Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 11-41
1.1. Общая характеристика пищеварения 11
1.2. Структура слизистой оболочки тонкой кишки 16
1.3. Энзиматическии барьер тонкой кишки 20
1.3.1. Ферменты полости тонкой кишки 21
1.3.2. Ферменты слизи 22
1.3.3. Ферменты гликокаликса 22
1.3.4. Мембранные ферменты 25
1.3.5. Внутриклеточные ферменты 26
1.3.6. Ферменты постэпителиальных слоев тонкой кишки в норме и после экстремальных воздействий 27
1.4. Возрастные особенности энзиматического барьера тонкой кишки ..30
1.5. Влияние стресса на энзиматическии барьер тонкой кишки крыс1 разного возраста : 34
1.6. Возрастные особенности энзиматического барьера тонкой кишки при белковом голодании. 36
ГЛАВА 2. Материалы и методы 42-52
2.1. Экспериментальные животные и условия проведения опытов; 42
2.2. Методика разделения стенки тонкой кишки на эпителиальный, стромальный и мышечно-серозный слои 43
2.3. Получение гомогенатов слизистой оболочки тонкой кишки и ее слоев-44
2.4. Определение активности ферментов тонкой кишки и ее слоев 45
2.4.1. Определение активности сахаразы 45
2.4.2. Определение активности аминопептидазы М 47
2.4.3. Определение активности глицил-1-лейциндипептидазы 48
2.4.4. Определение содержания белка 49
2.5. Определение кортикостероидов в плазме крови 51
2.6. Обработка результатов экспериментов 52
ГЛАВА 3. Результаты собственных исследований 53-143
3.1. Активность ферментов в эпителиальном, стромальном и мышечно-серозном слоях тонкой кишки у крыс различных возрастных групп 53
3.1.1. Активность сахар азы в разных слоях тощей и подвздошной кишки молодых, зрелых и старых крыс 53
3.1.2. Активность аминопептидазы М в разных слоях тощей и подвздошной кишки молодых, зрелых и старых крыс 56
3.1.3. Активность глицил-илейциндипептидазы в разных слоях тощей и подвздошной кишки молодых, зрелых и старых крыс 60
3.1.4. Содержание белка в различных слоях тощей и подвздошной кишки молодых, зрелых и старых крыс 65
3.1.5. Заключение 67
3.2. Активность ферментов в эпителиальном, стромальном, мышечно-серозном слоях тонкой крыс различных возрастных групп после иммобилизационного стресса 72
3.2.1. Активность сахаразы в разных слоях тощей и подвздошной кишки крыс разных возрастных групп после иммобилизационного стресса 74
3.2.2. Активность аминопептидазы М в разных слоях тощей и подвздошной кишки крыс разных возрастных групп после иммобилизационного стресса 80
3.2.3. Активность глицил-1 -лейциндипептидазы в разных слоях тощей и подвздошной кишки крыс разных возрастных групп после иммобилизационного стресса 89
3.2.4. Содержание белка в разных слоях тощей и подвздошной кишки крыс разных возрастных групп после иммобилизационного стресса ..99
3.2.5. Заключение 104
3.3. Активность ферментов в эпителиальном, стромальном, мышечно-серозном слоях тонкой кишки у крыс различных возрастных групп после белковой депривации .
