Содержание к диссертации
Введение
CLASS I. Обзор литературы 1 CLASS 0
1.1. Влияние температуры на механическую активность миокарда . 10
1.2. Влияние температуры на хроноинотропную и гетеромет-рическую системы регуляции механической активности.. 26
1.3. Влияние температуры на электрическую активность клеток миокарда 30
CLASS II. Методика исследования 3 CLASS 8
2.1. Объекты исследования 38
2.2. Установка для исследования механических свойств мышцы в изометрическом режиме 40
2.3. Установка для исследования механической активности в изотоническом режиме 41
2.4. Основные растворы, перфузия, термостатирование 42
2.5. Оценка функционального состояния препаратов миокарда, критерии отбора препаратов 42
2.6. Режимы стимуляции при исследовании ритмоинотропных свойств миокарда 46
2.7. Регистрация механической активности сердечной мышцы 49
2.8. Регистрация внутриклеточной электрической активности 51
2.9. Исследование механических свойств сердечной мышцы 51
2.10. Исследование влияния температуры на гомео- и гетеро-метрические звенья регуляции механической активности миокарда методом активного планирования эксперимента 52 Стр.
2. II. Обработка экспериментальных данных 56
2.11.1. Обработка и анализ одиночных изометрических
сокращений 56
2.11.2. Анализ результатов механических испытаний 58
2.12. Материал диссертации 61
III. Влияше температуры на механическую активность мишрда 62
3.1. Введение 62
3.2. Зависимость параметров изометрических сокращений от температуры 67
3.3. Влияние температуры на задержанное развитие напряжения 72
3.4. Влияние температуры на связь "сила-скорость" 79
3.5. Влияние температуры на свойства параллельного и последовательного элементов 82
3.6. Обсуждение 87
ІV. Исследование влияния температуры на миокарда тешкжровных 89
4.1. Введение 89
4.2. Влияние температуры на стационарную связь "частота-сила" в предсердиях и желудочках кролика 91
4.3. Влияние температуры на динамические проявления хроноинотропии 96
4.4. Изучение хроноинотропии при стимуляции случайной последовательностью импульсов (обоснование метода, обработка результатов и протокол эксперимента) 101
4.5. Исследование влияния температуры на хроноинотропию миокарда при стимуляции случайной последовательностью импульсов 106
4.6. К вопросу о механизмах ритмоинотропных явлений в миокарде 117
4.7. Обсуждение результатов 130
V. Исследование температурной зависимости связи "длина-сила" 138
5.1. Введение 138
5.2. Влияние температуры на стационарную связь"длина-сила" 140
5.3. Влияние начальной длины на параметры изометрических, сокращений при разных температурах 146
5.4. Влияние температуры на динамический компонент связи "длина-сила" 153
5.5. Обсуждение 159
VI. Исследование влияния температуры на расслабление миокарда 163
6.1. Введение 163
6.2. Температурная зависимость констант скорости изомет- рического расслабления 165
6.3. Влияние частоты стимуляции на скорость расслабления .
при разных температурах 172
6.4. Влияние начальной длины на скорость расслабления при. разных температурах 176
6.5. Влияние адреналина на скорость расслабления.при
разных температурах 178
6.6. Влияние ионов Ма+ и Са** на скорость расслабления при разных температурах 183
6.7. Заключение 186
Заключение , 188
Выводы 205
Литература 208
- Влияние температуры на механическую активность миокарда
- Установка для исследования механических свойств мышцы в изометрическом режиме
- Зависимость параметров изометрических сокращений от температуры
- Температурная зависимость констант скорости изомет- рического расслабления
Введение к работе
Актуальность проблемы. В последнее время в связи с распространением патологии сердечно-сосудистой системы все большее значение приобретают фундаментальные исследования по физиологии, биофизике и биомеханике сердечной мышцы [7,75] и, в частности, изучение влияния экстракардиальных факторов на механическую функцию сердца.» Одним из аспектов этой проблемы является исследование влияния температуры на различные стороны деятельности миокарда. Важность решения этого вопроса связана с тем, что гипотермия широко используется в кардиохирургической клинике как мера защиты миокарда при операциях на сердце.
