Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 13
1.1. Патогенез апластической анемии. 14
1.2. Клональные осложнения у больных апластической анемией. 17
1.3. ПНГ-клон и синдромы костномозговой недостаточности 19
1.4 Прогностическое значение выявления ПНГ-клона у больных апластической анемией . 25
Глава 2. Материалы и методы 29
2.1. Клиническая характеристика больных. 29
2.2 Дизайн исследования 31
2.3. Протокол иммуносупрессивной терапии . 32
2.4.Оценка гемолиза 33
2.5. Определение ПНГ-клона методом высокочувствительной проточной цитометрии. 33
2.6 Сравнение двух методов иммунофенотипической диагностики ПНГ-клона: стандартного и с использованием анти-CD157. 40
2.7 Статистический анализ данных 44
Глава 3. Результаты исследования 45
3.1. Выявление ПНГ-клона у больных апластической анемией впервые выявленной, его динамика на фоне иммуносупрессивной терапии и значение для ответа на лечение. 45
3.1.1. Выявление ПНГ-клона у первичных больных апластической анемией. 45
3.1.2 Ответ на иммуносупрессивную терапию у больных АА-ПНГ+ и АА ПНГ - 49
3.1.3. Результаты мониторинга ПНГ-клона у больных апластической анемией в процессе иммуносупрессивной терапии 55
3.2 Выявление ПНГ-клона у больных в ремиссии апластической анемии. 60
3.3. Новые возможности диагностики ПНГ-клона 63
Глава 4. Заключение 68
Выводы. 75
Список литературы 77
- ПНГ-клон и синдромы костномозговой недостаточности
- Прогностическое значение выявления ПНГ-клона у больных апластической анемией
- Протокол иммуносупрессивной терапии
- Ответ на иммуносупрессивную терапию у больных АА-ПНГ+ и АА ПНГ
ПНГ-клон и синдромы костномозговой недостаточности
Пароксизмальная ночная гемоглобинурия (ПНГ) - клональное заболевание стволовой клетки крови, характеризующееся клинической триадой – внутрисосудистым гемолизом, склонностью к тромбообразованию и костномозговой недостаточностью[21] [60].
Впервые клинический случай развития пароксизмальной ночной гемоглобинурии детально описал в 1882 г молодой немецкий врач Paul Strbing, в котором он так же предложил механизм развития пароксизмальной ночной гемоглобинурии и возможный метод диагностики[61]. Paul Strbing предположил, что ПНГ-эритроциты разрушаются ночью вследствие аномальной чувствительности к кислой среде, образующейся при накопления диоксида углерода и лактата, как результат снижения скорости кровотока у больных во время сна. В1939г Thomas Hale Ham опубликовал свое оригинальное для того времени наблюдение, как ПНГ-эритроциты подвергают лизису в подкисленной сыворотке с помощью антитело-независимой системы, для которой требуются факторы неотличимые от системы комплемента[62]. Данное открытие легло в основу диагностического теста, провоцирующего лизис эритроцитов больных пароксизмальной ночной гемоглобинурией посредством активации альтернативного пути комплемента в кислой среде под названием теста Хема. Тест Хема вместе с сахарозной пробой Хартмана до середины 1990х годов оставались основой диагностики ПНГ до внедрения принципов проточной цитометрии. В 1966 г Rosse and Dacie продемонстрировали чувтвительность к комплемент-опосредованному лизису не только эритроцитов, но и нейтрофилов и тромбоцитов[63]. Тогда же впервые была высказана теория о развитии ПНГ-дефекта на уровне примитивных предшественников кроветворения[64]. И уже в 1970г Luzzatto и соавт. посредством изотипического контроля глюкозо-6 фосфатдегидрогеназы показали моноклональность чувствительной к комплементу популяции клеток, тогда как нечувствительные клетки были поликлональны[65]. Данное открытие клонального происхождения пароксизмальной ночной гемоглобинурии легло в основу гипотезы Dacie о наличии соматической мутации. В дальнейшем, наряду с открытием клеточной основы развития гемолиза (дефицит гликозилфосфатидилинозитол-связанных белков на поверхности ПНГ-клеток), была выявлена генетическая мутация в СКК, приводящая к нарушению синтеза ГФИ-якоря[66].