3.3.1. Активность сахаразы в разных слоях тощей и подвздошной кишки крыс разных возрастных групп после белковой депривации... 113
3.3.2. Активность аминопептидазы М в разных слоях тощей и подвздошной кишки крыс разных возрастных групп после белковой депривации 118
3.3.3. Активность глицил-1 -лейциндипептидазы в разных слоях тощей и подвздошной кишки крыс разных возрастных групп после белковой депривации 126
3.3.4. Содержание белка в разных слоях тощей и подвздошной кишки крыс разных возрастных групп после белковой депривации 135
3.3.5. Заключение 139
Общее заключение 144-155
Выводы 156-157
Список литературы. 158-182
- Структура слизистой оболочки тонкой кишки
- Возрастные особенности энзиматического барьера тонкой кишки
- Активность сахар азы в разных слоях тощей и подвздошной кишки молодых, зрелых и старых крыс
- Активность сахаразы в разных слоях тощей и подвздошной кишки крыс разных возрастных групп после иммобилизационного стресса
Введение к работе
Актуальность проблемы. В тонкой кишке существуют многочисленные и взаимосвязанные системы защиты организма от поступления во внутреннюю среду чужеродных веществ, особенно белковой природы. Энзиматический барьер тонкой кишки представлен ферментными системами, осуществляющими последовательную деполимеризацию пищевых поли- и олигомеров до мономеров, способных к утилизации. Он состоит из ряда пространственно разделенных барьеров, образованных ферментами полости тонкой кишки, пристеночной слизи, гликокаликса, а также энтероцитов - мембранными, внутриклеточными и лизосомальными. В лаборатории физиологии питания Института физиологии им. И.П. Павлова РАН под руководством академика A.M. Уголева впервые было осуществлено препаративное разделение стенки тонкой кишш у белых крыс линии Вистар на три слоя: эпителиальный, стромальный и мышечно-серозный, что было документировано морфологически. В этих слоях были выявлены три группы ферментов, активность которых максимальна в эпителиальном (мембранные ферменты), в стромальном (глицил-Ьлейциндипептидаза), и в мышечно серозном слое (глицилглициндипептидаза). Это привело к обнаружению неизвестных ранее фундаментальных характеристик тонкой кишш как структуры, реализующей не только пищеварительно-транспортные (что было известно ранее), но и барьерные функции.. На основании данных о распределении пищеварительных ферментов между слоями тонкой кишки A.M. Уголевым была выдвинута гипотеза о существовании наряду с эпителиальным ферментным барьером субэпителиального энзиматического барьера, осуществляемого за счет ферментов субэпителиальных слоев и повышающего надежность трансформационной системы тонкой кишки (Громова и др., 1991 (б); Уголев и др., 1992 (а); Тимофеева, 1993; Тимофеева и др., 1996 (б); Иезуитова, Тимофеева, 1996; 1999 и др.).
С возрастом существенно меняются структурно-функциональные характеристики тонкой кишки (Адапт.-комп. процессы, 1991). Доказано влияние различных стрессорных факторов на активность ферментов эпителиального слоя (Уголев, 1963, 1967, 1985, 1991; Уголев и др., 1992 (а); Тимофеева, 1995 (a);-Koldovsky, 1969; Henning, 1981; 1987). Известно, что пищеварительные ферментные системы способны к значительным перестройкам при изменении условий функционирования (голодание, иммобилизация, высокая и низкая температура и др.) (Егорова и др., 1992; Ватаева и др., 1994; Никитина и др., 1994; Тимофеева, и др., 1994; Малышев, Манухина, 1998; Кассиль и др., 2000; Timofeeva et al,, 1993). Ранее было показано участие ферментов постэлителиальных слоев, особенно лептидазного пула, в ответной реакции на то или иное экстремальное воздействие (оперативные вмешательства на тонкой кишке, голодание, нитратная интоксикация) (Иезуитова и др.; 1993; Тимофеева, 1995 (а); 1996). Было продемонстрировано, что совершенное и надежное выполнение барьерных функций структурами тонкой кишки выполняется благодаря взаимодействию ферментных систем ее эпителиального и субэпителиальных слоев. Однако возрастные особенности ферментных систем субэпителиальных слоев тонкой кишки, также как и их функциональная роль при различных воздействиях (иммобилизация, белковое голодание) у животных разных возрастных групп не изучались. Изучение функций субэпителиального энзиматического барьера у животных разного возраста может быть полезным при рассмотрении многих форм патологии желудочно-кишечного тракта, при которых часто нарушается проницаемость мембран щеточной каймы энтероцитов. Постэпителиальный энзиматический барьер способен выполнять в этих условиях защитную роль за счет повышения активности ферментов пептидазного пула, способных гидролизовать нерасщепленные пептиды, предотвращая их поступление в кровенрсную систему вследствие снижения мембранного гидролиза белков.
Цель и задачи исследования. Целью работы было изучение возрастных особенностей ферментных систем субэпителиального барьера тонкой кишки и их участие в адаптивных реакциях на различные стрессорные воздействия (иммобилизацию и белковую депривацию).
Были поставлены следующие задачи:
1. Выявить различия в уровне активности аминопептидазы М и глицил-1_-лейциндипептидазы в эпителиальном, стромальном и мышечно серозном слоях тощей и подвздошной кишки у молодых, зрелых и старых животных.
2. Сопоставить изменения активности ферментов пептидгид ролазного пула в эпителиальном и субэпителиальных слоях тощей и подвздошной кишки спустя 24 и 72 часа после иммобилизационного стресса у животных трех возрастных групп (молодые, зрелые, старые).
