Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 14
1.1. Особенности туберкулеза легких в современных условиях 14
1.2. Факторы, влияющие на развитие, течение и лечение туберкулеза 25
1.3. Стратегии иммунной защиты организма в борьбе с туберкулезной инфекцией 41
1.4. Первая линия эффекторных механизмов иммунологического гомеостаза 47
1.5. Фагоцитарные реакции и их регуляция при туберкулезе 60
ГЛАВА 2. Материал и методы исследования 74
2.1. Объект и материал исследования 74
2.2 Методы обследования 79
2.3. Методы исследования функционального статуса фагоцитов периферической крови 82
2.3.1. Приготовление лейкоконцентрата венозной крови 82
2.3.2. Цитохимическое исследование нейтрофилов и моноцитов периферической крови.82
2.3.3. Определение показателя активности и поглотительной способности нейтрофильных гранулоцитов периферической крови 85
2.3.4. Определение показателя завершенности фагоцитоза нейтрофильных гранулоцитов периферической крови 86
2.3.5. Выделение моноцитов и нейтрофилов из периферической крови 87
2.3.6. Определение поглотительной активности моноцитов периферической крови 87
2.3.7. Определение содержания СЗЬ-экспрессирующих моноцитов и нейтрофильных гранулоцитов в периферической крови 88
2.3.8. Определение содержания FcY-экспрессирующих моноцитов и нейтрофильных гранулоцитов в периферической крови 89
2.3.9. Определение активности лизоцима в сыворотке крови
2.3.10. Количественное определение лизосом в моноцитах и нейтрофильных гранулоцитов периферической крови 90
2.3.11. Тест восстановления нитросинего тетразолия (НСТ-тест) в нейтрофильных гранулоцитах 90
2.3.12. Культивирование мононуклеарных лейкоцитов периферической крови in vitro 91
2.3.13. Определение концентрации нитритов в мононуклеарных лейкоцитах периферической крови 92
2.3.14. Иммуноферментный анализ для количественного определения уровней цито-кинов 92 2.4. Методы лечения 93
2.5. Статистическая обработка результатов 94
ГЛАВА 3. Факторы риска, ассоциированные с множественно лекарственно-устойчивым туберкулезом 97
3.1. Клинико-социальные факторы, сопряженные с туберкулезом легких, возбудителем которого являются МЛУ МВТ 97
3.2. Факторы, влияющие на конверсию мокроты больных МЛУ ТБ 112
3.3. Результаты лечения, рецидив заболевания и сроки прекращения бактериовыделения у больных с МЛУ ТБ 133
ГЛАВА 4. Функциональная характеристика фагоцитов периферической крови у больных туберкулезом легких 139
4.1. Характеристика показателей функционального статуса нейтрофилов и моноцитов периферической крови больных туберкулезом легких до начала терапии 139
4.2. Характеристика показателей функционального статуса нейтрофилов и моноцитов периферической крови больных туберкулезом легких после интенсивной фазы противотуберкулезного лечения 158
4.3. Характеристика показателей функционального статуса фагоцитов периферической крови больных туберкулезом легких после проведения поддерживающей фазы противотуберкулезной терапии 166
4.4. Характеристика цитокинсекретирующей активности мононуклеарных лейкоцитов периферической крови у больных туберкулезом легких до применения противотуберкулезной терапии 174
4.5. Характеристика цитокинсекретирующей активности мононуклеарных лейкоцитов периферической крови у больных туберкулезом легких после интенсивной фазы противотуберкулезной терапии 182
4.6. Характеристика цитокинсекретирующей активности мононуклеарных лейкоцитов периферической крови у больных туберкулезом легких после курса поддерживающей противотуберкулезной терапии 189
ГЛАВА 5. Обсуждение собственных результатов 193
5.1. Медико-социальные особенности больных с впервые выявленным туберкулезом легких, выделяющих множественно лекарственно-устойчивые МБТ 195
5.2. Типовые реакции фагоцитов периферической крови при туберкулезной инфекции 213
Выводы 254
Практические рекомендации 257
Список литературы
- Стратегии иммунной защиты организма в борьбе с туберкулезной инфекцией
- Методы исследования функционального статуса фагоцитов периферической крови
- Факторы, влияющие на конверсию мокроты больных МЛУ ТБ
- Характеристика цитокинсекретирующей активности мононуклеарных лейкоцитов периферической крови у больных туберкулезом легких до применения противотуберкулезной терапии
Введение к работе
Актуальность проблемы. Множественная лекарственная устойчивость (МЛУ) микобактерий туберкулеза (МБТ) у впервые выявленных больных является общемировой проблемой. По данным глобального доклада ВОЗ, основанного на информации, поступившей из 114 стран мира, первичная МЛУ МБТ составляет около 4 %, а на обширной территории стран бывшего Советского Союза данный показатель выше в 3 – 6 раз [WHO, 2010]. Впервые за всю историю мониторинга туберкулеза (ТБ) ВОЗ был зарегистрирован самый высокий показатель первичной МЛУ МБТ в РФ (в Мурманске – 28 %), а также в Казахстане (25 %), Молдове (25 %), Таджикистане (17 %), Латвии (15 %), Эстонии (12 %). Резистентность МБТ одновременно к основным (изониазид и рифампицин) и ряду резервных противотуберкулезных препаратов (ПТП) обусловливает низкую эффективность противотуберкулезной химиотерапии [Flament-Saillour M. et al., 1999; Geerligs W.A. et al., 2000; Мишин В. Ю. и соавт., 2002; Шилова М. В., 2007; Вишневский Б. И., Стеклова Л. Н., 2008; Мишин В. Ю., 2008]. Клиническое излечение больных с МЛУ МБТ в 3 раза ниже, чем с чувствительностью МБТ к ПТП. При этом частота прекращения бактериовыделения у больных ТБ с чувствительностью МБТ к ПТП достигает 92,5 %, а при ТБ, вызванном устойчивыми штаммами возбудителя, – только 58,1 % [Ильина Т. А. и соавт., 2003; Мишин В. Ю., 2008]. В связи с этим мультирезистентные к ПТП МБТ становятся основной составляющей заболеваемости ТБ и смертности от этого заболевания, что создает серьезную угрозу всему человечеству.
