Электронная библиотека диссертаций и авторефератов России
dslib.net
Библиотека диссертаций
Навигация
Каталог диссертаций России
Англоязычные диссертации
Диссертации бесплатно
Предстоящие защиты
Рецензии на автореферат
Отчисления авторам
Мой кабинет
Заказы: забрать, оплатить
Мой личный счет
Мой профиль
Мой авторский профиль
Подписки на рассылки



расширенный поиск

Исследование экспрессии гранзима В в CD4+ лимфоцитах и Т-регуляторных клетках у пациентов после трансплантации аллогенного костного мозга Дроков Михаил Юрьевич

Исследование экспрессии гранзима В в CD4+ лимфоцитах и Т-регуляторных клетках у пациентов после трансплантации аллогенного костного мозга
<
Исследование экспрессии гранзима В в CD4+ лимфоцитах и Т-регуляторных клетках у пациентов после трансплантации аллогенного костного мозга Исследование экспрессии гранзима В в CD4+ лимфоцитах и Т-регуляторных клетках у пациентов после трансплантации аллогенного костного мозга Исследование экспрессии гранзима В в CD4+ лимфоцитах и Т-регуляторных клетках у пациентов после трансплантации аллогенного костного мозга Исследование экспрессии гранзима В в CD4+ лимфоцитах и Т-регуляторных клетках у пациентов после трансплантации аллогенного костного мозга Исследование экспрессии гранзима В в CD4+ лимфоцитах и Т-регуляторных клетках у пациентов после трансплантации аллогенного костного мозга Исследование экспрессии гранзима В в CD4+ лимфоцитах и Т-регуляторных клетках у пациентов после трансплантации аллогенного костного мозга Исследование экспрессии гранзима В в CD4+ лимфоцитах и Т-регуляторных клетках у пациентов после трансплантации аллогенного костного мозга Исследование экспрессии гранзима В в CD4+ лимфоцитах и Т-регуляторных клетках у пациентов после трансплантации аллогенного костного мозга Исследование экспрессии гранзима В в CD4+ лимфоцитах и Т-регуляторных клетках у пациентов после трансплантации аллогенного костного мозга Исследование экспрессии гранзима В в CD4+ лимфоцитах и Т-регуляторных клетках у пациентов после трансплантации аллогенного костного мозга Исследование экспрессии гранзима В в CD4+ лимфоцитах и Т-регуляторных клетках у пациентов после трансплантации аллогенного костного мозга Исследование экспрессии гранзима В в CD4+ лимфоцитах и Т-регуляторных клетках у пациентов после трансплантации аллогенного костного мозга Исследование экспрессии гранзима В в CD4+ лимфоцитах и Т-регуляторных клетках у пациентов после трансплантации аллогенного костного мозга Исследование экспрессии гранзима В в CD4+ лимфоцитах и Т-регуляторных клетках у пациентов после трансплантации аллогенного костного мозга Исследование экспрессии гранзима В в CD4+ лимфоцитах и Т-регуляторных клетках у пациентов после трансплантации аллогенного костного мозга
>

Диссертация - 480 руб., доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Автореферат - бесплатно, доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Дроков Михаил Юрьевич. Исследование экспрессии гранзима В в CD4+ лимфоцитах и Т-регуляторных клетках у пациентов после трансплантации аллогенного костного мозга: диссертация ... кандидата медицинских наук: 14.01.21 / Дроков Михаил Юрьевич;[Место защиты: Федеральное государственное бюджетное учреждение "Гематологический научный центр" Минздрава России].- Москва, 2014.- 126 с.