3. Изучить влияние белковой депривации молодых, зрелых и старых крыс на активность пептидгидролаз (аминопептидазы М и глицил-L лейциндипептидазы) эпителиального и субэпителиальных слоев тощей и подвздошной кишки.
Научная новизна. 1. Впервые обнаружены различия в уровне активности ферментов пептидгидролазного пула на примере аминопептидазы М и глицил-!_-лейциндипептидазы в субэпителиальных слоях тощей и подвздошной кишки у крыс разного возраста (молодые, зрелые, старые). Наиболее высокая активность ферментов отмечена в слоях тощей и подвздошной кишки у молодых крыс по сравнению со зрелыми и старыми животными, что, по-видимому, важно для увеличения мощности энзим этического барьера тонкой кишки у молодых неполовозрелых животных, у которых еще не завершено формирование структурных элементов тонкой кишки.
2. Впервые обнаружены изменения активности ферментов пептидгидролазного пула не только эпителиального, что было ранее известно, но также стромального и мышечно-серозного сло,ев тонкой кишки на стрессорное воздействие {иммобилизация в течение 3 ч). Такие реакции ферментных систем слоев тонкой кишки позволяют судить об участии субэпителиальных слоев в реализации адаптивных возможностей организма.
3. К белковой депривации оказались наиболее устойчивыми ферментные системы молодых и зрелых животных. У старых крыс в условиях белкового голодания резко увеличивалась активность ферментов пептидгидролазного пула в слоях тонкой кишки, что, по-виДимому, является способом защиты организма от. проникновения чужеродных белков, которые могут привести к патологическим последствиям. Таким образом, нами получены новые данные, расширяющие представление об энзиматическом барьере не только эпителиального, но и субэпителиальных (стромального и мышечно-серозного) слоев тонкой кишки. Показана различная чувствительность ферментных систем пептидгидролазного пула в слоях (особенно субэпителиальных) тонкой кишки у этих групп животных при стрессорных воздействиях.
Научно-практическая ценность работы. Выяснение возрастных особенностей в распределении ферментов, особенно пептидгидролазного пула, между эпителиальным, стромальным и мышечно-серозным слоями тонкой кишки, а также их ответных реакций на стрессорные воздействия (иммобилизации, белкового голодания) важно для развития фундаментальных представлений о барьерных и адаптивных функциях тонкой кишки. Наши данные впервые позволяют приблизиться к пониманию роли энзиматического барьера разных слоев тонкой кишки при экстремальных воздействиях. С нарушением функций субэпителиального энзиматического барьера, возможно, связаны некоторые заболевания пищеварительной системы, которые сопровождаются увеличением проницаемости энзиматического барьера для белков и пептидов (болезнь Крона, малдигестия, целиакия, хирургические травмы кишечника и др.). Полученные данные могут быть полезными в разработке лечебного питания и в создании новых сбалансированных полноценных диет при патологии желудочно-кишечного тракта, особенно в детском и пожилом возрасте. Результаты работы могут быть использованы в научно-исследовательской работе и в курсах лекций по физиологии и патфизиологии.
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы докладывались на:
- 52-ой конференции молодых ученых и студентов СПГАВМ, посвященной 190-летию высшего ветеринарного образования в России и 100-летию со дня организации первого научно-производственного учреждения в Петербурге, 1998г.;
- Всероссийской научной конференции, с международным участием, посвященной 150-летию со дня рождения акад. И.П. Павлова, Санкт Петербург, 1999г.;
- Научно-практической конференции «Приоритеты культуры и экологии в образовании», Ставрополь, 2003 г.
Восьмом международном конгрессе «Парентеральное и энтеральное питание», Москва, 2004 г.;
Публикация результатов исследования. Основные материалы диссертации опубликованы в 8 научных работах (из них 4 статьи), "
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 182 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, результатов-собственных исследований, общего заключения, выводов, списка литературы. Она иллюстрирована 31 таблицей и 46 рисунками. Список литературы включает 196 источников, в том числе 102 на иностранных языках.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Распределение активности пептидгидролаз (аминопептидазы М и гпицил-1--лейциндипептидазы) между эпителиальным, стромальным и мышечно-серозным слоями тонкой кишки у крыс изменяется в зависимости от возраста (молодые, зрелые, старые).
2. Реакция ферментных систем лептидгидролазного- пула эпителиального, стромального и мышечно-серозного слоев тонкой кишкина стрессорное воздействие (иммобилизация в течение 3 ч) различна у молодых, зрелых и старых крыс.
3. Белковое голодание {в течение 10 сут) животных вызывает существенное изменение уровня активности пептидгидролаз не только эпителиального, но и субэпителиальных слоев тонкой кишки, особенно устарых крыс.