На сегодняшний день одной из главных причин эпидемии МЛУ ТБ являются благоприятные условия для селекции лекарственно-устойчивых МБТ: отсутствие полноценного контролируемого лечения, отрывы от лечения, некачественные ПТП, плохая изоляция больных (госпитальный туберкулез) [Dye C. et al., 2005; Мишин В. Ю., 2009; Loddenkemper R., 2010]. Вместе с этим существуют и специфические условия, которые повышают уязвимость пациентов к резистентным штаммам возбудителя ТБ. На популяционном уровне они различны [Jakubowiak W. M. et al., 2007; Chiang C-Y. et al., 2009; S. et al., 2009; М. Inghammar et al., 2010]. Зарубежные исследователи, подчеркивают, что именно биологические (медицинские) факторы риска мешают определить тенденции глобального распространения МЛУ ТБ [Borrell S., Gagneux S., 2009; Caminero J.A., 2010]. Это определяет актуальность изучения спектра и значимости отягощающих медико-социальных факторов риска МЛУ МБТ у больных с впервые выявленным ТБ легких для разработки программ по их минимизации, особенно в регионе (Томская область), где в течении 10 последних лет отрабатываются рекомендуемые ВОЗ протоколы контролируемого лечения.
Общеизвестно, что обязательным условием для развития ТБ, с одной стороны, является проникновение в организм человека MБТ и их размножение, с другой, состояние иммунологической реактивности организма-носителя. Ее недостаточность (в том числе генетически детерминированная) во многом определяет особенности клинического течения, характер и исходы заболевания [Балабанова Я. М. и соавт., 2006; Зюзя Ю. Р. и соавт., 2006; Тюлькова Т. Е., 2008; Фрейдлин И. С., 2008]. По данным литературы, впервые выявленный ТБ легких, вызванный МЛУ МБТ, имеет ряд особенностей функционирования иммунной системы, проявляющихся (в отличие от ТБ с сохраненной чувствительностью возбудителя к ПТП) как признаками иммунодепрессии (низкая пролиферативная активность лимфоцитов, угнетение продукции Th1-цитокинов), так и дизрегуляцией Т-клеточного иммунного ответа (состояние неотвечаемости на специфический антиген (анергия), смещение баланса цитокинов в сторону доминирования Th2-медиаторов) [Балабанова Я. М. и соавт., 2006; Новицкий В. В. и соавт., 2006, 2008; Воронкова О. В. и соавт., 2007; S. et al., 2009].
Ключевая роль в формировании иммунитета к туберкулезной инфекции отводится кооперативному взаимодействию альвеолярных макрофагов с различными субпопуляциями Т-клеток [Кноринг Б. Е. и соавт., 2001; Flynn J. L., Chan J., 2001; Engele M. et al., 2002; Van Crevel R. et al., 2002; Salgame P., 2005; Новицкий В. В. и соавт., 2008; Knechel N. A., 2009]. Наряду с тем, что при ТБ главные события разворачиваются, как правило, в очаге поражения, сочетание готового эффекторного потенциала со способностью к быстрой его мобилизации делает фагоциты периферической крови одними из главных участников ответных реакций на внешний инфекционный стимул [Маянский А. Н., 2001; Schluger N. W., 1998; 2005; Pedrosa J. et al., 2000; Appelberg R., 2007; Фрейдлин И. С., 2008; Dale D. C. et al., 2008; . et al., 2008]. Паракринная внутрисистемная регуляция, а также существование цитокинопосредованных связей между моно- и полиморфноядерными фагоцитами обеспечивают функционирование единого фагоцитарного клеточного домена, от активности которого в значительной мере зависят манифестация и исход инфекции [Cooper A. M. et al., 2002; Algood H. M., 2003].
Таким образом, успешное решение наиболее актуальных задач фтизиатрии возможно лишь в том случае, если при их рассмотрении принимаются во внимание как этиология (биология возбудителя, факторы риска), так и патогенез туберкулезной инфекции, в том числе особенности индивидуальной реактивности, определяющие состояние защитных реакций больного организма в борьбе с возбудителем. Это становится все более очевидным по мере роста числа случаев лекарственно-устойчивого ТБ и неудач в лечении.
Цель исследования. Обосновать возможность прогнозирования МЛУ МБТ и исходов лечения у больных с впервые выявленным туберкулезом легких на основе изучения медико-социальных факторов риска.
Задачи исследования:
-
Определить приоритетные медико-социальные факторы, ассоциированные с МЛУ МБТ у впервые выявленных больных туберкулезом легких.
-
Выявить факторы, влияющие на конверсию мокроты у больных с впервые выявленным туберкулезом легких, выделяющих МЛУ МБТ.
-
Оценить исходы лечения и наступление рецидива заболевания в зависимости от сроков прекращения бактериовыделения у больных с впервые выявленным туберкулезом легких с МЛУ МБТ.
-
Выявить общие закономерности и особенности иммунопатологических проявлений при туберкулезе легких в зависимости от клинической формы заболевания и лекарственной чувствительности МБТ.
-
Изучить возможность прогнозирования МЛУ МБТ у больных с впервые выявленным туберкулезом легких на основе результатов иммунологического обследования.
Научная новизна исследования. Проведен сравнительный анализ особенностей клинического течения, спектра и значимости отягощающих медико-социальных факторов туберкулеза легких с первичной МЛУ МБТ в сравнении с лекарственно-чувствительным вариантом заболевания. Доказано наличие ассоциаций между отягощающими факторами заболевания и формированием МЛУ МБТ. Определена степень риска обнаружения МБТ с МЛУ у впервые выявленных больных туберкулезом легких при наркомании, табакокурении, синдроме алкогольной зависимости, пребывании в местах заключения, сахарном диабете 2 типа, вирусных гепатитах В, С, В+С.
У впервые выявленных больных с МЛУ туберкулезом легких установлена зависимость степени риска отрицательного ответа на противотуберкулезное лечение по критерию «прекращение бактериовыделения» от объема и характера поражения ткани легкого, приверженности пациента к лечению и побочных эффектов на терапию. Выявлена ассоциация между временем конверсии мокроты, заключительными результатами лечения и рецидивированием заболевания в течение 2-х лет после окончания противотуберкулезной терапии.