Таким образом, ПНГ-клон – это клон стволовой клетки крови с мутацией в PIG-A гене, в результате которой нарушается синтез гликозилинозитолфосфата (ГФИ) - гликолипида, с помощью которого к мембранам клеток крепятся белки ГФИ –комплекса, защищающего мембраны клеток крови от воздействия терминальных компонентов системы комплемента.
Однако, наличие ПНГ-клона не означает диагноз пароксизмальной ночной гемоглобинурии. Пароксизмальная ночная гемоглобинурия, как заболевание, характеризуется не только наличием клона ПНГ, но и четкой клинической картиной.
В настоящее время продолжается поиск причинных связей между развитием и эволюцией ПНГ-клона у больных с костномозговой недостаточностью. Различные исследования свидетельствуют о наличии внутренних факторов эволюции ПНГ-клона[67]. Даже при рассмотрении гипотезы иммунной привилегированности, позволяющей ГФИ-дефицитному клону клеток избежать иммуноопосредованной атаки на костномозговое кроветоврение, не получен ответ о причинах эволюционного течения ПНГ клона с развитием гемолитической формы пароксизмальной ночной гемоглобинурии[54]. Так, увеличение размера ПНГ-клона продолжается у некоторых больных апластической анемией на фоне проведения иммуносупрессивной терапии и после достижения ремиссии, а у больных с гемолитической формой пароксизмальной ночной гемоглобинурии клиническая манифестация не всегда сочетается с клиническими проявлениями костномозговой недостаточности[68]. Более того, у здоровых людей могут определяться небольшие популяции PIG-A мутантных клеток, что говорит о наличии дополнительных внутренних факторов, способствующих экспансии ГФИ-дефектного клона[69]. В различных исследованиях было показано сочетание ПНГ-клона с редкими хромосомными аномалиями или наличием соматических мутаций NRAS и JAK2[52][70]. Наибольший интерес представляют данные, полученные Shen W. с соавт., рассматривающих идею наличия внутреннего преимущества роста у клона клеток пароксизмальной ночной гемоглобинурии[71]. После предварительного разделения гемопоэтических клеток-предшественниц на клетки с ПНГ-фенотипом и «нормальным» фенотипом, проведено полногеномное секвенирование ДНК, полученной из клеток костного мозга 12 больных ПНГ и секвенирование по методу Сенгера с подбором праймеров для 61 гена, мутации которых специфичны для злокачественных миелоидных заболеваний. Обнаружено большое количество мутаций совместно с мутациями PIG-A, ранее не ассоциировавшихся с пароксизмальной ночной гемоглобинурии. Более того, данные дополнительные мутации возникают либо как суб-клон в пределах PIG-A мутантной клеточной популяции, или в качестве инициального генетического случая до приобретения мутации PIG-A. У 83% (10 из 12) больных пароксизмальной ночной гемоглобинурией выявлены дополнительные соматические мутации, такие как TET2, MAGEC1, BRPF1, KDM3B, STAC3. Стоит отметить, что данные мутации выявлены во фракции ПНГ, а не в фенотипически нормальных клетках. Все дополнительные мутации геторозиготны без потери гетерозиготности в пострадавших локусах. Наличие дополнительной соматической мутации в ПНГ-клетках, по мнению авторов, наиболее вероятно является причиной внутреннего ростового преимущества для экспансии ПНГ-клона. Однако, наличие внутреннего преимущества не исключает значимости механизмов избегания иммунной атаки.