Структура слизистой оболочки тонкой кишки
Тонкая кишка является сложной структурой, стенка которой состоит из четырех слоев: эпителиального, стромального, мышечного и серозного (Кулик, Шалыгина, 1977).
Серозный слой тонкой кишки содержит клетки мезотелия, сосуды, нервные ганглии подсерозного сплетения и нервные проводники, идущие из ЦНС. Мышечный слой состоит из гладких мышц, между которыми проходят кровеносные сосуды, а также нервные сплетения. Этот слой участвует в сократительной деятельности ворсинок кишечной слизистой оболочки. Стромальный (субэпителиальный) слой образован соединительной тканью и собственно пластинкой (lamina propria), содержащими эозинофилы, тучные клетки, фибробласты, плазматические клетки, лимфоциты, макрофаги, кровеносные и лимфатические сосуды и т.д. Внешний .слой слизистой оболочки тонкой кишки образован однослойным цилиндрическим" эпителием, который полиморфен и полифункционален и состоит из нескольких .типов клеток. Большая часть из них - это энтероциты, выполняющие пищеварительные и транспортные функции, а также функцию барьера между внешней и внутренней средой. На апикальной поверхности энтероцитов (кишечных клеток) находится 3-4 тыс. плазматических выростов микроворсинок, покрытых мембраной, образующих щеточную кайму. Щеточная кайма на поверхности клеток кишечного эпителия является универсальной структурой, широко распространенной в животном мире. При этом основные черты строения микроворсинок сохраняются от самых примитивных беспозвоночных до высших животных, в том числе и человека (Уголев, 1985). Щеточная кайма, в свою очередь, покрыта гликокаликсом (сетью из множества мукополисахаридных нитей, связанных кальциевыми мостиками), который, являясь компонентом мембраны, образует слой толщиной около 0,5 мкм (Уголев, 1985). Благодаря такой ультраструктуре поверхность тонкой кишки является надежным механическим барьером, препятствующим проникновению антигенов и других высокомолекулярных соединений из кишечной (энтеральной) среды во внутреннюю. Расстояния между микроворсинками чрезвычайно малы (1-2 мкм), а ячейки сети гликокаликса в сотни раз меньше. Все это создает препятствия для проникновения крупных молекул. Зона- щеточной- каймы обладает стерильностью, что делает ее, таким образом, специфическим бактериальным, фильтр ом.
Чрезвычайно важным защитным механизмом является собственно иммунная система тонкой кишки, характеристике которой посвящено много работ (Сапин, 1987; Мазо и др., 1989; Ferguson, 1979; Walker,1981; Kagnoff, 1987; Doe, 1989; Strober, James, 1994). Иммунная система тонкой кишки имеет большое значение во взаимодействии организма хозяина с кишечными бактериями, вирусами, паразитами, лекарственными препаратами, а также при контакте с разными антигенами. К ним можно отнести экзогенные пищевые антигены, белки и пептиды, антигены микроорганизмов и вирусов, токсины и т.д. Для понимания механизмов защиты важно отметить, что: в слизистой оболочке тонкой1 кишки содержатся более 400 000 плазматических клеток на 1мм2. Выявлено, что на 1 см 2 кишечной слизистой приходится около 1 млн. лимфоцитов. В норме в тощей кишке содержится от 6 до 40 лимфоцитов в расчете на 100 эпителиальных клеток (Уголев и др., 1992 (a); Ferguson, 1979). Это говорит о том, что кроме эпителиального слоя, разделяющего энтеральную и внутреннюю среды организма, существует также мощный лейкоцитарный слой.
Лимфатическая ткань тонкой кишки составляет около 25% всей кишечной слизистой оболочки. Она представлена в форме скоплений в пейровых бляшках и в lamina propria (отдельные лимфатические узлы), а также популяцией рассеянных лимфоцитов, локализованных в эпителии, интерэпителиальном пространстве и т.д. (Doe, 1989). В слизистой оболочке тонкой кишки содержатся также макрофаги, Т -г В - и М -лимфоциты и др. Пейеровы бляшки состоят из организованных скоплений лимфатических фолликул, в которых находятся предшественники популяции лимфоцитов. Пейеровы бляшки инициируют иммунную деятельность тонкой кишки. В эпителии над пейровыми бляшками расположены М-клетки (мембранные клетки), представляющие собой лимфоэпителиальные клетки. Функция М-клеток заключается в создании благоприятных условий для - доступа люминальных антигенов к субэпителиальным лимфоцитам.