С помощью комплекса методов, характеризующих микробицидные свойства фагоцитирующих клеток, у впервые выявленных больных с МЛУ туберкулезом легких показано выраженное угнетение экспрессии поверхностных С3b- и Fc-рецепторов на моноцитах и нейтрофильных гранулоцитах, снижение (в 2 раза) числа активно фагоцитирующих нейтрофилов с депрессией завершенности фагоцитоза и резервной реактивности клеток в НСТ-тесте. Установлена низкая продукция IL-1, IL-2, TNF-, повышение базального синтеза IL-6 и IL-8 и митоген-стимулированной секреции IL-4 при отсутствии реактивной секреции INF-, INF- и интерлейкинов (IL-2, IL-4, IL-6, IL-8) мононуклеарными лейкоцитами крови in vitro в ответ на антигенспецифическую стимуляцию клеток туберкулином.
Показано, что у пациентов с лекарственно-чувствительным туберкулезом легких периферические макрофаги обнаруживают более высокий уровень метаболизма, поглотительной способности и лизосомальной активности, чем при туберкулезе легких с МЛУ МБТ. При этом на фоне подавления провоспалительного ответа, выражающегося в гипопродукции IL-1 и TNF-, при лекарственно-чувствительном туберкулезе легких имеет место высокая базальная секреция INF- и INF- с тенденцией к росту ее на конец лечения, выраженная активация секреции IL-2 (при нормопродукции IL-4) in vitro в условиях стимуляции мононуклеарных лейкоцитов туберкулином.
Выявлено что, у больных ТБ содержание гликогена (в моноцитах) и липидов (в нейтрофилах), определяемое при цитохимическом исследовании по величине среднего цитохимического коэффициента, сопряжено с полидеструктивным воспалением легких.
Получены данные о предиктивном значении при туберкулезе легких спонтанной продукции TNF- in vitro, уровень которой ассоциирован с МЛУ МБТ.
Практическое и теоретическое значение работы. Распространенный деструктивный характер воспалительного процесса в легких, наркомания, алкоголизм, табакокурение, пребывание в местах лишения свободы, вирусные гепатиты В, С, В+С и сахарный диабет 2 типа в анамнезе повышают риск обнаружения МЛУ МБТ у впервые выявленных больных туберкулезом легких.
Индивидуальный риск МЛУ МБТ у больных с впервые выявленным туберкулезом легких обуславливает использование автоматизированных биологических и молекулярно-генетических диагностических тестов для ускоренного определения лекарственной чувствительности возбудителя к ПТП.
Медико-социальные факторы, сопряженные с отрицательным ответом на противотуберкулезную терапию (отсутствие прекращения бактериовыделения), позволяют в более ранние сроки (в течение 6 месяцев от начала лечения) прогнозировать неблагоприятный исход и рецидив болезни и применить меры коррекции лечебного воздействия.
Критериями оценки состояния неспецифической резистентности организма у впервые выявленных больных с МЛУ туберкулезом легких являются ферментативная, поглотительная и переваривающая активность нейтрофилов и моноцитов. При неэффективности химиотерапии и хронизации воспалительного процесса восстановление цитохимических и функциональных показателей фагоцитирующих клеток крови замедляется или не происходит. Наиболее медленная их нормализация выявлена при фиброзно-кавернозной форме туберкулеза легких.
Оценка продукции ключевых цитокинов иммунного ответа на МБТ (IL-1, IL-2, IL-4; IL-6, IL-8, IFN-, IFN-, TNF-) in vitro может служить основой для дальнейшего изучения механизмов иммунопатологических изменений при туберкулезной инфекции. Результаты исследования теоретически обосновывают необходимость включения в стандартную программу лечения больных туберкулезом легких иммуномодулирующих средств для профилактики и коррекции вторичной иммунологической недостаточности.
Базальный уровень секреции TNF- мононуклеарными лейкоцитами крови in vitro свыше 165 пг/мл позволяет прогнозировать МЛУ МБТ у больных туберкулезом легких при выявлении заболевания.
Положения, выносимые на защиту:
-
К медико-социальным факторам риска МЛУ МБТ у больных с впервые выявленным туберкулезом легких относятся (в порядке значимости) вирусные гепатиты В, С, В+С, наркомания, сахарный диабет 2 типа, пребывание в местах лишения свободы, алкоголизм, табакокурение. Рентгенологическими предикторами МЛУ туберкулеза легких являются негомогенное затемнение более 3-х сегментов высокой интенсивности (ОШ = 3,67) и полостные образования (ОШ = 4,32) в легочной ткани.
-
Отсутствие негативации мокроты на фоне противотуберкулезной терапии при МЛУ туберкулезе легких сопряжено с объемом и характером поражения легочной ткани, приверженностью пациента к лечению, сочетанной лекарственной бактериорезистентностью и наличием двух и более побочных реакций к ПТП первого и второго ряда (гастро-, энтеро-, гепато-, нейротоксических и связанных с гипокалиемей и гипомагниемией).
-
Положительный результат противотуберкулезной терапии у больных с МЛУ туберкулезом легких зависит от времени конверсии мокроты. Риск рецидива заболевания повышается в 11 раз при отсутствии прекращения бактериовыделения в течение более 6 месяцев от начала лечения.
-
Характерными нарушениями метаболических и функциональных свойств фагоцитирующих клеток крови при МЛУ туберкулезе легких являются повышение их ферментативной, секреторной (NO, лизоцим) и поглотительной активности при снижении доли завершенного фагоцитоза, угнетении образования активных форм кислорода и экспрессии опосониновых C3b- и Fc-рецепторов, истощении депо глюкозы и липидов.
-
Изменения кислородзависимых и кислороднезависимых бактерицидных и фагоцитарных свойств нейтрофилов и моноцитов периферической крови при туберкулезе легких сопряжены с повышением продукции провоспалительных интерлейкинов IL-6 и IL-8 в сочетании с дефицитом синтеза Тh1-ассоциированных цитокинов IL-1, IL-2, TNF- мононуклеарными лейкоцитами in vitro. Особенностью МЛУ туберкулеза легких является низкий уровень продукции интерферонов (IFN-, IFN-) при повышенной секреции IL-4 в ответ на индукцию клеток туберкулином in vitro.
-
Критерием прогнозирования МЛУ МБТ у больных с впервые выявленным туберкулезом легких является пониженная базальная секреция TNF- in vitro в дебюте заболевания; содержание энергетических субстратов в нейтрофилах (липиды) и моноцитах (гликоген) ассоциировано с полидеструктивным поражением легких.