Прогностическое значение выявления ПНГ-клона у больных апластической анемией
В исследование включены 35 больных (22 женщины и 13 мужчин) в возрасте от 15 до 66 лет: 32 больных АА, 2 – ПНГ, 1 – МДС, которым проводили обследование в ФГБУ Гематологическом научном центре (ГНЦ) Минздрава России (Москва). У всех пациентов ранее был выявлен ПНГ-клон стандартным методом проточной цитометрии. В контрольную группу вошло 5 доноров в возрасте от 23 до 40 лет и 7 больных АА без ПНГ-клона в возрасте от 19 до 29 лет. Таблица 4
Проведено сравнение стандартного 4-цветного метода для определения размера ПНГ-клона среди моноцитов (реагенты FLAER, CD14, CD64, CD45) и гранулоцитов (реагенты FLAER, CD24, CD15, CD45) с 5-цветным методом, при котором использовали антитела против ГФИ-белка CD157 с целью детекции обеих популяций клеток в одной пробирке (FLAER, CD157, CD15, CD64, CD45) (таблица 4).
Для выявления ПНГ-эритроцитов цельную кровь предварительно разбавляли Cellwash (BD) в 100 раз, затем отбирали 50 мкл и добавляли моноклональные анти-CD235 и анти-CD59-антитела в объеме согласно указаниям производителя, инкубировали 20 мин при комнатной температуре в темноте с последующей двойной отмывкой Cellwash (BD) при 1000 об/мин в течение 5 мин.
Для определения ПНГ-клона среди лейкоцитов цельную кровь предварительно лизировали OptiLyse (BD) согласно инструкции производителя, затем осаждали при 1000 об/мин в течение 5 мин. Осадок встряхивали и затем клетки разносили по трем цитометрическим пробиркам: в одну добавляли комбинацию линейно-специфичных антител, FLAER и CD157, в две другие добавляли также комбинацию линейно-специфичных антител, FLAER и ГФИ-связывающие антитела для моноцитов и гранулоцитов (таблица 3). Антитела добавляли в объеме согласно инструкции производителя, инкубировали в течение 20 мин в темноте при комнатной температуре, затем отмывали Cellwash (BD) при 1000 об/мин 5 мин.
Полученные образцы анализировали на проточном цитометре FACS Canto II (BD, CША). Выделение гранулоцитарного гейта проводили по параметрам каналов светорассеяния и показателям экспрессии СD45, СD15 и бокового светорассеяния. Анализ экспрессии FlAER и CD24, FlAER и CD157 проводили с помощью точечных графиков. Моноциты выделяли также по параметрам каналов светорассеяния и показателям экспрессии СD45 и СD64 и бокового светорассеяния. Определение экспрессии FlAER и CD14, FlAER и CD157 на моноцитах проводили с помощью точечных графиков. ПНГ-гранулоциты/ПНГ-моноциты находились в левом нижнем квадранте точечных графиков, нормальные гранулоциты/моноциты – в правом верхнем. Получено хорошее разделение популяции ПНГ-клеток и нормальных гранулоцитов и моноцитов (рисунок 9) и сопоставимые значения ПНГ-клона при использовании разных методик как среди гранулоцитов (А, В: 45,6% против 46,7%), так и среди моноцитов (Б, Г: 55,5% против 54,27%).
Примеры точечных графиков выявления ПНГ-гранулоцитов и ПНГ-моноцитов стандартным методом иммунофенотипирования и с использованием CD157. Сравнение стандартного 4-цветного метода (а, б) выявления ПНГ-клона с использованием CD24 для гранулоцитов и CD14 для моноцитов и метода с использованием 5-цветного набора реагентов с CD157 (в, г). Корреляцию между методами рассчитывали с помощью линейного регрессионного анализа с использованием метода наименьших квадратов. Однако сильная корреляция двух величин еще не означает их совпадение, сходство между ними. Учитывая данный факт, сравнение результатов, полученных двумя методами проводили с помощью линейного регрессионного анализа. Систематическую ошибку (bias) рассчитывали как среднее различий между двумя методами в определении показателя ПНГ-клона среди гранулоцитов и моноцитов отдельно. Пределы соглашения (Limits of agreement – LOА) между двумя методами для 95% доверительного интервала рассчитывали как bias ± 2 стандартных отклонения. Сравнение систематической ошибки и LOА проводили с помощью метода Бленда – Альтмана [52], процентная ошибка определялась как отношение 2х стандартных отклонений парных различий к среднему значению ПНГ-клона, определенному стандартным 4х цветным методом. В соответствии с критериями L. Сritchley и J. Сritchley [53], процентная ошибка менее 30% свидетельствует о допустимых различиях между методами.