М-клетки содержат большое количество везикул, которые захватывают антигены и направляют их в область Е-клеток пейеровых бляшек (Уголев и др., 1992 (a); Ewe et al., 1984; Gardner, 1984; Erickson, Kim, 1990; Erickson et al., 2002). Иммунная система стоит на пути огромного количества экзогенных антигенов. Клетки кишечника продуцируют различные иммуноглобулины, основным из которых является IgA. Иммуноглобулины А и Е, секретируемые в полость кишки, вероятно, адсорбируются на структурах кишечной слизистой оболочки, создавая в области гликокаликса дополнительный защитный слой (Ewe et al., 1984).
Следовательно, защитные иммунные механизмы действуют в полости тонкой кишки, на ее поверхности, в lamina propria, в интерэпителиальном и "субэпителиальном пространстве. Повреждения этих механизмов, контролирующих иммунную чувствительность тонкой кишки к антигенам, могут иметь значение в патогенезе нарушений локального иммунитета кишечника и в развитии аллергических реакций (Уголев и др., 1992 (a); Gardner, 1984; 1988; Lewis, et al., 1995).
Функции специфического энзиматического защитного барьера выполняет также слизь. Она представляет собой вязкую гелеобразную структуру, которая покрывает большую часть эпителиальной поверхности тонкой кишки (Гальперин, Лазарев, 1986; Морозов и др., 1988; Forstner, Forstner, 1986). Слизь полифункциональна. В настоящее время известно, что слизь обладает следующими функциями: 1) защитной механической функцией, предупреждающей возможность прямых механических контактов различных веществ и структур, которые могли бы повредить клеточную поверхность.
Возрастные особенности энзиматического барьера тонкой кишки
В ходе этагенеза, который включает в себя три этапа - онтогенез, мезогенез и геронтогенез, функции организма в целом и его систем и органов в отдельности претерпевают значительные изменения (Пархон, 1960; Валенкевич, 1987; Гаврилов, Гаврилова, 1991; Фролькис, Мурадян, 1992; Фролькис, 1998; Lovat, 1996; Fan, 2002; Buddington, Malo, 2003; Sklan et al., 2003). Невзирая на то, что нет четких границ возрастного развития функции, адаптационные механизмы, толерантность к нагрузкам, репродуктивная способность претерпевают значительные изменения. Это касается, по-видимому, и ферментной системы тонкой кишки.
Были проведены исследования, которые впервые показали, что роль постэпителиального энзиматического барьера на протяжении жизни организма, по-видимому, изменяется (Громова и др., 1991(a)). Были выполнены опыты на взрослых крысах-Вистар и 15-дневных крысятах; которые еще не перешли на дефинитивное питание, но структуры тонкой кишки были уже в значительной степени сформированы (Громова и др., 1991(a)). Поскольку тонкую кишку крысят не удалось разделить на три слоя, активность ферментов была определена в эпителиальном и суммарном стромально-мышечно-серозном слоях. Для сравнения были поставлены опыты на взрослых крысах. Авторы показали, что активность дефинитивных карбогидраз (сахаразы и мальтазы) отсутствовала в слоях тонкой кишки сосущих крысят, что подтверждается и другими авторами (Henning, 1987; Henning et al., 1994). У взрослых животных активность сахаразы и мальтазы обнаружена преимущественно в эпителиальном слое, где она существенна, в то время как в субэпителиальных слоях она минимальна (сахараза практически отсутствует, поэтому является маркером для суждения о чистоте разделения слоев тонкой кишки). Обращает на себя внимание, что активность лактазы у сосущих крысят распределена между слоями тонкой кишки равномерно. Активность аминопептидазы М у взрослых крыс в эпителиальном слое была максимальна, тогда как в суммарном стромально-мышечном слое была существенно ниже. У 15-дневных крысят в эпителиальном слое активность аминопептидазы М была примерно такой же, как и у взрослых кр ыс, а в