Изучение влияния температуры на механическую активность мышечной ткани имеет важное теоретическое значение. Это связано с определением значений энергии активации процессов, влияющих на механическую активность, с выявлением скорость-лимитирующих реакций и сдвигов реактивности мышцы на ионные и фармакологические воздействия при изменении температуры. Важно также знать как модифицируются регуляторные влияния на миокард при охлаждении.
Прикладной аспект проблемы обусловлен широким использованием температуры как фактора замедляющего биохимические процессы и влияющего на функциональную активность органов и тканей при консервации. При проведении, анализе и интерпретации результатов физиологических экспериментов на изолированных препаратах миокарда необходимо также учитывать собственно температурные эффекты.
Хотя влияние охлаждения на сердечно-сосудистую систему в целом и на миокард в частности, являлось предметом целого ряда исследований [12,23,43,57,58,66,72], многие стороны этой проблемы остаются неясными. В частности, представляется мало разрабо-
'тайным вопрос об особенностях гомео- и гетерометрической регуляции механической активности миокарда при разных температурах и, практически отсутствуют работы, посвященные анализу влияния температуры и экстракардиальных факторов на механику процесса расслабления»
Актуальность исследования состояния основных систем регуляции деятельности миокарда при изменениях температуры определяется также возможностью использования результатов изучения в кардио-хирургической клинике в качестве диагностического признака степени повреждения миокарда, т.к. показано изменение ритмоинотроп-ных реакций и механических свойств миокарда уже при ранних стадиях сердечной недостаточности [32,50,141].
Цель работы заключалась в изучении влияния температуры на сократимость сердечной мышцы и выяснении температурной зависимости гомео- и гетерометрической. регуляции механической активности миокарда.
Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:
изучить влияние температуры на параметры сокращения и расслабления миокарда и его механические свойства;
выяснить влияние температуры на ритмоинотропные явления миокарда в статических и динамических режимах стимуляции;
оценить влияние температуры на гетерометрическое звено регуляции механической активности сердечной мышцы;
исследовать влияние преднагрузки, частоты стимуляции и ка-техоламинов на характеристики расслабления в различных температурных режимах;
даті) количественное описание ритмоинотропных явлений в миокарде теплокровных при охлаждении;
- оценить перекрестные эффекты влияния температуры, частоты
7 стимуляции и начальной длины.
Научная новизна. Впервые систематически исследовано влияние температуры на основные свойства контрактильного, последовательного и параллельного эластических элементов в рамках трёх-компонентной модели Хилла.
Впервые исследовано влияние температуры на хроноинотропные явления при стимуляции миокарда случайной последовательностью импульсов.
Впервые изучено влияние температуры на динамические проявления гетерометрической регуляции механической активности миокарда.
Проведен анализ совместного влияния преднагрузки, частоты стимуляции и температуры на механическую активность миокарда теплокровных.
Сопоставлено влияние температуры на изометрические индексы, параметры кривой "сила-скорость" постнагрузочных сокращений и характеристики процесса задержанного развития напряжения.
Впервые для разных температур получены кросскорреляционные функции "интервал-сила", необходимые для количественного описания ритмоиаотропных явлений.
Впервые показано, что при гипотермии происходит инверсия влияния предшествующих интервалов и предшествующего механического состояния на амплитуду изометрических сокращений.
Впервые показано, что при гипотермии уменьшаются постэкстра-систолическая потенциация и инотропныи эффект парной стимуляции.
Научная и практическая ценность работы.
Настоящее исследование носит теоретический характер и посвящено важному вопросу физиологии сердечной мышцы - особенности функционирования миокарда при гипотермии.
8 Работа содержит новое решение актуальной научой задачи, а
именно: раскрывает механизмы влияния гипотермии на механическую активность миокарда, выявляет особенности гомео- и гетерометри-ческой регуляции при различных температурах, раскрывает клеточные механизмы влияния преднагрузки, частоты стимуляции и катехо-ламинов на процессы сокращения и расслабления миокарда при разных температурах.
Полученные результаты могут учитываться при преподавании курса физиологии в медвузах и университетах, а также в кардиохи-рургической клинике, где используется гипотермия. Результаты работы буцут полезны при изучении действия новых фармакологических препаратов, обладающих кардиотропным действием.
На защиту выносятся следующие положения:
В основе влияния понижения температуры на сократимость миокарда лежит падение скорости укорочения контрактильного элемента, что в свою очередь связано с замедлением скорости работы миофиб-риллярной АТФ-азы.
