Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Литературные данные по раннему выявлению туберкулеза у детей и подростков 11
1.1. Особенности туберкулеза у детей и подростков на современном этапе 11
1.2. Особенности туберкулинодиагностики по пробе Манту 2ТЕ в современных условиях 16
1.3. Диаскинтеств диагностике туберкулезной инфекции 21
Глава 2. Характеристика обследованных пациентов и применяемые методы обследования31
2.1. Общая характеристика обследованных групп пациентов 31
2.2. Общеклинические методы 32
2.3. Лабораторные методы 32
2.4. Кожные аллергологические пробы в ранней диагностике туберкулеза.. 33
2.5. Иммунологические методы исследования сыворотки крови 34
2.6. Методы обработки полученных результатов 35
Глава 3. Собственные результаты 36
3.1. Характеристика группы с впервые выявленными клиническими формами туберулеза 36
3.2. Характеристика группы детей с положительными результатами выявления микобактерий туберкулеза 50
3.3. Характеристика группы детей с конверсией туберкулиновых проб 55
3.4. Факторы риска развития туберкулезной инфекции 58
3.5. Клинический пример 64
3.6. Иммунологические исследования в изучаемых группах 69
3.6.1. Особенности системы общего иммунитета и стимулированной продукции IFN-Y в группе здоровых детей 69
3.6.2. Особенности системы общего иммунитета и стимулированной продукции IFN-Y у детей с локальными формами туберкулеза 72
3.6.3. Особенности системы общего иммунитета и стимулированной продукции IFN-Y у детей с конверсией туберкулиновых проб 78
3.6.4. Сравнительный анализ иммунологических показателей по группам 81
3.6.5. Особенности субпопуляционной структуры и стимулированной продукции IFN-y у детей с отрицательными и положительными результатами с Диаскинтест 84
Глава 4. Обсуждение 90
Алгоритм диагностики 102
Выводы 103
Практические рекомендации 104
Список использованных литературных источников 106
- Особенности туберкулинодиагностики по пробе Манту 2ТЕ в современных условиях
- Кожные аллергологические пробы в ранней диагностике туберкулеза
- Характеристика группы детей с положительными результатами выявления микобактерий туберкулеза
- Особенности системы общего иммунитета и стимулированной продукции IFN-Y в группе здоровых детей
Особенности туберкулинодиагностики по пробе Манту 2ТЕ в современных условиях
Несмотря на то, что с момента открытия M. Tuberculosis прошло более 100 лет, в ряде стран основным методом для первичного массового скрининга населения для выявления туберкулеза продолжает оставаться достаточно старый, по современным меркам, кожный туберкулиновый тест (Пальцев М.А., 2010).
Создание эффективного и специфичного препарата для диагностики туберкулеза берет начало с работ Р. Коха (Koch H.P., 1891), который в 1891г. выделил компоненты M. Tuberculosis из концентрированной культуральной жидкости. Вскоре обнаружилось, что подкожное введение больным туберкулезом экстракта M. Tuberculosis вызывает кожную реакцию. В 1932 г. Seibert F.B., получил очищенный туберкулин – PPD. В 1941г была утверждена серия ППД-С как международный стандарт очищенного туберкулина, ВОЗ совместно с ЮНИСЕФ организовали производство очищенного туберкулина (серия RT23) для широкого применения. Главным недостатком очищенного туберкулина является недостаточная специфичность из-за содержания в нем белков, встречающихся у микобактерий различных видов. В России применяется сухой очищенный туберкулин, полученный в 1939г. М.А. Линниковой - туберкулин ППД-Л.