стромально-мышечном слое была значительно выше по сравнению с активностью фермента в соответствующем слое у взрослых животных. Активность щелочной фосфатазы у взрослых крыс была также значительна в эпителиальном слое, а в стромально-мышечном слое составляла примерно 10% от активности в эпителиальном слое. У 15-дневных крысят в эпителиальном слое активность щелочной фосфатазы была примерно на уровне ее у взрослых крыс, а в стромально-мышечном слое - почти в два раза выше. Обращает на себя внимание, что активность глицил-L-лейциндипептидазы у взрослых крыс была значительной не только в эпителиальном слое, но и в стромально-мышечном слое. У 15-дневных крысят в стромально-мышечном слое активность фермента в 1.5 раза выше, чем в эпителиальном слое. Распределение активности L-лейцилглициндипептидазы, глицилглицин- дипептидазы и диглицилглицинтрипептидазы между эпителиальным и стромально-мышечным слоями тонкой кишки крысят было таким же, как и у взрослых крыс. Из выше описанных результатов следует, что относительная активность таких ферментов как аминопептидаза М, щелочная форфатаза и глицил-і_-лейциндипептидаза в стромально-мышечном слое (по сравнению с эпителиальным) у крысят значительно выше; чем у взрослых крыс. В то же время активность других ди- и трипептидаз в слоях тонкой кишки крысят не отличается от ее уровня у взрослых животных. Кроме того, важно отметить, что активность пептидаз в стромально-мышечном слое идентична или выше ее в эпителиальном слое как у взрослых крыс, так и у крысят. Существуют данные об изменении активностей широкого спектра ферментов у крыс в процессе онтогенетического развития. В частности, продемонстрировано, что в период с 1-го по 25-й дни после рождения, (при переходе от молочного питания к смешанному и далее к дефинитивному) активность широкого спектра- пептидгидролаз тонкой кишки крысят {аминопептидаза М, глицил-Ьлейциндипептидаза, L-лейцилглицин-дипептидаза и глицил-Ц-аланиндипептидаза) в первый день жизни выше, чем у взрослых крыс, тогда как уровни активности диглицил-глицинтрипептидазы этих групп животных существенно не различаются (Уголевидр., 1992(6)). Что касается сахаразы, то у крыс в первые три недели жизни ее активность не определяется. И только к концу третьей недели появляется активность сахаразы, которая существенно возрастает в дальнейшем. К 25 дню после рождения она достигает уровня активности у взрослых животных. При старении, как известно, происходит неуклонное нарастание инволютивных процессов в слизистой оболочке различных отделов пищеварительного тракта, что связано, по-видимому, с изменением темпов регенерации (Валенкевич, Уголев, 1982; Валенкевич, 1984). Нельзя не учитывать развитие дистрофических и атрофических изменений в органах желудочно-кишечного тракта, характеризующихся укорочением и утолщением ворсинок, уменьшением числа микроворсинок, нарушением структуры гликокаликса и т.д.
Активность сахар азы в разных слоях тощей и подвздошной кишки молодых, зрелых и старых крыс
Благодаря разработанной ранее методике, необходимой для понимания пищеварительно-транспортных и барьерных функций, позволившей изолировать основные слои, составляющие структуру тонкой кишки, стало возможным получить результаты распределения активности ферментов не только вдоль тонкой кишки, но и в отдельно взятых эпителиальном, стромальном и мышечно-серозном слоях {Громова и др., 1991 (а)). Полученные результаты позволили заключить, что тонкая кишка представляет собой мощную пищеварительную поверхность, которая является однослойной в отношении сахарозы, но уже в отношении мальтозы, а также пептидов, существует второй энзиматический слой. Его эффективность составляет 10% от предшествующего (эпителиального), но тем не менее он выполняет значительную роль (Громова и др., 1991 (а)).