При гипотермии происходит уменьшение эффективности гомео- и гетерометрической регуляции механической активности миокарда.
С понижением температуры в миокарде теплокровных возрастает участие Са-М а-обменной диффузии в регуляции расслабления.
Апробация работы. Результаты исследований по теме диссертации были доложены: на П Всесоюзной конференции по проблемам биомеханики Рига, 1979; на УІ Всесоюзном сипозиуме "Биофизика и биохимия биологической подвижности", Львов, октябрь 1980; на Ш-ей Всесоюзной конференции "Физиология и биохимия медиаторных процессов", Москва, 1980; на конференции "Актуальные вопросы физиологии кровообращения", Оренбург, 1982; на I Всесоюзном биофизическом съезде, Москва, 1982; на Ш Всесоюзной конференции по проблемам биомеханики, Рига, 1983; на ЛІ Всесоюзном симпозиуме
9 "Биофизика ж биохимия мышечного сокращения", Тбилиси - 1983.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 15 печатных работ.
Структура и объём диссертации, диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы по влиянию температуры на механическую активность миокарда, описания методов исследования, четырёх экспериментальных глав, заключения, диссертация изложена на 229 страігацах машинописного текста, включая 53 рисунка, 15 таблиц и библиографию из 207 наименований.
Влияние температуры на механическую активность миокарда
В экспериментах, выполненных на интактном сердце, было показано, что охлаждение приводит к увеличению ударного объема и существенному изменению гемодинамических параметров [57,58]. При этом минутный объем в достаточно широком диапазоне температур остается постоянным, либо незначительно падает. Однако при интактном кровообращении охлаждение приводит к сложным и неконтролируемым гемодинамическим сдвигам и, в частности, к изменению конечнодиастолического давления и постнагрузки, частоты сердцебиений, вязкости крови и т.д. [72.91]. Ввиду такого многообразного влияния температуры часто сложно, а порой невозможно интерпретировать экспериментальные данные. Поэтому мы сосредоточим основное внимание на экспериментах, выполненных на полосках миокарда, где в контролируемых условиях можно провести анализ влияния температуры на конкретные звенья, определяющие механическую активность миокарда.
Все авторы, изучавшие влияние температуры на параметры изометрических сокращений изолированных полосок миокарда,отмечают, что охлаждение приводит к падению скорости сокращения и расслабления, удлинению времени достижения максимума сокращения (ВДМ) и общего времени расслабления [58,72,146]. Результаты разных авторов отличаются лишь конкретными численными значениями температурных характеристик, что можно приписать межвидовым особенностям и частично условиям проведения экспериментов.
Понижение температуры влияет на параметры не только изометрических, но и изотонических сокращений. Так, [186] на изолированном предсердии морской свинки нашли, что при оптимальной для каждой температуры частоте стимуляции скорость изотонического сокращения монотонно падает, когда мышца охлаждается от 37 до 22С. Аналогичные результаты получены и на других животных.
В отношении влияния температуры на амплитуду изометрических сокращений большинство данных свидетельствует, что охлаждение приводит к увеличению этого показателя [12,44,72,91]. Это известно еще со времен Лангендорфа, который на изолированном перфузи-руемом сердце кошки нашел, что максимум механической активности наблюдается при температуре 20С. Причем, рост силы сокращений в спонтанно активных препаратах гомойотермних животных происходит несмотря на падение частоты сердцебиений. При дальнейшем понижении температуры амплитуда сокращений уменьшается. Некоторые авторы сообщали, что сердце не способно сокращаться при температурах ниже 10-15С [91]. Однако при этом не обращали должного внимания на сдвиги возбудимости. На папиллярных мышцах в условиях гипотермии при увеличении амплитуды и силы стимула развиваемое напряжение растет при дальнейшем охлаждении, причем,сокращения могли инициироваться даже при температурах ниже 5С [72].
В экспериментах [194] при оптимальной частоте стимуляции максимум силы сокращений наблкщался при температуре 21,5С. В этих условиях сила сокращений более чем в два раза, превышала силу сокращений при 38С. При постоянной частоте стимуляции оптимальная температура была тем ниже, чем меньше частота стимуляции.