Внутрикожная проба Манту продолжает оставаться одним из наиболее распространенных методов диагностики туберкулеза в мире при массовых эпидемиологических обследованиях населения на туберкулез. В настоящее время для проведения массовой туберкулинодиагностики используется единая внутрикожная туберкулиновая проба Манту 2 ТЕ в стандартном разведении для внутрикожного применения (приказ № 109 Минздрава РФ, Митинская Л.А., 1998). Массовая туберкулинодиагностика с применением внутрикожного туберкулинового теста Манту с 2ТЕ в современных условиях сохраняет свою актуальность как метод, позволяющий выявить группы риска по заболеванию туберкулезом среди детей. У детей младшей возрастной группы об инфицированности детей МБТ убедительно свидетельствуют только гиперергические реакции на туберкулин. Наиболее информатиным внутрикожный тест Манту является в возрасте 7-11 лет и 12-14 лет. По данным обследования у фтизиатра стабильно высокий показатель виража отмечается с 11 лет, с 12 лет увеличивается доля гиперергических и нарастающих реакций на туберкулин, отмечается значительная доля детей, инфицированных микобактериями туберкулеза более 2-лет (Зубова Е.Д., Мотанова Л.Н, 2011). Вторая половина XX в. ознаменовалась интенсивным развитием аллергологии, генетики, генной инженерии, молекулярной биологии, иммунологии, что позволило установить свойства туберкулина и расшифровать механизм реакции Манту. Поскольку туберкулин представляет собой суммарный экстракт антигенов M. Tuberculosis, это предопределяет низкий уровень специфичности реакции Манту. За счет комплекса общих микобактериальных антигенов, присутствующих в туберкулине, положительная реакция Манту не выявляет различий между активно размножающейся и латентной формами заболевания (бессимптомное носительство). На результат реакции могут влиять аллергические проявления, кожные заболевания, перенесенные инфекции, индивидуальные особенности чувствительности кожи, что затрудняет интерпретацию результатов (Киселев В.И. и др. 2008, Лебедева Л.В., Грачева С. Г., 2007, Andersen P. Munk M.E., 2000). Для России, где проводится поголовная БЦЖ вакцинация новорожденных, применение кожного туберкулинового теста при массовых эпидемиологических обследованиях продолжает оставаться системообразующим методом контроля за распространением туберкулеза. Со временем накапливалось все больше данных о низкой информативности реакции Манту (Steenhuis T.J., van Aalderen W.M., Bloksma N., 2008). Существующая туберкулинодиагностика ограничена в своих возможностях, поскольку: 1) обладает низкой специфичностью у вакцинированных детей – с ее помощью нельзя отличить поствакцинальную от инфекционной аллергии, причем поствакцинальная аллергия сохраняется после прививки в течение 10 лет и более (Лебедева Л.В., Грачева С.Г., 2007). 2) нельзя отличить активную туберкулезную инфекцию от перенесенного в прошлом инфицирования или локального туберкулезного процесса (Lee Elsie, Holzman Robert S, 2002). 3) обладает низкой чувствительностью при активном туберкулезе - до 15-50% отрицательных реакций (Fiallbrant H., 2008). В последние годы стало очевидно, что проявление поствакцинальной и (или) неспецифической аллергии вносят значительную неопределенность в процесс диагностики туберкулезной инфекции посредством кожного туберкулинового теста. Основной причиной этого является препарат для постановки реакции - туберкулин, который содержит полный набор микобактериальных антигенов, которые вызывают аллергические и ложноположительные реакции, прежде всего у БЦЖ - вакцинированных людей. При проведении пробы Манту с 2ТЕ, как метода раннего выявления туберкулеза формируется VI группа диспансерного учета у фтизиатра.
Кожные аллергологические пробы в ранней диагностике туберкулеза
Проба Манту с 2ТЕ оценивалась через 72 часа в мм. Отрицательной пробой считали отсутствие папулы и гиперемии или наличие только уколочной реакции; сомнительной - папула 2-4 мм. Инфицированными считали детей с впервые положительной пробой (папула более 5 мм, не связанная с вакцинацией); со стойко сохраняющимся размером папулы более 12 мм; с нарастанием чувствительности к туберкулину на 6 мм и более в течение одного года и с нарастающей чувствительностью на протяжении трех и более лет. Диаскинтест проводился по №855 приказу "О внесении изменения в приложение № 4 к приказу № 109 Минздрава России ". В Приложении № 2 к Инструкции по применению туберкулиновых проб прописано, что пробу с препаратом Диаскинтест проводят лицам, направленным в противотуберкулезное учреждение.