Содержание к диссертации

Введение

Глава 1: Обзор литературы 12

1. Реконституция Т-клеточного звена как ключевой фактор у пациентов с гемобластозами после трансплантации аллогенного костного мозга 12

1.2 История вопроса 12

1.3 Иммунофенотипические характеристики Т клеточного звена иммунной системы 14

1.4 Реконституция Т клеточного звена иммунной системы 16

1.5 Реконституция CD8+ субпопуляций Т-лимфоцитов 21

1.6 Реконституция CD4+ субпопуляции Т-лимфоцитов 22

1.7 Реконституция Т-регуляторных клеток 23

1.8 Реконституция НК-клеток 24

1.9 Реконституция Т-клеточного звена при трансплантации от родственного донора 1.10 Реконституция Т-клеточного звена при трансплантации от неродственного донора 26

1.11 Реконституция Т-клеточного звена при трансплантации костного мозга после Т-клеточной деплеции з

1.12 Реконституция Т-клеточного звена при трансплантации пуповинной крови 28

1.13 Толерантность при трансплантации аллогенного костного мозга и стволовых клеток крови 29

1.14 Реакция трансплантат против хозяина 32

1.15 Реакция трансплантат против лейкоза 33

1.16 Реконституция Т-клеточного звена и влияния трансфузии лимфоцитов донора на нее 33

1.17 Влияние кондиционирования и иммуносупрессивных агентов на реконституцию Т-клеточного звена 34

1.18 Подходы к ускорению Т-клеточной реконституции 36

1.19 ГранзимВ 38

Глава 2. Материалы и методы 41

2.1. Клиническая характеристика больных 41

2.2. Схемы предтрансплантационного кондиционирования, используемые у больных, включенных в исследование 42

2.3 Схемы профилактики острой реакции трансплантат против хозяина

(препараты, дозы, дни введения) 44

2.4. Объем исследования и временной регламент 44

2.5 Проточная цитометрия 46

2.5.1 Пробоподготовка при определении уровня экспрессии внутриклеточного гранзима В и FoxP3 в различных субпопуляциях лимфоцитов 47

2.5.2 Определение доли и экспрессии внутриклеточного гранзима В в различных субпопуляциях лимфоцитов 50

2.5.3 Пробоподготовка при определении различных субпопуляций Т лимфоцитов с использованием метода «лизис без отмывки» 52

2.6 Статистический анализ данных 54

Глава 3. Результаты исследования и обсуждение 55

3.1 Клинические результаты 55

3.2 Особенности оценки экспрессии гранзима В и его доли в популяции CD4+ лимфоцитов, а также субпопуляции Т-регуляторных CD4+CD25 lg клеток 61

3.3 Характеристика интенсивности экспрессии гранзима В и его доли в CD4+ и CD4+CD25 lg клетках периферической крови у больных до проведения трансплантации костного мозга и в контрольной группе здоровых доноров 63

3.4 Характеристика интенсивности экспрессии гранзима В и его доли в CD4+ и CD4+CD25 lg субпопуляциях лимфоцитов периферической крови у больных в зависимости от диагноза до проведения трансплантации костного мозга 66

3.5 Изменение характеристики интенсивности экспрессии гранзима В и его доли в CD4+ и CD4+CD25hlgh клетках в популяциях периферической крови при реконституции донорской иммунной системы у больных с различными нозологиями после трансплантации аллогенного костного мозга 69

3.6 Изменение характеристики интенсивности экспрессии гранзима В и его доли в CD4+ и CD4+CD25hlgh клетках периферической крови у больных после трансплантации аллогенного костного мозга от родственного и неродственного донора 73

3.7 Изменение характеристики интенсивности экспрессии гранзима В и его доли в CD4+ и CD4+CD25hlgh клетках периферической крови у больных после трансплантации аллогенного костного мозга с кондиционированием в миелоаблативном режиме и режиме пониженной интенсивности 77

3.8 Изменение характеристики интенсивности экспрессии гранзима В и его доли в CD4+ и CD4+CD25hlgh клетках периферической крови у больных после трансплантации аллогенного костного мозга с использованием циклофосфамида в качестве индуктора толерантности 81

3.9 Характеристика интенсивности экспрессии гранзима В и его доли в CD4+ и CD4+CD25hlgh клетках периферической крови у больных, у которых диагностирована острой реакции трансплантат против хозяина 82

3.10 Характеристика интенсивности экспрессии гранзима В и его доли в CD4+ и CD4+CD25 lg клетках периферической крови у больных после трансплантации аллогенного костного мозга с цитомегаловирусной инфекцией и без нее 89