Статистический анализ данных проводился с использованием метода описательной статистики и статистического пакета Statview. Для оценки достоверности различий в двух независимых выборках использовался t-критерий Стьюдента и метод Хи -квадрат. С целью определения значимости факторов использовался подсчет отношения шансов.
Протокол иммуносупрессивной терапии
При оценке глубины достижения ремиссии и объема иммуносупрессивной терапии, потребовавшейся для достижения ремиссии, получены следующие данные (таблица 15) Большинство больных (59%) в полной ремиссии апластической анемии были с ПНГ-клоном, медиана размера которого менее 1% (медиана ПНГ-клона по гранулоцитам – 0,44 (0,02-98,6)%).
В группе больных с частичной ремиссией апластической анемии ПНГ-клон выявлен в достоверно большем проценте случаев (р=0,030), что составило 14 (67%) из 21 больных. Размер клона в данной группе был несколько выше (медиана ПНГ-клона по гранулоцитам – 3,15(0,3-98,8)%). 5 из 6 больных с ПНГ-синдромом так же были в частичной ремиссии АА. Значительно меньше ПНГ+ больных в группе со стабилизацией показателей гемограммы (гематологическим улучшением), что составило всего 3(43%) из 7 больных.
Минимальный объем иммуносупрессивной терапии, необходимый для достижения ремиссии, потребовался больным из группы ПНГ+ (таблица 15)
Частота выявления ПНГ-клона среди больных в ремиссии апластической анемии (58%) сопоставима с частотой выявления у первичных больных (66%), однако медиана размера ПНГ-клона по гранулоцитам в данной группе больных меньше (0,9(0,02-98,8)% против 2,5(0,001-99,5)% соответственно. Большинство больных, которым потребовался минимальный объем ИСТ для достижения ответа были с ПНГ-клоном: 69% против 31% соответственно (таблица 15).
Белок CD157 является ГФИ-связанным и экспрессируется как на моноцитах, так и гранулоцитах, что теоретически позволяет использовать его вместо предложенных в руководстве CD24/CD14. Практическое применение метода с использованием CD157 и FLAER [] показало более четкое разделение гранулоцитов и моноцитов на тип II (частичное отсутствие экспрессии ГФИ-белков) и тип III (полное отсутствие экспрессии ГФИ-белков). Однако в настоящее время клиническое значение выявления лейкоцитов II типа неизвестно, но их важно включать для оценки размера ПНГ-клона.
В данной части работы мы провели сравнительное исследование результатов тестирования стандартным 4-цветным методом и методом с использованием антител к ГФИ-белку CD157, что позволило создать 5-цветный набор реагентов для определения ПНГ-клона на моноцитах и гранулоцитах в одной пробирке и таким образом уменьшить трудоемкость метода диагностики ПНГ-клона и снизить расход моноклональных антител.
При проведении исследования клона ПНГ-клеток среди лейкоцитов была выявлена высокая корреляция между результатами, полученными двумя методами. Оба метода показали высокую чувствительность определения размера ПНГ-клона в пределах от 0 до 99,3% (min--max). Коэффициент корреляции составил для гранулоцитов R2 = 0,9956 и для моноцитов R2 = 0,9992 (рисунок 14).
Методом Бленда-Альтмана установлено, что при измерении гранулоцитарного ПНГ-клона (рисунок 15А), систематическая ошибка составила -0,27%, LOА – от -5,160 до 4,618%, процентная ошибка – 22,9%.
Для моноцитарного ПНГ-клона (рисунок 15Б) систематическая ошибка составила -0,03%, LOА – от -2,11 до 2,17%, процентная ошибка – 9,1%. Таким образом, процентная ошибка между стандартным методом определения ПНГ-клона и методом с использованием CD157 для определения ПНГ-клона среди гранулоцитов и моноцитов была менее 30% (22,9% и 9,1% соответственно), что свидетельствует о допустимых различиях между методами. А. Б.