Отрицательной пробой считается только наличие уколочной реакции; сомнительной пробой - гиперемия без инфильтрата; положительной пробой -папула любого размера: слабоположительные - до 5 мм, умеренно выраженные 5-9 мм, выраженные - 10 мм и более. Гиперергические пробы - инфильтрат 15мм и более, а так же везикуло-некротические реакции. 2.5. Иммунологические методы исследования сыворотки крови Иммунологические исследования выполнены в Самарском диагностическом центре, в отделе лабораторной диагностики. Иммунологическими методами определяли процентное содержание субпопуляций лимфоцитов (CD4+, CD 16+) с помощью меченых ФИТЦ и фикоэритрином МКАТ серии LT (“Сорбент”, Москва). Иммуно флюоресценция клеток оценивалась на лазерном проточном цитофлюориметре “Calibur” (“BD” USA) в режиме CellQuest Pro. Проводили клинический анализ крови для определения абсолютного количества лейкоцитов (WBC) с помощью гематологического анализатора Medonic (Швеция). Абсолютное содержание CD4+-, CD 16+ - клеток (абс х 109 клеток /мл) определяли по формуле: абс лимфоцитов х % - ное содержание субпопуляции
Оценку неспецифической и специфической функциональной активности клеток иммунной системы проводили путем определения уровня продукции IFN-Y после инкубации цельной гепаринизированной периферической крови с ФГА и ДСТ, соответственно, в течение 12 часов при 37С. Уровень IFN-y определяли в супернатанте с использованием ИФТС (НПО “Вектор-Бест”, Новосибирск). 2.6. Методы обработки полученных результатов Статистическую обработку числового материала проводили с использованием программы Statistica 5.5 с заданной надежностью P = 95% или уровнем значимости р = 0,5. Для статистического анализа показателей, распределение которых носило нормальный характер, использовались такие параметрические критерии, как Хср., , d, Х min, Xmax, , К. Оценка значимости измерений средних арифметических значений проводилась с помощью критерия Стьюдента (). Для статистического анализа показателей, не подчиняющихся нормальному распределению, использовались такие параметрические критерии, как Me, Мо, R. Где Медиана - это наиболее часто повторяющееся значение; Мода – это срединное значение; R - коэффициент корреляции по Спирману.
В группе детей с локальными формами туберкулеза диагностированы следующие формы туберкулеза: туберкулез внутригрудных лимфатических узлов – 50 (50%), первичный туберкулезный комплекс 2 (2%) случая; очаговый туберкулез 15 (15%), инфильтративный туберкулез 22 (22%), экссудативный плеврит туберкулезной этиологии 6 (6%), внелегочный туберкулез 5 (5%). Среди форм внелегочного туберкулеза 2 случая туберкулеза периферических лимфатических узлов, 3 случая туберкулеза костей (табл.2).
Характеристика группы детей с положительными результатами выявления микобактерий туберкулеза
В группе детей c локальными формами туберкулеза было выявлено 12 пациентов бактериовыделителей. Учитывая, что выявление микобактерий туберкулеза является абсолютным диагностическим критерием специфического туберкулезного процесса, мы провели анализ этой группы пациентов. Среди детей, выделяющих МБТ, было 9 девочек и 3 мальчика. При распределении по возрасту, выявлено, что среди детей до 7 лет был один мальчик 2-х лет. Преобладали дети в возрасте 8 – 14 лет (5 девочек и один мальчик) и 15 – 17 лет (4 девочки и один мальчик). Таким образом, в нашем исследовании, микобактерии туберкулеза в 3 раза чаще выявлялись у девочек (табл.13).
У всех детей, выделителей микобактерии туберкулеза, было изучено наличие вакцинации (и ревакцинации) BCG и ее эффективность. Вакцинированных BCG детей было 10 человек, из них один ребенок был ревакцинирован (имел рубчик после ревакцинации BCG). Среди вакцинированных BCG детей, у 4-х пациентов отмечалась неэффективная вакцинация (слабо выраженный рубчик до 3 мм, отрицательная проба Манту 2 ТЕ в 1 год). При изучении эпидемиологического анамнеза установлен контакт с больными туберкулезом у 5 пациентов. При изучении клинических форм туберкулеза у детей с бактериовыделением выявлено, что основной формой был инфильтративный туберкулез легких (9), причем бактериоскопическим методом микобактерии туберкулеза выявлялись только при этой форме специфического процесса (4 случая) (табл.14). Таблица 14 Распределение положительных результатов выявления микобактерий туберкулеза в зависимости от формы туберкулеза Форма туберкулеза Бактериоскопический метод (абс) Бактериологический метод (абс) ТВГЛУ – 1 Первичный туберкулезный комплекс 1 Инфильтративный туберкулез легких 4 9 Очаговый туберкулез легких 1 Всего 4 12 При изучении способа выявления туберкулеза было установлено, что большинство детей (10 человек) были выявлены при профилактических осмотрах: во время массовой туберкулинодиагностики был выявлен инфекционный характер туберкулиновых проб у 7 детей (по «виражу» туберкулиновой пробы - 2; нарастание чувствительности к туберкулину - 5); по контакту - 2; при флюорографическом обследовании - 1. При обращении с жалобами из общей лечебной сети выявлено 2 человека (у этих детей ретроспективно выявлен монотонный характер туберкулиновых проб).