3.11 Результаты исследования субпопуляций Т лимфоцитов у пациентов после трансплантации аллогенного костного мозга и введении мезенхимальных стромальных клеток в качестве профилактики острой реакции трансплантат против хозяина 90

3.12 Коэффициент соотношения CD4\CD8 клеток у пациентов после трансплантации аллогенного костного мозга до введения мезенхимальных стромальных клеток и в контрольной группе здоровых доноров 95

Глава 4. Заключение 96

Выводы: 100

Список литературы

Иммунофенотипические характеристики Т клеточного звена иммунной системы

Т-клеточное звено иммунной системы в настоящее время представляет объект динамично развивающейся области исследования. Среди методов, используемых для характеристики гетерогенной популяции лимфоцитов, используют многоцветную проточную цитометрию, которая по данным литературы и таких баз данных как PubMed в настоящее время преобладает как метод оценки данной популяции клеток. Кроме того, сложность структуры CD3+ популяции Т-лимфоцитов , как в функциональном, так и в фенотипическом плане - делает многоцветную проточную цитометрию, начиная с 1980 года, необходимым и эффективным инструментом для исследователей. В настоящее время Т-клетки могут быть разделены на три основные группы в зависимости от их функциональных и фенотипических характеристик. Цитотоксические Т-клетки, Т-хелперы (Th), Т-регуляторные клетки (Трег). Именно различия в экспрессии маркеров кластеров дифференцировки на поверхности клеточной мембраны, а также различия в секреции цитокинов позволяют разделить эти популяции. Например, CD8+ цитотоксические Т-клетки уничтожают инфицированные клетки-мишени с помощью перфорин-гранзимного механизма. Тогда как CD4+ - Т-хелперы (т. е. Thl, Th2, Th9, ТЫ7, и TFH клетки) обладают маленькой цитотоксической активностью и в основном секретируют цитокины, которые действуют на другие клетки, такие как В-клетки, макрофаги, эозинофилы, нейтрофилы с целью элиминации патогена. Что касается Т-регуляторных клеток, их функция заключается в подавлении Т-клеточного ответа с помощью нескольких механизмов. Т-регуляторные клетки играют важную роль в поддержании иммунного гомеостаза [105], также их роль выявлена при многих аутоиммунных заболеваниях [105]. Например при IPEX синдроме, когда утрачивается функция Т- регуляторных клеток, возникают аутоиммунные поражения как кожных покровов, так и эндокринных желез [105]. Для определения Т-регуляторных клеток проточная цитометрия не заменима. Выделяют два основных класса CD4+ Т-регуляторных клеток (Трег): «натуральные» Трег (пТрег), которые иммунофенотипически характеризуются экспрессией CD25 на поверхности и внутриклеточной экспрессией FoxP3. Вторая субпопуляция - это индуцированные Т-регуляторные клетки (іТрег), в которых CD25 и FoxP3 появляются вследствие цитокиновой активации, а не в процессе созревания [105]. Эта субпопуляция Т-регуляторных клеток берет свое начало из тимуса, родоначальником ее выступают CD4+ клетки [105]. Они дифференцируются в CD25+/FoxP3+ под действием адекватной антигенной стимуляции и цитокинов, таких как TGF-P, ИЛ -10, и ИЛ-2 [105]. Также для данной популяции характерна так называемая пластичность - т.е. способность клеток к трансдифференцировке в ТЫ и ТЫ 7 клетки. Что касается иммунофенотипического маркера окончательно идентифицирующего и определяющего Т-регуляторные клетки, то им является FoxP3. Однако в литературе, в частности Hansen et. al. [28] приводятся данные о небольших популяциях FoxP3 негативных Т-регуляторных клеток. Выявление FoxP3 в качестве маркера для Трег позволило выявить дополнительные маркеры, в том числе CD127, экспрессия которого на поверхности обратно пропорциональна внутриклеточной экспрессии FoxP3 [44]