Отметим, что амплитуда калиевой контрактуры имеет тот же температурный коэффициент, что и пик изометрического сокращения [152]. Это свидетельствует о глубоком влиянии температуры на систему электромеханического сопряжения. Более того, данные результаты подчеркивают, что зависимость силы сокращения от температуры в миокарде совершенно иная, чем в скелетной мышце.
При изучении влияния охлаждения на ход калиевых контрактур в миокарде было также показано [103], что связь между концентрацией калия и амплитудой контрактуры при понижении температуры сдвигается влево, что свидетельствует об уменьшении контрактиль-ного порога. Кроме того, показано, что низкая температура замедляет восстановление от предыдущей контрактуры [104].
Увеличение силы сокращений при охлаждении, казалось бы, является неожиданным феноменом и якобы противоречит общим закономерностям влияния температуры на скорость биологических процессов. Чтобы понять этот эффект температуры, важно рассмотреть ее раздельное влияние на степень активации и длительность активного состояния.
Установка для исследования механических свойств мышцы в изометрическом режиме
Исследование механических свойств миокарда в изотоническом режиме выполняли на установке, блок-схема которой представлена на рис. 2.3. Наличие электромагнитного устройства (3) позволяло задавать уровень пред- и постнагрузки с помощью блока управления (5) от 0 до 6 г. Регистрировали механическую активность в изометрическом и изотоническом режимах, а также в режиме постнагрузоч-шх сокращений. Перемещения регистрировали с помощью фотодатчика, чувствительность которого с усилителем постоянного тока (7)-2 В/мм, разрешающая способность - 10 мкм. Линейный диапазон - 2 мм. Сигналы с датчика перемещений и датчика силы (механотрон 6 Мх2Б) регистрировали на фотоплёнку с помощью фотооптического регистратора (8) и самописца - Н 3021-4 (9). В установке использовали стимулятор (6) - ЭСЛ-2. Контур термостатирования включает термо-статирующую камеру (II) с рабочей ячейкой и ультратермостат (10)--10.
Основной раствор содержал в мМ/л & 0 для препаратов миокарда теплокровных животных:NaCl - 137; Щ. - 2,5;СаСЄг- 2,5;МаНС03-10-15; Na HPO - 0,05; M lz - 1,0; глюкоза - 4; для препаратов миокарда холоднокровных животных: МаСЕ - ПО; Ш - 2,5; Na-.HPQj. -2,4; МаНгР04 - 0,08; СлС(!г - IfI; глюкоза - 5,5. КонцентрациюМаНС05 варьировали в диапазоне 10-15 мМ/л Б2О в зависимости от рН воды, используемой для приготовления растворов. Растворы в течение опыта обогащали газовой смесью, содержащей 95$ 0 + 5$ С0 ,и пропускали со скоростью 20-25 мл/мин с помощью перфузионной системы под постоянным гидростатическим давлением через рабочую ячейку, в которой находился препарат. Буферные компоненты растворов обеспечивали рН=7,3 + 0,05. Модификации основного раствора в случаях исследования влияния ионов и фармакологических веществ на механическую активность при разных температурах приводятся в соответствующих разделах.
Перфузионная система, термостатирующая камера с рабочей ячейкой, термостат Ц-3, блок охлаждения (рис.2.2.) позволяли регулировать температуру раствора в рабочей ячейке от 5 до 40С с точностью задания + 0,2С. Скорость изменения температуры в рабочей ячейке при охлаждении - 0,01 град/с. При исследовании влияния температуры на механическую активность миокарда порядок смены температур рандомизировали.
Препарат при 25С стимулировали сверхпороговыми импульсами постоянного тока с частотой 0,2 с""1 при длине Invax. в течение 30 минут. Длину препарата »шос определяли из условия максиму ма активного изометрического напряжения, развиваемого мышцей.
Для оценки функционального состояния препарата применяли комплекс методических приемов, основанных на механических испытаниях [8]. 1. Использовали тест на наличие фазы задержанного развития напряжения (выявление контрактур) нестимулируемой мышцы при ступенчатом изменении длины (рис.2.4). 2. Оценивали отношение активного напряжения (РА ) к пассивному (Ра ) при длине,равной тож (рис.2.5).