Апробация материалов работы. Основные положения диссертации докладывались и обсуждались на международной конференции «Развитие международного сотрудничества в области изучения инфекционных заболеваний» (Новосибирск, 2004), на ммеждународной научно-практической конференции «Проблемы туберкулеза и современные пути их решения» (Томск, 2004), на международной конференции «Медико-биологические и экологические проблемы здоровья человека на Севере» (Сургут, 2004), на третьем Российском конгрессе по патофизиологии «Дизрегуляционная патология органов и систем» (Москва, 2004), на VI конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (Томск, 2005), на 15-м Национальном конгрессе по болезням органов дыхания (Москва, 2005), на международном конгрессе «Иммунитет и болезни: от теории к терапии» (Москва, 2005), на VII конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (Томск, 2006), на X Всероссийском форуме с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2006), на VIII Российском съезде фтизиатров (Москва, 2007), на II и IX Российско-германской конференции Форума Коха-Мечникова (Томск, 2007; Новосибирск, 2010), на научных семинарах кафедр патофизиологии, фтизиатрии и пульмонологии ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава (Томск, 2004–2010), на 41-ой Всемирной конференции Союза по проблемам здоровья легких (Берлин, 2010).
Внедрение. Результаты исследований внедрены в практику Областного государственного учреждения здравоохранения «Томская областная клиническая туберкулезная больница», а также используются в лекционном курсе по фтизиатрии в разделах “Клинико-социальные аспекты современного туберкулеза легких”, “Патофизиология туберкулеза”, “Иммунитет и аллергия туберкулеза”, “Лабораторная диагностика туберкулеза”, “Лечение туберкулеза”, а также в лекционном курсе по патофизиологии – “Патофизиология иммунитета”, “Воспаление”, “Патофизиология системы крови”.
Публикации. По материалам диссертации опубликованы 58 научных работ, из них 22 – в ведущих рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ для публикаций результатов исследования.
Работа выполнена на базе кафедр фтизиатрии и пульмонологии, патофизиологии, Центральной научно-исследовательской лаборатории (ЦНИЛ) ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава г. Томска при финансовой поддержке Совета по грантам при Президенте РФ для молодых российских ученых и ведущих научных школ (МК-147.2003.04, НШ-4153.2006.7, НШ-2334.2008.7).
Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 334 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, 4 глав, заключения, выводов, практических рекомендаций, приложения и указателя литературы. Работа иллюстрирована 20 рисунками и содержит 31 таблицу. Указатель литературы содержит 597 наименований, из них 257 отечественных и 340 иностранных источников.
Личный вклад автора. Разработанная идея, полученные результаты, научные положения достигнуты, проанализированы и сформулированы лично автором. Автор принимал участие в обследовании и лечении всех больных.
Стратегии иммунной защиты организма в борьбе с туберкулезной инфекцией
Проблема лекарственной устойчивости возбудителя туберкулеза к противотуберкулезным препаратам приобрела в последнее время глобальное значение [Migliori G.B., 2007; Мишин В.Ю., 2008; Wright A. et al., 2009; Camincro J.A., 2010]. Особенно настораживает увеличение распространенности случаев заболевания с первичной лекарственной устойчивостью (ЛУ) МВТ у больных, ранее не получавших противотуберкулезных препаратов [Голышевская В.И. и др., 2003; Балабанова Я. М. и др., 2005; Шилова М.В., 2005; Зиновьев И.П. и др., 2009], а среди ранее пролеченных пациентов вторичная (приобретенная) ЛУ МБТ к ПТП в ряде регионов России достигает 88% [Нечаева О.Б., Скачкова Е.И., 2003; Балабанова Я.М., 2005; Приймак А.А., 2005; Худушина ТА., 2005; Шилова М.В., Хрулева Т.С., 2005]. Кроме того, отмечается неблагоприятная тенденция в повышение удельного веса полирезистентности (устойчивость МБТ к 2 и более ПТП, но не к сочетанию изониазида (Н) и рифампицина (R)) и уменьшение монорезистентности (устойчивость МБТ к одному ПТП) [Сафарян М.Д., 2008; Зиновьев И.П. и др., 2009]. Серьезные опасения вызывает возрастание удельного веса первичной ЛУ к наиболее активным химиопрепаратам - Н и R, при которой в их сочетании с другими ПТП основного ряда или без них формируется МЛУ МБТ, а при сочетании с препаратами резервного ряда, включающими фторхинолоны и один из инъекционных препаратов (канамицин или капреомицин) - обширная ЛУ МБТ [Migliori G.B. et al., 2007; Caminero J.A., 2010].
В России, по данным Н.Б. Найговзиной и соавт. (2009), первичная МЛУ МБТ составляет 9,8% среди впервые выявленных больных. По данным исследований по отдельным территориям, колебания этого показателя весьма существенны: от 1— 15% (Архангельская, Брянская, Московская, Смоленская, Томская области, Республики Татарстан, Ингушетия), до 16-48% (Волгоградская, Ивановская, Читинская области) [Попов С.А. и др., 2008]. При этом у впервые выявленных больных с остропрогрессирующим туберкулезом легких типа казеозной пневмонии первичная ЛУ МБТ выявляется у 66,2%, в том числе МЛУ - у 17,3% больных [Мишин В.Ю. и др., 2001; Ерохин В.В. и др., 2005].
Исследования МБТ на молекулярном уровне позволили раскрыть некоторые генетические механизмы развития лекарственной устойчивости к ПТП. По своей природе резистентность обусловлена хромосомными мутациями. Лекарственная устойчивость развивается в результате одной или нескольких спонтанных хромосомных мутаций (точечных, редко делеций или вставок) [Musser J.M. 1995; Van Rie A.etal.,2001].