Проводя анализ сопутствующей патологии, выяснено, что чаще всего в данной группе встречались дети с анемией различной степени тяжести - 3 пациента; состоял на диспансерном учете по поводу перинатальной патологии ЦНС 1 человек; так же по одному пациенту наблюдались по поводу бронхиальной астмы, дискинезии желчевыводящих путей (ДЖВП), эпилепсии.
При проведении стандартного обследования всем детям проведена оценка чувствительности к туберкулину по пробе Манту в стандартном разведении и выраженности пробы с препаратом Диаскинтест (табл.15) У всех детей, являющихся бактериовыделителями, отмечалась положительная проба Манту с 2ТЕ, при этом выраженность реакции была различной. Большинство детей имели выраженные положительные пробы 10-14 мм (9 человек); у 3-х детей отмечались положительные реакции 5-9 мм. Средний размер папулы составил 9,25мм (±4,5мм). После оценки результатов пробы Диаскинтест выявлено, что большинство детей имели выраженные положительные пробы с размером папулы 10-14мм - 7 человек. Результаты пробы Диаскинтест с инфильтратом 5-9 мм выявлены у одного ребенка (7 мм). Гиперергические пробы были у 3-х человек. Проба с Диаскинтест в одном случае оказалась отрицательной (у подростка с инфильтративным туберкулезом легких). Средний размер папулы составил 10мм (±5мм). При проведении сравнительной характеристики размеров папулы при положительных результатах проб Манту 2 ТЕ и Диаскинтест установлено, что большинство детей имели размер папулы 10-14мм - 9 и 7 человек соответственно. Но количество проб со слабоположительным результатом было больше по пробе Манту 2 ТЕ, а с гиперергическим - при пробе с препаратом Диаскинтест. Таким образом, при активном туберкулезе с бактериовыделением, пробы с препаратом Диаскинтест имеют более выраженный характер, но в одном случае проба была отрицательная. Всем детям определена лекарственная чувствительность МБТ. При определении лекарственной чувствительности (ТЛЧ) в 2 (16,7%) случаях выявлена множественная лекарственная устойчивость: в одном случае устойчивость к изониазиду и рифампицину; во втором - к изониазиду, рифампицину, стрептомицину и этамбутолу. Размер проб у них был по реакции Манту 2 ТЕ 5-9мм, по пробе с препаратом Диаскинтест 15-16мм. Эти дети были из контакта с больными туберкулезом взрослыми, у которых также определялась множественная лекарственная устойчивость.
