиадиазина в настоящее время остается неизвестным. Поскольку максимальной степенью влияния на митохондриальный фермент обладают тиадиазиновые производные, содержащие в своей структуре морфолиновый фрагмент, вероятно он легко взаимодействует с СДГ. Однако возникает вопрос о сайте молекулы фермента, с которым связываются производные 1,3,4-тиадиазина. Возможно они взаимодействуют с активным центром СДГ или блокируют убихинон-связывающий сайт фермента, предотвращая перенос электронов дальше по ЭТЦ.

СВЯЗЬ ЦТК С метабоЛИЧеСКИМИ ПуТЯМИ КЛетКИ (https://www.fitfan.ru) Так четырех- и пяти углеродные конечные продукты многих катаболических процессов вступают в ЦТК на промежуточных этапах. Например, оксалацетат и а-кетоглутарат являются продуктами катаболизма аспарагиновой (Zhang et al, 2014) и глутаминовой кислот (Chambers et al, 2010) которые образуются при расщеплении белков; пируват образуется в результате окисления углеводов и превращается в ацетил-Ко-А, который является также продуктом окисления жирных кислот и вовлекается в ЦТК, связывая тем самым ЦТК с процессами катаболизма жиров (Luglio, 2016) (рис. 14). С другой стороны, многие промежуточные соединения ЦТК участвуют в различных метаболических процессах клетки: из а-кетоглутарата синтезируются глутамат, такие аминокислоты как глутамин, пролин и аргинин; сукцинил-Ко-А является предшественником для синтеза порфиринов и гема; цитрат участвует в образовании жирных кислот и стеролов; малат может транспортироваться из митохондрий в цитоплазму, где он обратимо превращается в оксалацетат, который является предшественником для синтеза аминокислот аспартата, аспарагина, метионина, треонина и изолейцина, а также пиримидинов, кроме того оксалацетат может превращаться в фосфоенолпируват, являющийся предшественником в биосинтезе фенилаланина, триптофана, серина, глицина и цистеина (рис. 14). Таким образом, изменяя характер протекания реакций ЦГК, например, в результате ингибирования основных его ферментных систем, таких как СДГ, можно корректировать различные метаболические пути клетки с целью приспособления и выживания организма в экстремальных условиях существования.

Ингибирование активности СДГ приводит к снижению интенсивности митохондриального дыхания и, следовательно, энергетики и, метаболизма клетки в целом. Однако, поскольку в настоящее время обнаружены процессы неферментативного образования субстратов ЦТК с помощью активных форм кислорода (АФК), например, при окислительном стрессе, сохраняется возможность поддержания работы ЦТК для функционирования клетки в условиях ингибирования ферментных систем (Fedotcheva et al., 2006). Кроме того, хорошо известно, что в условиях пониженной активности СДГ в клетке происходит увеличение концентрации сукцината в матриксе митохондрий, который свободно проникает в цитозоль с помощью специализированные переносчики трикарбоновых кислот. Накопление сукцината в цитозоле клетки приводит к активации гипоксия индуцибельного фактора-1а (ГИФ-1а), который проникает в ядро и активирует гены, ответственные за процессы гликолиза, тем самым повышая интенсивность анаэробной энергетики в условиях снижения интенсивности аэробных процессов в митохондриях (Wojtovich et al., 2013).

Таким образом, изменение активности СДГ может привести к изменению характера функционирования основных метаболических путей теплокровных организмов, что в свою очередь, может менять условия для выполнения ими своих функций.