Помимо основных популяций использование антител к таким антигенам как CCR7, CD62L и/или CD69 могут дать важную информацию о потенциале клеток к заселению ниш и об их локализации в организме [76]. В настоящее время появляется также много работ о Т клетках памяти. Центральные клетки памяти (Тст) и эффекторные клетки памяти (Теш) первоначально были выявлены на основании наличия или отсутствия непосредственно эффекторных функций, а также экспрессии рецепторов, которые позволяют клеткам мигрировать во вторичные лимфоидные органы, такие как лимфатические узлы и другие [81]. Так Тст постоянно экспрессируют на своей поверхности CCR7 и CD62L - рецепторы, которые необходимы для прохождения клеток через вены с высоким эндотелием, которые располагаются в лимфатических узлах. Эффекторные Т клетки памяти не экспрессируют CCR7, являются гетерогенными по экспрессии CD62L, а также имеют в своей цитоплазме большое количество перфорина, что и обеспечивает им более высокую цитотоксическую активность и функцию близкую к той, которую выполняют CD8+ клетки.

У всех пациентов с гемобластозами после трансплантации костного мозга или гемопоэтических клеток крови развивается глубокий иммунодефицит в том числе и клеточный, это происходит как вследствие кондиционирования, наличия донорских Т лимфоцитов, инфузированных вместе с костномозговой или лейковзвесью, и неспособных выполнять свою функцию полноценно, а также использования иммуносупрессивных препаратов, направленных на предотвращение развития РТПХ.

Восстановление компетентной иммунной системы после трансфузии клеточной взвеси является неотъемлемой частью успешной трансплантации аллогенного костного мозга. Без восстановления Т клеточного звена иммунной системы, реципиент подвержен высокому риску развития оппортунистических инфекций (вирусов, бактерий, грибов и простейших), рецидиву опухоли. В основном компетенция иммунной системы опосредуется через Т-лимфоциты, В-лимфоциты и натуральные киллеры (НК). Несмотря на это разнообразие, именно антиген-специфичные Т-лимфоциты играют центральную роль в человеческом клеточном иммунитете, а именно в контроле ДНК- и РНК-вирусных инфекций, содействуют выработке специфических антител к бактериальным патогенам (в сочетании с В-клетками), контроле грибковых инфекций [29] Таким образом, именно развитие нормально функционирующих антиген-специфичных Т-лимфоцитов является необходимостью для реконституции компетентной иммунной системы у пациентов после трансплантации аллогенного костного мозга.

Схемы предтрансплантационного кондиционирования, используемые у больных, включенных в исследование

Для определения экспрессии внутриклеточного гранзима В в различных субпопуляциях лимфоцитов у исследуемых больных применяли метод проточной цитометрии. Исследование выполняли в лаборатории иммунофенотипирования костного мозга ФГБУ ГНЦ МЗ России (зав. лаборатории к.м.н. Гальцева И.В.) на проточном цитометре FACS Canto II, Beckton Dikinson. Материалом для иммунофенотипического исследования служили образцы ПК больных, взятые до алло-ТКМ и в различные контрольные сроки после нее, а также в момент развития оРТПХ и начала иммуносупрессивной терапии.

Для определения экспрессии исследуемых белков применяли панель моноклональных антител (мкАТ), конъюгированных одним из 6 флюорохромов: FITC, с max эмиссией при Х=525 нм, фикоэритрин (РЕ), с max эмиссией при Х=575 нм, РегСР, с max эмиссией при Х=660 нм РЕ-Су7, с max эмиссией при Х=750 нм, АРС-Су7, с max эмиссией при Х=785 нм, РегСР-Су5.5, с max эмиссией при Х=695 нм. Характеристика мкАТ подробно представлена в таблице 4.

Пробоподготовка для исследования крови с использованием внутриклеточного окрашивания (исследование гранзима В в первой части работы) и исследования только поверхностных антигенов (исследование динамики субпопуляций Т-регуляторных клеток, а также других субпопуляций Т лимфоцитов , которое проводилось во второй части работы) различалась.