Сравнение ПНГ-клона среди гранулоцитов (А) и моноцитов (Б), определенного стандартным 4х цветным методом и с применением СD157 методом Бленда-Альтмана.
С целью сравнения двух методов больные были распределены в зависимости от размера ПНГ-клона по гранулоцитам, определенным стандартным методом, на группы: от 0 до 1%, 1--10% и 10--100%. Результаты представлены в табл. 2, из которой видно, что при измерении стандартным методом при размере клона менее 1% гранулоцитарный клон был почти в 2 раза меньше моноцитарного. Однако различие это статистически незначимо (р = 0,14), вероятно, вследствие небольшого количества наблюдений. С антителами к CD157 эти различия исчезают (таблица 16). У больных со значением ПНГ-клона от 1 до 10% размер ПНГ-клона, определенного 5-цветным методом, среди гранулоцитов был несколько меньше, чем среди моноцитов, и эти различия были одинаковы при использовании обеих методов. В группе с ПНГ-клоном больше 10% также не было различий в размерах ПНГ-клона между гранулоцитами и моноцитами, как при измерении классическим методом, так и с антителами к CD157.
Результаты определения ПНГ-клона в контрольной группе показали идентичность двух методов и не привели к ложноположительным результатам по выявлению ПНГ-клона как среди доноров, так и среди больных АА без ПНГ-клона.
Результаты выявления ПНГ-клона, полученные при применении нового метода с использованием моноклональных антител к CD157, сопоставимы с результатами стандартного метода. Однако применение антител к CD157 имеет важное техническое преимущество: определение размера ПНГ-клона среди гранулоцитов и моноцитов происходит в одной пробирке с использованием 5-цветной комбинации, что значительно уменьшает время выполнения исследования и расход антител, в отличие от стандартной методики с использованием 2 пробирок и 4-цветной комбинации. Анализ полученных данных позволяет рекомендовать метод с антителами CD157 для выявления и мониторинга минорного ПНГ-клона (менее 1%) у больных АА и МДС.
Ответ на иммуносупрессивную терапию у больных АА-ПНГ+ и АА ПНГ
Эффективность ИСТ проанализирована у 58 больных АА ПНГ+ и АА ПНГ- . Медиана наблюдения за больными составила 26,5 месяцев. ПНГ-клон на моменд лиагностики АА был выявлен у 62% больных, у 38% больных ПНГ-клон отсутствовал. При оценке необходимого для достижения первичного ответа (КГУ) объема ИСТ было установлено, что большинству больных АА ПНГ+ потребовался минимальный объем ИСТ, т.е. проведение 1го курса АТГ (76% больных АА ПНГ+ против 50% больных АА ПНГ-). Кумулятивная частота достижения ответа достоверно выше среди больных АА ПНГ+. Большинство больных АА ПНГ+ (65%) достигали КГУ уже к 6му месяцу терапии, в то время, как лишь у 44% больных АА ПНГ- к этому сроку диагностировался первичный ответ на лечение. При этом, развитие полной ремиссии после первого курса АТГ достоверно чаще определялось в группе АА ПНГ+ (47% против 17% соответственно). Таким образом, наличие ПНГ-клона у больных АА при первоначальном исследовании, до проведения ИСТ можно расценивать как фактор благоприятного прогноза эффективности ИСТ, фактор более раннего и более полного ответа на проводимое лечение.
В процессе проведения ИСТ и после у 47 первичных больных АА, среди которых ПНГ-клон выявлен у 28, прослежена динамика ПНГ-клона. В зависимости от первоначального размера ПНГ-клона по гранулоцитам больные разделены на 4 группы: 1 группа - от 0,01 до 0,99% - 11 больных (39%); 2 группа- от 1 до 9,99% - 8 больных (29%); 3 группа - от 10 до 49,9% -4 больных (14%); 4 группа - от 50 и более – 5 больных (18%).