Необходимость проведения механических испытаний для предварительного отбора препаратов вытекает из того факта, что амплитуда сокращений не всегда является надежным критерием хорошего функционального состояния полоски миокарда. Различного рода повреждения вызывают в препарате формирование зон с аномальной жесткостью [114, 168], что связано с переходом части клеток миокар-диальной полоски либо в состояние постоянной активации (контрактуры) , либо в состояние ритора. Поскольку в напряжение покоя вносят определенный вклад и пассивные вязкоупругие элементы, и сократительные белки, отделить "контрактурную" составляющую от пассивной вязкоупругой без специальных тестов не представляется возможным.
Известно [27,69], что мышечная ткань в пассивном состоянии представляет собой типичное вязкоупругое тело. Для образца мио-кардиальной ткани, находящегося в состоянии покоя, после ступенчатого изменения длины характерна релаксация напряжения (рис. 2.4 А). В ряде препаратов при ступенчатом изменении длины наблюдали более сложный ответ по напряжению (рис.2.4 Б, В). Как видно из приведенных экспериментальных кривых, ответ включает четыре выраженных фазы: резкий скачок напряжения при растяжении, фазу быстрой релаксации, фазу задержанного прироста напряжения и медленный спад напряжения.
Зависимость параметров изометрических сокращений от температуры
В настоящее время механическое поведение сердечной мышцы принято рассматривать в рамках различных реологических моделей [27,95]. Наиболее распространенной является трехэлементная модель Хилла [90,95], предложенная для описания сокращения мышцы. Согласно этой модели миокард состоит из трех функциональных элементов: сократительного (или контрактильного)-СЕ, генерирующего силу и укорочение за счет энергии гидролиза АТФ; последовательного эластического - SE , соединенного последовательно с СЕ и параллельного упругого - РЕ - для учета упругости мышцы в состоянии покоя (рис.3.1).
Считается [7,27], что в покое СЕ свободно растяжим и не создает напряжения. В активном состоянии его жесткость намного выше жесткости РЕ и SE . Укорочение СЕ в активном состоянии (в случае изометрического сокращения) приводит к растяжению SE и созданию на концах системы силы.
Поскольку задача состоит в том, чтобы описать влияние температуры на механическую активность миокарда, постольку необходимо охарактеризовать температурную зависимость каждого элемента в отдельности и одновременно дать описание механического поведения мышцы в двух основных режимах функционирования: изометрическом и изотоническом Именно такой логики мы придерживались при изложении материала этой главы Свойства основного функционального элемента - СЕ можно охарактеризовать несколькими способами. Во-первых, дать описание СЕ в терминах интенсивности и длительности активного состояния Мерой длительности активного состояния является время достижения максимума сокращения ВАМ , а мерой интенсивности -Ртах Во-вторых, можно учесть [27], что
Максимальное значение этого индекса пропорционально максимальной скорости укорочения контрактильного элемента в изотоническом режиме VmQX . Температурная зависимость изометрическо го индекса (P/P)mQX отражает зависимость от температуры характеристического параметра мышцы - VmQX . Ввиду того, что при таком способе определения V ax зависит одновременно от свойств SE (см, 3.4) и (P/P)max » а эти величины являются температурозависи-мыми, поэтому более точное представление о свойствах СЕ и его зависимости от температуры можно получить при прямом определении кривой "сшта-скорость" по результатам серии постнагрузочных со -кращений. Этот подход мы также использовали в настоящей работе.
Известно, что в условиях постоянной активации (контрактура, тетанус) при воздействии на мышцу синусоидальных деформаций имеется область частот, в которой жесткость с увеличением частоты не растет,как в обычном вязкоупругом теле, а падает - феномен задержанного развития напряжения (задержанной активации) [82, 170]. В этой частотной области характерным образом меняется и фазовый сдвиг между деформацией и напряжением. В резонансной области частот "петля Лиссажу" (координаты деформация-сила) вращается против часовой стрелки, а не по часовой, как в обычном вязкоупругом теле.
На глицеринизироваюшх волокнах показано [82], что способность к развитию задержанного напряжения является свойством акто-миозиновой системы, а константа скорости задержанной активации К А коррелирует с константой скорости гидролиза АТФ актомиозино-вой АТФ-азой [199]. Следовательно, по результатам механических испытаний можно судить о биохимических характеристиках миокарда, обнаружение которых недоступно или затруднено на интактной ткани.