К настоящему времени изучены практически все гены МБТ, контролирующие лекарственную устойчивость к противотуберкулезным препаратам основного и резервного ряда, ответственных как за синтез белка-мишени действия препаратов или гиперпродукцию метаболитов, инактивирующих препараты, так и за селекцию и адаптацию, ведущую к естественному отбору лекарственно устойчивых мутантов. Возможны также и хромосомная и плазмидная формы лекарственной устойчивости МБТ, где противотуберкулезные препараты выступают в роли мутагенного средства. Лекарственная устойчивость хромосомной природы вызывается изменениями рибосомно-матричной системы МБТ, а внехромосомная (плазмидная) связана с одним из видов эписом (R-фактором). Генетические механизмы развития лекарственной устойчивости МБТ лежат в основе явления перекрестной устойчивости (кросс-резистентности), когда наблюдается генетически обусловленная лекарственная устойчивость к нескольким химически однородным препаратам одновременно. При этом множественная лекарственная устойчивость как результат спонтанных мутаций праюгически невозможна, поскольку нет единого гена, кодирующего МЛУ, а мутации, приводящие к развитию устойчивости к различным препаратам, генетически не связаны [Zhang Y. et al., 1992; Telenti et al., 1993; Ramaswamy S., Musser J. M., 1998; Lee A.S. et-al., 1999; Ramaswamy S. et al., 2000; Степаншина B.H. и др., 2000; Скотникова О.И. и др., 2002; Норкина О.В. и др., 2003; Мишин В.Ю., 2005].
Установлено, что тяжесть и течение специфического процесса в легких во многом обусловлены генотипом возбудителя. Наибольшее распространение в мире (и на территории России) получил штамм Beijing [Escalante P. et al., 1998; Fang L. et al., 1999; Нарвская О.В. и др., 1999; Скотникова О.И., 2005]. В сравнении с МБТ индивидуальных генотипов изоляты МБТ семейства Beijing обладают большей частотой МЛУ и полирезистентностью [Скворцова Л.А. юдр., 2005; Балабанова Я.М. и др., 2006]. Оценка вирулентности МБТ с различной чувствительностью к противотуберкулезным препаратам показала, что полирезистентные штаммы индивидуальных генотипов чаще обладают слабой вирулентностью (57,1%), тогда как МБТ генотипа Beijing — средней и высокой (84,2%) [Скворцова Л.А. и др., 2005]. Лекарственная устойчивость МВТ - явление, созданное руками человека. Основные причины, приводящие к развитию ЛУ МВТ - неадекватное лечение: назначение менее 4 ПТП в интенсивную фазу химиотерапии, назначение препаратов без учета массы тела пациентов, возраста, сопутствующих заболеваний, введение одного нового препарата в случае неэффективности предшествующей схемы лечения, короткие курсы химиотерапии, отсутствие контроля за приемом ПТП, перерывы в лечении, непереносимость противотуберкулезных препаратов [Bastian L., Colebun-ders R., 1999; Iseman M.D., 1999; Rao S.N., 2000; Нечаева О.Б., Скачкова Е.И., 2003; Паролина Л.Е. и др., 2003; Мишин В.Ю., 2009]. Эти факторы приводят к неудачам в лечении больных, росту хронических форм заболевания, включая фиброзно-кавернозный туберкулез, и распространению среди населения качественно новых штаммов МВТ.
К ряду причин развития ЛУ можно отнести недостаточное снабжение лекарствами [Дорожкова И.Р. и др., 2000; Long R., 2000; Abat G., 2002], административные задержки доставки препаратов, приобретение нестандартных ПТП из-за экономических трудностей, отсутствие социальной защищенности больных туберкулезом [Чуканов В.И., 2001]. K.F. Laserson и соавт. (2001) в своем исследовании в Колумбии, Индии, Латвии и Вьетнаме выявили несоответствие стандартам и биопригодности противотуберкулезных препаратов: в 10% случаев препараты содержали менее 85% от заявленной дозы лекарственного вещества, при этом более частое отклонение от стандарта было зафиксировано у комбинированных ПТП с фиксированными дозами (21%), чем в раздельных формах противотуберкулезных препаратов (13%). Резюмируя, авторы констатируют, что неправильное биосоответствие комбинаций лекарственных средств ведет к недостаточной концентрации препаратов в крови и способствует формированию лекарственной устойчивости инфицирующего штамма. Наличие некачественных ПТП, перерывы в лекарственном обеспечении отмечены так же и в России [Шакирова Д.Х. и др., 2004].
Методы исследования функционального статуса фагоцитов периферической крови
Согласно современной концепции о роли фагоцитов в иммунологических реакциях организма человека, необходимо подчеркнуть их особую роль в отношении приобретенного иммунитета. Тканевые макрофаги являются «предъявителями» антигенных детерминат Т-литмфоцитам в виде комплекса с продуктами иммунорегу-ляторных генов (la-белками), презентированных на плазматической мембране.
В конце 80-х гг. прошлого века было показано, что продукция и секреция про-воспалительных цитокинов (IL-1, TNF-a, IFN-y, IL-6 и IL-8), которые обеспе.чивают антибактериальную, противовирусную и противоопухолевую защиту организма, стимулируются липополисахаридом клеточной стенки грамотрицательных бактерий. Провоспалительные цитокины опосредуют многие общие гематологические и метаболические сдвиги, характерные для ответа организма на инфекцию: лихорадку, нейтрофилию, синтез острофазных белков и глюкокортикоидов, усиление процессов коагуляции, повышение проницаемости сосудов, снижение массы тела [Keller R., 1980; Фрейдлин И.С., 1995; Калашникова Е.А. и др., 2000].