Таким образом, данный анализ показал, что бактериовыделение было установлено в 12% случаев от всех локальных форм туберкулеза. Большинство детей выявлено при проверочных осмотрах по результатам туберкулинодиагностики. Анализ предшествующих проб Манту с 2ТЕ показал, что у 2-х детей был выявлен «вираж» туберкулиновых проб; у 5 детей отмечалось нарастание туберкулиновой чувствительности. У пациентов, выявленных при обращении в общую лечебную сеть, установлен монотонный характер туберкулиновой чувствительности. При изучении факторов риска установлено, что у 40% детей из вакцинированных BCG отмечалась неэффективная вакцинация. Большое значение имело выявление контакта с больным туберкулезом. Двое детей были выявлены по контакту, еще у 3-х пациентов удалось установить контакт при сборе анамнеза. Сопутствующие заболевания имели 7 человек. Анализ выраженности кожных проб в группе детей, выделяющих микобактерии туберкулеза, показал, что чаще всего пробы имеют размеры 10-14мм как по пробе Манту 2 ТЕ, так и по пробе Диаскинтест, но при пробе с препаратом Диаскинтест больше выраженных и гиперергических результатов. Для выявления локальных форм туберкулеза большое значение имеет комплексный подход с учетом как результатов плановой туберкулинодиагностики, так и работы с группами риска. Диаскинтест показал высокую эффективность в этой группе, за исключением одного случая инфильтративного туберкулеза легких в фазе распада. 3.3. Характеристика группы детей с конверсией туберкулиновых проб
Среди детей до 1 года девочек и мальчиков было поровну – по 2,2% (1); в возрасте 1-3 года девочек было больше: 11,1% (5) и 8,9% (4) соответственно; в возрасте 4 - 7 лет девочек было больше почти в два раза: 22,2% девочек (10) и 13,3% мальчиков (6); в возрасте 8 - 14 лет и в возрасте 15 - 18 лет больше мальчиков: 20% (9) и 6,7% (3) мальчиков и 11,1% (5) и 2,2% (1) девочек соответственно. В целом, «вираж» одинаково часто выявлялся у мальчиков и девочек, с небольшим преобладанием у мальчиков.
У всех детей с «виражом» туберкулиновых проб было изучено наличие вакцинации BCG и ее эффективность. Вакцинированных BCG детей было 86,7% (39 человек). Из них, у 25,6% пациентов (10 человек) отмечалась неэффективная вакцинация (слабо выраженный рубчик, отрицательная проба Манту 2 ТЕ в 1 год). Не были вакцинированы BCG 13,3% (6) детей. При этом у всех детей отсутствие вакцинации BCG было связано с наличием ВИЧ инфекции у матери. При изучении эпидемиологического анамнеза установлен контакт с больными туберкулезом у 28,9 % (13) пациентов. Всем детям проведена оценка чувствительности к туберкулину (по пробе Манту в стандартном разведении). Оценка результатов туберкулиновой чувствительности проводилась в соответствии с инструкцией к препарату.
Особенности системы общего иммунитета и стимулированной продукции IFN-Y в группе здоровых детей
Для изучения особенностей иммунного ответа в изучаемых группах нашего исследования, на первом этапе было проанализировано состояние системы иммунитета детей группы контроля. Полученные результаты представлены в таблице 24. Анализ особенностей продукции IFN-y в группе здоровых детей показал, что выброс IFN-y в тест - системе с ДСТ in vitro практически совпадает с уровнем спонтанной продукции, составляя, в среднем, 8,8- 8,9 пг/мл, но не превышает 17,6 пг/мл (спонтанный 28,0 пг/мл). Выброс IFN-y клетками периферической крови в тест - системе с ФГА достигает значительно больших размеров и составляет, в среднем, 953,0 пг/мл.
Многофакторный корреляционный анализ показал, что продукция IFN-y в тест - системе с ФГА проявляет достоверные корреляционные связи с CD4+ -лимфоцитами и с продукцией IFN-y в тест - системе с ДСТ (табл.25). Корреляционные связи иммунологических показателей у Таким образом, очевидно, что у детей группы контроля, выброс IFN-y в тест - системе с ДСТ не превышает показателей спонтанного выброса, в связи, с чем далее таковой рассматривается нами как нулевой (табл.24). Принимая во внимание литературные данные, свидетельствующие о том, что противотуберкулезная активность системы иммунитета зависит как от количественного содержания субпопуляций лимфоцитов, так и от функционального состояния таковых, мы задались целью исследовать особенности субпопуляционной структуры лимфоцитов и стимулированной продукции IFN-y у детей с туберкулезной инфекцией. Полученные данные по иммунологическим показателям в сопоставлении с клиническими данными могут быть более информативными с точки зрения как диагностики, так и прогноза