В первой части работы, учитывался тот факт, что пациенты в ранние сроки после трансплантации находятся в цитопении, в том числе и лимфопении, а также тот факт, что для статистической достоверности качественной оценки субпопуляции Т лимфоцитов (определения содержания гранзима В) требуется просчет достаточно большого числа событий. Перед проведением окраски мкАТ, после забора венозной крови в транспортную пробирку с ЭДТА (для предотвращения свертывания) в объеме 5 мл, из данного объема крови методом разделения клеток в градиенте плотности, согласно протоколу Miltenyi Biotec выделяли фракцию мононуклеарных клеток. Для этого объем крови доводили до 10 мл при помощи изотонического солевого фосфатного буфера (PBS, Sigma Aldrich). Далее в пробирку объемом 15 мл и содержащую 4 мл раствора фиколла (плотностью 1,077 г/смЗ), постепенно наслаивали разведенную суспензию клеток. После чего центрифугировали в течение 35 минут при 400g при комнатной температуре. Полученное мононуклеарное кольцо, содержащее фракцию мононуклеарных клеток, осторожно переносили в чистую 15 мл пробирку и доводили объем с помощью PBS до 10 мл. Клетки перемешивали и затем центрифугировали в течение 30 минут при 300g. Надосадочную жидкость удаляли. Клетки ресуспендировали в 600 мкл PBS. Далее проводили окраску клеточной суспензии с помощью мкАТ по стандартному протоколу фирмы BD, поставляемому с раствором для внутриклеточного окрашивания (Cytofix/Cytoperm, BD, USA). Учитывая выделение клеток на градиенте плотности дополнительный лизис эритроцитов не проводили.

Для определения экспрессии поверхностных антигенов (CD4, CD25) по 150 мкл клеточной взвеси распределяли в пробирки (соответственно количеству комбинаций антител), далее добавляли в требуемом объеме мкАТ. Также с целью определения ауто флюоресценции в каждое исследование включали неокрашенный контроль, который проходил все этапы пробоподготовки. Учитывая крайне малое число Fc рецепторов на поверхности лимфоцитов, а также использование градиента плотности и растворов содержащих бычий сывороточный альбумин изотипический контроль для определения неспецифичного связывания антител не ставился.

Далее при +4С в темноте происходила инкубация в течение 25 минут. Спустя 25 минут после инкубации клеточная взвесь дважды отмывалась: к клеточной взвеси добавлялся PBS в объеме 1 мл. Взвесь ресуспендировалась и осаждалась центрифугированием в течение 3,5 минут при 450g. Супернатант удалялся.

После этого для окрашивания внутриклеточных антигенов (Granzyme В) к окрашенным поверхностными мкАТ клеткам добавляли 250 мкл раствора Cytofix/Cytoperm (Beckton Dikinson) и инкубировали в течение 20 минут при температуре +4С. После этого пробы дважды отмывали раствором Perm/wash (BECKTON DIKINSON): к клеточной взвеси был добавлен Perm/wash (Beckton Dikinson) в объеме 1 мл. Взвесь ресуспендировали, осаждали центрифугированием в течение 3,5 минут при 450g. Супернатант удаляли.

Далее в пробирки добавляли мкАТ к внутриклеточным белкам Granzyme В. После инкубации при +4 С в течение 35 минут, пробы дважды отмывали раствором Perm/wash (Beckton Dikinson): к клеточной взвеси добавлляли Perm/wash (Beckton Dikinson) в объеме 1 мл. Взвесь ресуспендировали и осаждали центрифугированием в течение 3,5 минут при 450g. Супернатант удалляли. Далее клетки анализировали на проточном цитометре.

Методика определения популяций CD4+ лимфоцитов отображена на рисунке 1. Для определения фракции CD4+ в пуле мононуклеарных клеток ПК использовались мкАТ для поверхностного антигена CD4. Для определения фракции CD4+/CD25 lg в пуле мононуклеарных клеток ПК использовались мкАТ для поверхностных антигенов CD4 и CD25. Также в качестве внутреннего негативного контроля выступала CD4" популяция (рисунок 2А). Она была использована с целью отделить CD25 lg популяцию CD4+ клеток. Стратегия гейтирования была описана ранее Clark и соавт [15] и была следующей: сначала фракцию CD4+ клеток выделяли на точечной диаграмме SSC/CD4-APC, затем выставляли гейт на точечной диаграмме FSC/SSC для исключения клеточного дебриса и более четкой характеристики CD4+ - лимфоцитов. 2.5.2 Определение доли и экспрессии внутриклеточного гранзима В в различных субпопуляциях лимфоцитов

В нашем исследовании оценку экспрессии гранзима В после алло-ТКМ проводили на CD4+ и CD4+CD25hlgh клетках.