Интересно, что липополисахарид (ЛПС) грамотрицательных бактерий индуцирует выработку мононуклеарными фагоцитами и противовоспалительных цитокинов, принципы действия которых различны. Одни из них блокируют на Поверхности макрофага рецепторы для провоспалительных цитокинов. Так, действуют молекулы-антагонисты рецептора IL-1 (IL-IRa). Растворимые рецепторы IL-1 и TNF-a (sIL-lR, sTNFR) и TNF-связывающие белки (TNF-BP) прочно связывают соответствующие цитокины и ингибируют их биологическую активность. Наряду с продукцией противовоспалительных цитокинов, те же мононуклеарные фагоциты способны секретировать цитокины, оказывающие down-регулирующее действие на соответствующие мишени. Так IL-10, IL-13 и TGF-P, а также лимфокин IL-4 (продукт Th2) препятствуют активации макрофагов провоспалительными цитокинами. IFN-a/p также относят к противовоспалительным цитокинам. Эти молекулы могут ингибировать экспрессию генов провоспалительных цитокинов либо индуцировать синтез IL-IRa и растворимых рецепторов sIL-lR и sTNFR, а также снижать экспрессию клеточных рецепторов к IL-1 и TNF-a [Bosque F., 1997; Луговская С.А., 1998; Van der Meer J.W., Gordon S., 1998]. IL-4 и TGF-P ингибируют окислительный взрыв и продукцию нитроксидных радикалов. Очевидно, что иммунорегуляторные возможности макрофага реализуются не только за счет продукции и секреции ряда цитокинов, но и вследствие экспрессии на клеточной мембране гамма-рецепторов для тех или иных цитокинов. Благодаря этому цитокины модулируют свойства и активность макрофагов, а макрофаги кон тролируют работу цитокиновой регуляторной сети [Keller R., 1980; Gordon S., 1998]. :
Нейтрофильные гранулоциты также способны оказывать существенное регу-ляторное влияние на другие клетки крови, клетки эндотелия и соединительной ткани, на ферментативные системы плазмы [Нестерова И.В., 1$99, 2004; Fessler М.В., 2002; Куртасова Л.М. и др., 2003; Швыдченко И.Н. и др., 2005]. Активированные нейтрофилы секретируют наряду с продуктами гранул широкий спектр других биологически активных веществ, модулирующих активность моноцитов/макрофагов и лимфоцитов (усиление пролиферации В-лимфоцитов) и регулирующих иммунный ответ [Долгушин И.И. и др., 1995, 1998; Тугуз А.Р. и др., 2002; Al-Mohanna F. et al., 2002; Ethuin F. et al., 2003]. В настоящее время продукты ней-трофилов называют нейрофилокинами и относят к гетерогенной группе регулятор-ных пептидов, к которой также принадлежат моно- и лимфокины [Borish L. et al., 1989; Васильева Г.И. и др., 2000]. Установлено, что стимулированные полиморф-ноядерные нейтрофилы способны секретировать в кровоток большое количество цитокинов - IL-lp, -1га, -3, -4, -6, -8, -12, TNF-a, GM-CSF, IFN-a, IFN-y - которые выступают в качестве модуляторов воспалительного процесса и участвуют в каскадной сети регуляции иммуногенеза [Долгушин И.И. и др., 1995, 1998; Потапнев М.П., 1995; Хаитов P.M., Пинегин Б.В., 2000; Delgado A.V. et al., 2003; Denkers E.Y. et al., 2003; Швыдченко И.Н. и др., 2005]. В литературе имеются свидетельства о функциональной кооперации между клетками системы мононуклеарных фагоцитов и нейтрофилами. И.И. Долгушин и соавт. (1986) в эксперименте показали, что нейтрофилы периферической крови человека при инкубации их in vitro с взвесью частиц латекса выделяют растворимые факторы, вызывающие хемотаксис, усиливаю-щие фагоцитарную и лизосомальную активность моноцитов. Результаты исследований свидетельствуют о существовании кооперативных процессов между поли- и мононуклеарными клетками, описанных многими исследователями [Долгушин И.И. и др., 1986; Воеу Н. et al., 1989; Capsoni F. et al., 1997; Yu C.L. et aL, 1998; Grutkoski P.S. et al., 1999].
Таким образом, трудно подыскать такое изменение внутренней среды организма, которое бы не фиксировалось системой фагоцитов. Являясь мощными эффекторами, фагоциты превращаются в узел связи своего рода стратегическую мишень, через которую трансформируются все реакции крови и соединительной ткани. Прав был И.И. Мечников, когда отводил им роль «живой цепи» в организме, говоря о широком спектре задач, решаемых фагоцитами, и многообразии их функциональных контактов с другими клетками и тканями.
Изучение фагоцитоза при туберкулезе имеет очень большую историю, начиная с работ И.И. Мечникова и СИ. Метальникова. Многие исследователи расценивали фагоцитоз как непременный, если не основной, механизм в противотуберкулезной защите. На сегодняшний день исследователи подвергли всестороннему изучению взаимоотношения микобактерии с фагоцитами в зависимости от вирулентности возбудителя, естественной и приобретенной резистентности к туберкулезу. Активно изучается роль доминирующих клеток, мононуклеаров, при туберкулезе играющих важную роль в клеточном иммунитете в борьбе с МБТ [Фрейдлин И.С., 1984; Вахидова Г.А. и др., 1991; Kaufinann S.H., 2002; Комогорова Е.Э. и др„ 2005]. Установлено, что способность макрофагов убивать внутриклеточные патогены, такие как МБТ, зависит от генетической устойчивости и ассоциирована с геном beg [Moisan J. et al., 2001]. Основным его белковым продуктом является макрофагаль-ный белок, связанный с естественной устойчивостью макрофагов (Natural resistance-associated macrophage protein 1, Nrampl) к внутриклеточным патогенам [Alter-Koltunoff М. et al. 2003; Remus N. et al., 2003]. Nrampl является насосом, выкачивающим двухвалентные катионы, такие как Fe2+ и Ni2+, из эндосом в цито-золь за счет обмена на протоны. Nrampl экспрессирован исключительно в клетках макрофагально-моноцитарной линии. Его основная роль связана с устойчивостью фагоцитов именно к внутрифагосомальным патогенам [Liu W. et al. 2004].
Факторы, влияющие на конверсию мокроты больных МЛУ ТБ
Анализ полученных данных позволил установить многообразие проявлений сопутствующей патологии — от латентных до выраженных клинических проявлений и нередко с осложнениями. Наиболее распространенной сопутствующей патологией в наблюдаемых группах больных ТБ явился синдром алкогольной зависимости. При этом алкогольной зависимостью чаще страдали больные МЛУ ТБ (49,2%), чем пациенты с ЛЧ ТБ (33,2%, р = 0,003). Важно, что всем пациентам при поступлении в стационар проводился скрининг-тест AUDIT, на основании которого определялась приверженность больного к алкоголю, которая в дальнейшем чаще всего подтверждалась на консультации у врача-нарколога.