Сахараза присутствует только в эпителиальном слое - она является маркерным ферментом,, по которому оценивают чистоту разделения подвздошной кишки, что позволяет в дальнейшем судить о распределении ферментов в каждом изолированном слое. В нашей работе мы также обнаружили, что мембранный фермент сахараза присутствует только в эпителиальном слое у всех групп животных. В стромальном и в мышечно-серозном слоях она полностью отсутствует. Ранее было установлено существование градиента распределения ферментов, реализующих мембранное пищеварение, вдоль тонкой кишки {Уголев и др. 1974, 1977; Spencer, 1964; Asp et al.T 1975; Kendall et al., 1979; Henning, 1987; Mauiri et al., 1992; и др.). Так, было показано, что наибольшая активность сахаразы у взрослых крыс сосредоточена в тощей кишке, значительно меньшая в двенадцатиперстной, самая низкая в подвздошной {Уголев, 1972; 1977; Рахимов, Демидова, 1986; Уголев 1991; Уголев и др., 1992 (а); Тимофеева, 1995 (а, б); 2000 (б); Blair, Tuba, 1963; Rubinoe. al., 1964). Из полученных нами результатов также видно, что активность сахаразы в эпителиальном слое тощей кишки у крыс всех возрастов была в 2-3 раза больше по сравнению с подвздошной. Сравнивая возрастные изменения активности сахаразы, мы получили следующие результаты. Так, у молодых животных мы наблюдали самый высокий уровень активности фермента в тощей и подвздошной кишке, в 4.1 и 4.6 раза соответственно превышавший таковой упрелых крыс, и 2.7 и 2 раза - у старых. У старых животных нами была обнаружена также достаточно высокая активность сахаразы как в тощей (в 1.5 раза), так и в подвздошной кишке (в 2.5 раза) по отношению, к активности у зрелых крыс. Это согласовывается с ранее полученными данными, где активность сахаразы в гомогенате слизистой оболочки тонкой кишки у зрелых крыс в 2 раза ниже, чем у старых (Уголев и др., 1992 (б)). Таким образом, нами обнаружен более высокий уровень активности сахаразы в тощей кишке по сравнению с подвздошной у крыс всех возрастов, а также более высокая ативность фермента у молодых и старых крыс по сравнению со зрелыми. Ранее было показано, что активность аминопептидазы М максимальна в эпителиальном слое тонкой кишки крыс (Уголев и др., 1992 (а)) Нами также было обнаружено, что наибольшая активность фермента приходится на эпителиальный слой - как тощей, так и подвздошной кишки у крыс всех возрастных групп. Но следует отметить, что активность аминопептидазы М в стромальном и мышечно-серозном слоях также была достаточно высока. Так, в стромальном слое тощей кишки она составляла 13.4-23.4% от суммарной активности всех слоев, а в подвздошной кишке 12.8-17.5 % соответственно, у животных разных возрастных групп. В мышечно-серозном слое активность фермента составляла в тощей 11.4-18.9 % и подвздошной кишке 12.8-17.5 % от суммарной активности всех слоев также у крыс исследованных возрастных групп. Интересно также отметить, что самая высокая суммарная активность в стромальном и мышечно-серозном слоях по отношению к эпителиальному слою (более 40%) наблюдалась у зрелых крыс по сравнению с молодыми и старыми животными. Для всех групп животных характерно одинаковое распределение активности аминопептидазы М вдоль тонкой кишки между слоями, за исключением более высокой активности в стромальном слое подвздошной кишки по сравнению с тощей у молодых крыс. У молодых крыс нами была обнаружена самая высокая активность фермента в эпителиальном слое тощей и подвздошной кишки (в 2.7 раз выше по сравнению со зрелыми крысами и в 1.5 раза - по сравнению со старыми). Это согласуется с ранее полученными данными других авторов (Уголев и др., 1992(6)). Так, активность у 25-дневных крысят была в 2.5 раз больше, чем у взрослых. В этой же работе есть данные по исследованию ї активности аминопептидазы М в тонкой кишке с 1 по 25 день постнатального развития крысят, причем активность фермента у однодневных животных превышала таковую у взрослых более, чем в 2 раза. К 5 дню она понижалась до уровня, характерного для взрослых крыс, и оставалась такой до 17 дня, но затем происходит неожиданное повышение ее до уровня, наблюдавшегося у однодневных крысят. В стромальном и мышечно-серозном слоях тощей кишки молодых крыс активность фермента не отличалась от активности в этих Ьлоях у зрелых животных. Однако в стромальном и мышечно-серозном слоях подвздошной кишки она в 1.9 и 1.7 раза превышала таковую у зрелых крыс. Аналогичные данные о том, что у молодых крыс суммарная активность фермента субэпителиальных слоев тонкой кишки выше, чем у зрелых, также были получены и другими авторами (Громова и др., 1991 (а)). У старых крыс в эпителиальном слое тощей и подвздошной кишки обнаружен высокий уровень активности аминопептидазы М, в 1.7 раза превышающий активность у зрелых крыс как в тощей, так и в подвздошной кишке.