Определение ПНГ клона в динамике проводили: до начала лечения (1 точка), через 3 месяца (2 точка), через 6 месяцев (3 точка), через 12 месяцев (4 точка), через 18 месяцев (5 точка) и через 24 месяца (6 точка) от начала ИСТ.
Следует отметить, что размер ПНГ-клона у большинства больных не превышал 10%: эти больные (n=19) входили в 1ю и 2ю группы.
В процессе наблюдения выявлена разнонаправленная динамика ПНГ клона. Во-первых, было отмечено у 3 из 11 больных 1й группы увеличение медианы ПНГ-клона с минорных значений (менее 1%) до 3,55%. Но при этом, у 1 больного к 12 месяцу наблюдения произошла полная элиминация ПНГ-клона. Во-вторых, заметная однонаправленная динамика была выявлена среди больных 3 группы уже к 3му месяцу наблюдения одновременно со становлением ремиссии: медиана с 22,9% (18,39-24,77%) до 5,6% (1,5-6,7%) уже к 3 месяцу наблюдения одновременно со становлением ремиссии. В дальнейшем его размер ПНГ-клона среди больных 1-3 групп оставался без значительных изменений. Большинство больных данных групп достигли хорошего ответа на ИСТ в кратчайшие сроки.
При динамическом исследовании ПНГ-клона у больных АА, у которых ПНГ-клон первоначально не был выявлен, обнаружены следующие результаты: у 7(37%) из 19 отмечалось появление и персистенция ПНГ-клона в процессе наблюдения. Медиана ПНГ-клона у данной группы больных составила 0,34 (0,1-6,2)% Динамическое изменение размеров ПНГ-клона, по результатам настоящего исследования, как в сторону уменьшения, так и увеличения и появления, происходит при ответе на ИСТ, в процессе становления ремиссии, и вероятнее всего зависит от преимущества к росту нормального (ГФИ-позитивного) или клонального (ГФИ-негативного) кроветворения. При динамическом исследовании ПНГ-клона у больных апластической анемией в процессе и после иммуносуперссивной терапии отмечалась разнонаправленная динамика. Однако, анализ данных, полученных в течение периода наблюдения, показал увеличение числа больных апластической анемией с ПНГ-клоном менее 10% (68% больных до лечения и 82% – после), с одновременным уменьшением числа больных с минорным ПНГ-клоном. В экспериментах in vitro был выявлен сниженный ответ на цитотоксическое воздействие у ГФИ-негативных клеток[15]. Возможно, развитие ГФИ-негативного кроветворения (ПНГ-клона) является «шунтовым» механизмом в условиях аутоагрессии, и его пролиферация, будучи обусловленная внешним преимуществом, позволяет приспособиться к создавшимся условиям. Мы видим значительные изменения в размере ПНГ-клона при ответе на ИСТ, т.е. восстановление «нормального» кроветворения при блокировании аутоагрессии, и в то же время, среди больных с ПНГ-клоном более 50% ответ на лечение достигается при более интенсивном воздействии и за больший промежуток времени. В то же время, ГФИ-дефектные клетки появляются в периферической крови больных АА без первоначально выявленного ПНГ-клона при ответе на лечение. Количество их не столь велико, и стоит отметить, что данные больные ответили на минимальный объем ИСТ. Создается впечатление о необходимости более детальной оценки костномозгового кроветворения и поиска оптимальных лабораторных подходов..
Результаты выявления ПНГ-клона, полученные при применении нового метода с использованием моноклональных антител к CD157, сопоставимы с результатами стандартного метода. Однако применение антител к CD157 имеет важное техническое преимущество: определение размера ПНГ-клона среди гранулоцитов и моноцитов происходит в одной пробирке с использованием 5-цветной комбинации, что значительно уменьшает время выполнения исследования и расход антител, в отличие от стандартной методики с использованием 2 пробирок и 4-цветной комбинации. Анализ полученных данных позволяет рекомендовать метод с антителами CD157 для выявления и мониторинга минорного ПНГ-клона (менее 1%) у больных АА и МДС.