Таким образом, определение изометрических индексов, построение кривой "сила-скорость" по изотоническим сокращениям, а также вычисление константы скорости развития задержанного напряжения позволяют наиболее полно охарактеризовать свойства сократительного элемента при различных температурах.
Температурная зависимость констант скорости изомет- рического расслабления
Существует предположение о том, что в сердцах теплокровных и холоднокровных животных кальций из миоплазмы удаляется разными структурами, соответственно саркоплазматическим ретикулумом и мембраной клеток посредством Са- Na - обмена, либо связыванием Са++ мембраной [28,10$]. При этом не отвергается возможность одновременной работы этих структур. В связи с этим мы проводили эксперименты на миокарде, изолированном из предсердий и желудочков животных с различным удельным содержанием саркоплазматиче-ского ретикулума: кролика, где предполагается, что удаление Са44 из миоплазмы обсуловлено работой СР; лягушки, где наличие СР спорно [l83]; черепахи, в миоцитах которой показано присутствие некоторого количества СР - большего, чем у лягушки, но меньшего, чем у кролика [ІЗЗ].
Препарат помещали в камеру при комнатной температуре (20-23С) и стимулировали 40-60 мин. с частотой 0,33-0,25 с. Затем для данного препарата находили длину, при которой сила - сокращений максимальна ( і п,аэс ), и далее весь эксперимент прово дили на этой длине. Несмотря на некоторый гистерезис, основные результаты слабо зависели от направления изменения температуры. При кавдой температуре препарат выдерживали по 10-15 мин. для достижения стационарных условий. Чтобы не учитывать влияние частоты стимуляции на величину констант скорости расслабления [28], обсчет данных изометрического расслабления проводили для первого после паузы сокращения или частоту меняли так, чтобы соотношение межишульсный интервал стимуляции-длительность сокращения при изменении температуры оставалось приблизительно постоянным. Данные, полученные этими двумя способами, аналогичны.
Влияние температуры отчетливо проявилось в увеличении констант скорости расслабления с повышением температуры. Кроме того, температурные сдвиги приводили к заметному изменению временного хода расслабления миокарда кролика. Если считать за время расслабления время от максимума напряжения до падения его до 90-95$, то при высокой температуре (35С) почти весь этот участок апрок-симируется экспонентой. При ЮС почти все время расслабления приходится на фазу с квадратичным расслаблением (табл.6.1).
Полученные величины констант скорости расслабления даже при одной температуре имели значительный разброс по препаратам одного и того же вида. Например, для желудочков кролика при 35С были получены Кр, равные 8,6-2,7 с"1, а для предсердий - 17-12 с"1. Однако во всех случаях и в желудочках, и предсердиях кролика в координатах Аррениуса график зависимости константы скорости расслабления КР от температуры хорошо описывался прямой в диапазоне 15-35С с коэффициентом корреляции линии регрессии Г =0,96-0,99 (рис.6.1). При ЮС чаще всего возникали постсокращения, что исключало возможность анализировать расслабление указанным способом.
В одиночном сокращении миокарца лягушки также можно выделить участок кривой изометрического расслабления после достижения максимальной скорости расслабления с экспоненциальной кинетикой, В этом случае зависимость Кр от температуры в координатах Аррени-уса описывается одной прямой с коэффициентом корреляции г 0,95. При температурах выше 25С.чувствительность к температуре снижается, что отражается меньшим наклоном графика и его нелинейностью (рис.6.2). В таблице 6.2 содержатся данные только для линейного диапазона.
Сравнение средних величин энергии активации (усреднение по препаратам) для миокарда кролика и лягушки дает достоверное различие с р 0,05. Это справедливо для диапазона температур 15-25С и тем более - для высоких температур.
Для анализа кинетики изометрического расслабления миокарда мы использовали еще одну константу скорости расслабления, полученную из описания начальной фазы спада изометрического напряжения (если принять, что временной ход расслабления следует зависимости Р0 ехр (- ріг) ). В этом случае для миокарда кролика и лягушки определяются и Кр,и с р. Для миокарца черепахи и ряда препаратов миокарда лягушек "квадратичное" описание подходит для всей кривой расслабления, щ следовательно, временной ход расслабления определяется только константой Л-р .