течения заболевания. Формирование эффективной иммунологической защиты от микобактерии туберкулеза определяется взаимодействием лимфоцитов, участвующих в реализации клеточно-опосредованного иммунитета. Ведущая роль в контроле иммунного ответа, индуцированного микобактериями туберкулеза, принадлежит CD4+ Т-лимфоцитам. CD4+ Т-лимфоциты – это главные регуляторные клетки иммунного ответа. От их деятельности зависит как направление разворачивания иммунного ответа, так и его эффективность. Основная роль на ранних этапах противоинфекционной защиты принадлежит NK-клеткам. Особенно, если инфекционный процесс был индуцирован агентами, имеющими внутриклеточную реализацию. Особенно это проявляется когда механизмы специфического иммунного ответа еще не сформировались. Из клеток, называемых естественными киллерами, нами были изучены значения CD16+ Т-лимфоцитов. CD16+ Т-лимфоциты совершают цитотоксическое влияние на инфицированные клетки, не осуществляя специфического иммунного распознавания антигенов мишени. Естественные киллеры распознают скомпрометированные клетки по упрощенной схеме, ключевым моментом в которой является прекращение экспрессии молекул HLA I клеткой-мишенью. Нами было изучено содержание субпопуляций CD4+, CD16+ клеток как в процентом, так и абсолютном значениях. В процессе иммунного ответа, как защитной реакции организма, основная роль принадлежит ГЗТ, но разнообразие клинических проявлений и возможностей реагирования иммунной системы при туберкулезной инфекции, позволяет предполагать и участие реакций немедленного типа. Одним из основных показателей, характеризующих аллергические реакции, является IgE. В нашем исследовании мы изучили этот показатель в группах и его значение при иммунодиагностике туберкулезной инфекции. Антиген-специфическая индукция интерферона - IFN-y, Т-лимфоцитами CD4+ является одним из ключевых факторов иммунной защиты при туберкулезной инфекции. В результате воздействия IFN-y на инфицированные клетки, они становятся более доступными для атаки клетками иммунитета и распознавания клетками киллерами. Кроме того, интерфероны повышают активность CD-16 клеток и этим можно объяснить положительное влияние интерферонов при инфекциях, сопровождающихся внутриклеточным персистированием возбудителя (Игнатов П.Е., 2002). У IFN-y особенно выражены иммунорегуляторные эффекты. Он является одним из основных цитокинов клеточного иммунного ответа и ингибитором гуморального. В работе нами был изучен показатель IFN-y с ФГА, как показатель общего противоинфекционного иммунитета, так и, впервые, мы провели изучение его при воздействии Диаскинтест, причем в качестве антигена использовали препарат Диаскинтест, используемый для постановки кожных проб. На данном этапе нашего исследования было проанализировано состояние системы иммунитета у детей с локальными формами туберкулеза (ЛФТ). Все дети с ЛФТ были впервые выявленные, ранее противотуберкулезное лечение не получали, сопутствующей иммунопатологии не имели. Изучены иммунологические показатели у детей с локальными формами туберкулеза, полученные данные представлены в таблице 26.
Обследованные дети с ЛФТ, по результатам кожных проб характеризовались в 99% случаев положительными туберкулиновыми пробами Манту 2 ТЕ (средний размер папулы составил 13,4 ± 0,9 мм) и в 84% случаев положительными результатами на препарат Диаскинтест (средний размер папулы составил 12,6 ± 0,5 мм). В результате проведенного иммунологического обследования у детей с ЛФТ выявлено, что количество С04+-лимфоцитов составило 31,8%, CD16+ лимфоцитов 17,1%, IgE общий - 95,2 МЕ/мл, уровень IFN-y с ФГА в среднем 545,6пг/мл, уровень IFN-y с ДСТ - 38,8пг/мл, (табл.26).
В результате проведенного сравнительного анализа иммунологических показателей детей с ЛФТ относительно группы контроля было отмечено снижение содержания С04+-лимфоцитов (процентного содержания на 23,37%, абсолютного количества на 28,6%, р 0,05); повышение содержания CD16+ -лимфоцитов (процентного содержания в 1,92 раза, абсолютного количества - на 35,0%, (р 0,05)), повышение IgE общего на 40 МЕ/мл, (табл.27). Выброс IFN-y клетками периферической крови в тест-системе с ФГА достигал меньших значений по сравнению с группой контроля, в среднем, на 400,0 пг/мл. При изучении уровня продукции IFN-y в тест-системе с ДСТ у детей с ЛФТ, нами зарегистрировано повышение, в среднем, по группе до 38,8 пг/мл, по сравнению с нулевым показателем группы контроля. Данный феномен можно считать значимым при проведении сравнительного результата.