При объединении у обследуемых пациентов с МЛУ ТБ всех встречаемых заболеваний желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) и гепатобилиарной системы (язвенная болезнь желудка и двенадцатиперстной кишки, хронический холецистит, цирроз печени, вирусные гепатиты, описторхоз) их доля составила более 50% от всех сопутствующих болезней. Необходимо отметить, что в группах наблюдения были зарегистрированы отличия по хроническому холециститу в сочетании с опи-сторхозом (все выявленные подобные случаи регистрировались только в группе больных МЛУ ТБ) и вирусным гепатитам В или С, В+С (8,5% и 1,0% соответственно, р 0,001). По анамнестическим сведениям в качестве сопутствующих туберкулезу заболеваний легких в 38,1% случаев в первой и в 61,8% во второй группе наблюдения пациенты указывали на хроническую патологию бронхолегочной системы (обструктивный и необструктивный бронхит, бронхиальная астма).
Изменения в слизистой бронхиального дерева, выявленные у больных, которым была проведена бронхоскопия, позволяют заключить, что неспецифические заболевания легких имели место у 58,3% пациентов с МЛУ ТБ и у 52,7% больных ЛЧ ТБ. В табл. 7 представлен характер изменений слизистой бронхов по данным бронхоскопии, проведенной у 65 пациентов с МЛУ ТБ и у 89 больных ЛЧ ТБ. Данные табл. 7 демонстрируют, что специфическое поражение бронхиального дерева чаще наблюдалось у больных с ЛЧ ТБ. Так, диагноз туберкулеза бронха у больных ЛЧ ТБ (13,3%) устанавливался в 2 раза чаще, чем у пациентов с МЛУ ТБ (6,1%, р 0,05). В целом эндоскопическая картина бронхиального дерева у наблюдаемых нами пациентов была представлена неспецифическими бронхитами. При этом в группе пациентов с МЛУ ТБ преобладал катаральный бронхит, а у пациентов с ЛЧ ТБ в равных долях диагностировался как катаральный, так и слизисто-гнойный эн-добронхит. В единичных случаях в обеих группах наблюдения были выявлены более глубокие поражения слизистой бронхов (гипер- или субатрофический эндоб-ронхит). Процесс локализовался преимущественно в главных бронхах, сочетался с поражением верхнедолевого, реже средне- или нижнедолевых бронхов.
Заболевания мочеполовой системы (в основном хронический пиелонефрит) регистрировались у 8,5% пациентов с резистентным туберкулезом и - 12,9% при чувствительном варианте инфекции. Страдали 6,8% пациентов с МЛУ ТБ и 2,0% больных ЛЧ ТБ сахарным диабетом 2-го типа в стадии субкомпенсации (см. табл. 6). Еденицы в обеих группах наблюдения страдали заболеваниями сердечнососудистой системы (преимущественно артериальная гипертензия и постинфарктный кардиосклероз). Особо выраженным было преобладание общих психических расстройств (депрессии, тревожности, эмоциональная неустойчивость, психозы) у больных МЛУ ТБ (21,2%) по сравнению с пациентами с чувствительной формой заболевания (8,9%), чаще всего на фоне длительного приема алкоголя (р = 0,002). Данные состояния были зарегистрированы после обязательной консультации пациентов врачом-наркологом. Кроме того, в группе больных ЛЧ ТБ в 3 раза чаще выявлялись заболевания опорно-мышечной системы. Преимущественно регистрировались остеохондроз, плекситы, ампутации фаланг пальцев вследствие отморожения и функциональные посттравматические нарушения конечностей, полученные после драк при алкогольном опьянении.
Основная часть больных в обеих группах был выявлен при обращении за медицинской помощью по поводу патологии органов дыхания (61,0% в іруппе МЛУ ТБ и 64,8% — в группе ЛЧ ТБ). При исследовании установлена регулярность прохождения пациентами контрольного исследования грудной клетки рентгенологическим методом. До выявления болезни проходили профилактические флюорографические обследования 1 раз в 2 года 66,1% пациентов с МЛУ ТБ и 52,9% больных ЛЧ ТБ. При этом последнее рентгенологическое исследование органов грудной клетки в течение предшествующего выявлению болезни года было зарегистрировано у 55,9% пациентов резистентным ТБ и у 35,1% больных ЛЧ ТБ (р 0,05). Треть пациентов с МЛУ ТБ (33,0%) и 46,5% больных ЛЧ ТБ не проходили профилактического рентгенологического обследования более 3 лет. Все случаи впервые выявленного фиброзно-кавернозного ТБ были отмечены у больных, не обследовавшихся более 2 лет до выявления заболевания вне зависимости от чувствительности возбудителя к противотуберкулезным препаратам.
У большинства пациентов обеих групп наблюдения на момент поступления в стационар общее состояние было удовлетворительным или средне-тяжелым, при этом тяжелое состояние чаще регистрировалось в группе больных с МЛУ ТБ - 21 (17,8%) против 10 (4,9%) в группе ЛЧ ТБ О 0,001) (табл. 8). В 1-й группе чаще выявлялись значительно выраженные симптомы интоксикации (77 (65,2%), р 0,001), а во 2-й - умеренно (88 (43,5%), р 0,001) и слабо выраженные (84 (41,5%), р 0,001).
При анализе клинических проявлений у больных ЛЧ ТБ чаще других симптомов выявлялась субфебрильная температура, в то время как при МЛУ ТБ преобладала фебрильная. Сравнительный анализ других результатов объективного обследования (потеря аппетита, бледность кожных покровов, дефицит массы тела), несмотря на то, что они присутствовали у каждого второго-третьего больного, не выявил отличий в наблюдаемых группах. Отличительная оценка данных объективного обследования показала, что у больных МЛУ ТБ чаще наблюдался кашель с гнойной мокротой (19 (16,1%) против 9 (4,4%) у пациентов с ЛЧ ТБ, р 0,001)) с выслушиванием в легких хрипов различного характера (78 (61,1%) и 79 (39,2%) соответственно,/? 0,001) (табл.8).