Активность сахаразы в разных слоях тощей и подвздошной кишки крыс разных возрастных групп после иммобилизационного стресса
К настоящему времени накоплен обширный материал, свидетельствующий об изменениях пищеварительных функций тонкой кишки под влиянием различных стрессорных воздействий, к которым относится, в частности, иммобилизация (Уголев., 1972; Егорова и др., 1992). Также ранее были получены многочисленные данные об изменении активности многих пищеварительных ферментов не сразу после стрессорного воздействия, а в более поздние сроки (спустя 24, 48 и 72 часа), когда происходит смена популяции энтероцитов (Никитина и др., 1994). При этом, как ранее было отмечено, одним из главных признаков стрессорной реакции является усиление секреции АКТГ И кортикостероидов, которые контролируют синтез и влияют на активность ферментов различных органов и тканей, в том числе кишечных, реализующих мембранный и внутриклеточный гидролиз нутриентов (Уголев, 1972; Панин, 1983; Барабой и др., 1992; Пренатальный стресс...., 2004; Henning 1987). В наших экспериментах, где иммобилизация на фоне предварительного голодания в течение 12 ч, являлась сильным стрессорным воздействием, также было обнаружено увеличение уровня кортикостерона. в плазме крови (до 1300 пмоль/мл) и изъязвление слизистой оболочки желудка. Это согласуется с ранее полученными результатами, в которых при сильном стрессе, достигнутым иммобилизацией вместе с голодом, наблюдалось увеличение уровня кортикостерона (с 180 до 1800 пмоль/мл) и появление язв на слизистой оболочки желудка (Филаретов, Филаретова, 1992; Никитина и др., 1994).
Нами получены данные в отношении действия иммобилизации животных (как стрессорного фактора) на трофически-барьерные функции эпителиального, стромального и мышечно-серозного слоев тощей и подвздошной кишки крыс трех возрастных групп. Через сутки после прекращения действия стрессирующего фактора у молодых и зрелых крыс существенных изменений активности аминопептидазы М не отмечалось, можно говорить лишь о некотором росте активности в отдельных слоях тощей и подвздошной кишки. У старых животных, наоборот, было обнаружено значительное радение активности фермента спустя 24 часа после иммобилизации во всех слоях тонкой кишки. , По истечении трех суток после иммобилизации ферментативная активность в различных слоях тощей и подвздошной кишки у молодых крыс снижалась, у зрелых она увеличивалась, а у старых восстанавливалась до уровня активности у интактных крыс. Нами обнаружено, что только у молодых крыс активность сахаразы значительно снижалась в эпителиальном слое. тощей и подвздошной кишки после экстремального воздействия, в оба срока исследования. У зрелых крыс, наоборот, можно было отметить существенным .рост активности фермента, особенно через трое руток после иммобилизации. А у старых животных наблюдалось снижение активности сахаразы и только спустя сутки после прекращения действия стрессирующего фактора. Аминопептидаза М является одним из основных ферментов, реализующих мембранный гидролиз белков. Нами было показано, что для всех групп животных характерна максимальная активность фермента в эпителиальном слое тощей и подвздошной кишки (в среднем 60-70 % от суммарной активности по слоям). Иммобилизация животных разного возраста в наших ;опытах вызывала существенные, но неидентичные изменения активности фермента в разных слоях тощей и подвздошной кишки. У молодых крыс через сутки после иммобилизации существенных изменений активности аминопептидазы М в разных слоях тощей и подвздошной кишки не наблюдалось. Можно отметить лишь увеличение активности фермента (в 1.8 раза) в мышечно-серозном слое тощей кишки по отношению к контрольным крысам. Через трое суток после стрессирования мы наблюдали достоверное снижение (в два раза) активности фермента в эпителиальном слое тощей кишки. Также некоторое снижение активности фермента нами было отмечено в эпителиальном, стромальном, мышечно-серозном слоях подвздошной кишки. Активность фермента в этих слоях составляла при этом 58-78 % от активности у контрольных крыс, принятой за 100 %.
У зрелых крыс через сутки после иммобилизации нами не обнаружено достоверных изменений активности аминопептидазы М, хотя наблюдался некоторый рост активности фермента в эпителиальном слое тощей и подвздошной кишки. Самые значительные изменения нами были обнаружены у зрелых крыс спустя 72 часа после прекращения действия стрессирующего фактора. При этом активность фермента увеличилась не только в эпителиальном, но и в стромальном и мышечно-серозном слоях тощей и подвздошной кишки - приблизительно в 2-3 раза.
У старых крыс, подвергнутых им мобилизационному стрессу, мы также наблюдали изменение уровня активности аминопептидазы М в каждом из слоев тонкой кишки. Так, через сутки мы обнаружили снижение активности фермента на 40 - 50 % в эпителиальном,, стромальном и мышечно-серозном слоях тощей и подвздошной кишки. Причем особенно интересно отметить, что спустя 72 часа активность аминопептидазы М полностью восстановилась до уровня активности у контрольных крыс в каждом из слоев тощей и подвздошной кишки, а в мышечно-серозном слое подвздошной кишки даже увеличилась в 1.4 раза,