Характеристика цитокинсекретирующей активности мононуклеарных лейкоцитов периферической крови у больных туберкулезом легких до применения противотуберкулезной терапии
До назначения специфических препаратов у больных инфильтративным, дис-семинированным и фиброзно-кавернозным МЛУ ТБ СЦК указанного фермента отличался от аналогичных значений в группе здоровых доноров (2,34 ± 0,07, р 0,01; 2,52 ± 0,18, р 0,01; 2,38 ± 0,13, р 0,01; при норме 1,91 ± 0,06). В результате проведенного исследования функционального статуса нейтрофильных гранулоцитов периферической крови было выявлено снижение относительного содержания Fcy-позитивных клеток у больных МЛУ ТБ и ЛЧ ТБ по сравнению с показателями у здоровых доноров (42,68 ± 1,34)%; р 0,05, р 0,05 соответственно). При этом уровень экспрессии Fcy-рецепторов на поверхности нейтрофилов зависел от клинической формы МЛУ ТБ (см. табл. 25): был минимальным у больных инфильтративным МЛУ ТБ (33,60 ± 4,92)%, диссеминироваппым МЛУ ТБ (28,52 ± 1,38)% и максимально сниженным у пациентов с фиброзно-кавернозным МЛУ ТБ (21,22 ± 4,21)%. Количество СЗЬ-рецептор-несущих клеток не отличалось от нормы при всех клинических формах у пациентов как с МЛУ ТБ, так и ЛЧ ТБ. До лечения у больных инфильтративным МЛУ ТБ СПЛ лизосом не отличался от такового у здоровых доноров и регистрировался выше, чем при ЛЧ ТБ (54,87 ±5,13 и 38,90 ± 4,02 соответственно, р = 0,007). СПЛ лизосом в нейтрофилах у пациентов с диссемини-рованным ТБ проявлял разнонаправленные изменения при МЛУ и ЛЧ ТБ. Так, у пациентов с МЛУ ТБ регистрировалось увеличение показателя люминесценции (до 55,2 ± 4,27) по сравнению с подобным показателем у здоровых добровольцев (р 0,01) и пациентов с ЛЧ ТБ (р = 0,005). Что касается ЛЧ ТБ, то у данной категории больных уровень лизосом устанавливался ниже, чем в группах сравнения (см. табл. 26). В іруппе больных фиброзно-кавернозным МЛУ ТБ, наоборот, до начала специфической терапии отмечалось снижение СПЛ лизосом в нейтрофилах (37,45 ± 0,55) по сравнению с таковым у здоровых добровольцев (р 0,05) и у пациентов с ЛЧ ТБ (р = 0,033). При оценке суммарной продукции активных форм кислорода (АФК) нейтрофилами по результатам спонтанного IICT-теста, до применения противотуберкулезной терапии ее акгивность не отличалась от нормальных значений у больных с различными клиническими формами МЛУ и ЛЧ ТБ. Однако во всех группах наблюдения было выявлено снижение показателей стимулированного НСТ-теста и РРН относительно соответствующих показателей у здоровых до норов. При этом у больных ЛЧ ТБ имело место наиболее выраженное угнетение параметров индуцированного НСТ-теста (по сравнению с показателями у здоровых лиц (р 0,01) и резервной реактивности нейтрофильных гранулоцитов (сравнительно с параметрами у здоровых доноров (р 0,01) и у больных основной группы: р = 0,028 при инфильтративпом МЛУ ТБ, р = 0,047 при диссеминированном МЛУ ТБ ар = 0,028 при фиброзно-кавернозном МЛУ ТБ). Наряду с указанными изменениями, у пациентов обеих групп, страдающих туберкулезом легких устанавливалось снижение (в 2 раза) процентного содержания активных нейтрофилов до (31,87 ± 2,99)% у больных инфильтративным ТБ, (36,08 ± 0,32)% — у больных диссемини-рованным ТБ и (30,26 ± 4,52)% - у больных фиброзно-кавернозным ТБ при норме (65,52 ± 0,86)% (р 0,01) и снижение показателя завершенности фагоцитоза (до (42,60 ± 2,66)%, (52,15 ± 3,17)%, (42,20 ± 6,34)% соответственно) по сравнению со значениями у здоровых доноров (61,28 ± 0,85)%. Однако при МЛУ ТБ уровень активных нейтрофилов оказался более высоким, чем у пациентов с ЛЧ ТБ. Вместе с тем, функциональный статус нейтрофилов периферической крови у больных МЛУ ТБ (за исключением пациентов с фиброзно-кавернозным ТБ) характеризовался высокой поглотительной способностью нейтрофильных гранулоцитов (6,20 ± 0,43) ед. опт. пл. при инфильтративном ТБ и (7,09 ±0,14) ед. опт. пл. при диссеминированном ТБ при контрольных значениях (5,12 ± 0,07) ед. опт. пл., (р 0,05). При этом в группе больных диссеминированным ЛЧ ТБ ПСН снижался относительно нормальных значений (р 0,01). Поглотительная способность нейтрофильных гранулоцитов у больных фиброзно-кавернозным МЛУ ТБ была в пределах нормальных значений.
При изучении функциональных особенностей моноцитов (см. табл. 27) у больных МЛУ ТБ было зарегистрировано снижение (относительно нормальных значений) количества как СЗЬ-несущих, так и Fcy-презентирующих клеток (р 0,01). Снижение уровня экспрессии изучаемых рецепторов (по сравнению со значениями у здоровых допоров) устанавливалось и при лекарственно-чувствительном варианте инфекции. Уровень поглотительной активности моноцитов в период максимально выраженной клинической симптоматики (до лечения) был резко повышенным у больных МЛУ ТБ - до (249,00 ± 70,07) ед. опт. пл. при инфильтративном туберкулезе легких, 277,46 ± 12,34 ед. опт. пл. - при диссемини ровашюм ТБ и (281,00 ± 36,6) ед. опт. пл. - у больных фиброзно-кавернозным ТБ при (123,60 ± 2,76) ед. опт. пл. в контроле {р 0,01).
До начала терапии у больных ТБ вне зависимости от чувствительности возбудителя к химиопрепаратам СПЛ лизосом в моноцитах устанавливался выше, чем у здоровых лиц с максимально выраженными его изменениями у больных диссеми-нированным МЛУ ТБ (41,52 ± 0,65 против 12,61 ± 1,86 у здоровых добровольцев, р 0,001). Аналогично активность сывороточного лизоцима в обеих группах больных ТБ регистрировалась выше, чем у здоровых лиц. При этом концентрация сывороточного лизоцима при всех клинических формах у пациентов с ЛЧ ТБ оказалась выше, чем у больных МЛУ ТБ (р = 0,048,/? = 0,045, р = 0,047) (табл. 27).
Исследование спонтанной продукции мононуклеарными лейкоцитами крови оксида азота по содержанию нитритов (табл. 28) у больных инфильтративным ТБ обеих групп наблюдения до начала лечения не выявило существенных ее изменений относительно нормы.