При анализе точечных диаграмм группу событий, экспрессирующих специфический поверхностный (CD4+ либо С04+С025ы ) антиген, изолировали с помощью инструмента выделения области (gate), как описано выше. Долю гранзима В позитивных событий определяли с использованием внутреннего позитивного контроля - популяции С04-негативных клеток, то есть тех клеток которые, учитывая вхождение в них CD8+ клеток заведомо несут гранзим В (рисунок 2В).

Характеристика интенсивности экспрессии гранзима В и его доли в CD4+ и CD4+CD25 lg клетках периферической крови у больных до проведения трансплантации костного мозга и в контрольной группе здоровых доноров

У пациентов после трансплантации аллогенного костного мозга после кондиционирования в миелоаблативном режиме интенсивность экспрессии гранзима В среди CD4+ клеток на +30 день была ниже по сравнению с пациентами после алло-ТКМ в режиме пониженной интенсивности. А при кондиционировании вне ремиссии более интенсивное кондиционирование приводило к снижению интенсивности экспрессии гранзима В в CD4+ клетках.

Изменение характеристики интенсивности экспрессии гранзима В и его доли в CD4+ и CD4+CD25hlgh клетках периферической крови у больных после трансплантации аллогенного костного мозга с использованием циклофосфамида в качестве индуктора толерантности.

В конце 1990-х годах появились сообщения об использовании высоких доз ЦФ в сочетании со стандартной иммуносупрессией для индукции толерантности у больных после алло-ТГСК от гаплоидентичного донора. В 2002 г. была опубликована работа L. Luznik и соавт. [49], в которой подтверждена эффективность применения ЦФ в качества индуктора толерантности при алло-ТГСК. В дальнейшем опубликованы данные нескольких групп исследователей из Сиэтла и Балтимора [50], которые, наряду со стандартной иммуносупрессией, использовали введение ЦФ в дозе 50 мг/кг в сутки на +3-й, либо на +3-й и +4-й день после алло-ТГСК от гаплоидентичного донора с целью индукции толерантности [51]. Частота острой РТПХ 2-4 степени и 3-4 степени составила 34% и 6%, соответственно. Причем снижение частоты острой РТПХ при эскалации дозы ЦФ не происходило. Согласно данным M.Kastan и соавт. [38], в гемопоэтических предшественниках определяется высокий уровень альдегиддегидрогеназы (АЛДГ), что делает их не восприимчивыми к высоким дозам ЦФ, так как именно с участием АЛДГ элиминируются цитотоксические метаболиты ЦФ. Мы использовали описанный Luznik [50] способ у четырех больных.

Интенсивность экспрессии гранзима В при использовании ЦФ в качестве индуктора толерантности среди CD4+CD25 lg клеток значимо отличалась лишь на +30 день (Р=0.002). При использовании только ЦФ в качестве индуктора толерантности интенсивность экспрессии составила 5977,33±3116,59(1085-9638) против 1766,67±307,75(0-4349) при использовании стандартной иммуносупрессии. Существует несколько возможных объяснений этому. Во-первых, использование режимов кондиционирования без ЦФ, таких как FLAMSA-RIC, что могло определять более высокий уровень экспрессии гранзима В среди CD4+CD25hlgh клеток. Но все же, по всей видимости, самым существенным является полный отказ от использования иммуносупрессии у этих больных, что могло привести к увеличению уровня гранзима В по сравнению с клетками, полученными от пациентов, которым проводилась стандартная иммуносупрессия. В-третьих, пациенты, у которых в качестве индукции толерантности использовался ЦФ были вне ремиссии, а по результатам нашего исследования именно нахождение пациента в или вне ПР является ключевым фактором, определяющим динамику экспрессии гранзима В в исследуемых популяциях.

Что касается доли гранзима В и интенсивности его экспрессии в CD4+CD25 lg и CD4+клетках, то эти данные подробно указаны в приложение 6.

В нашем исследовании у пациентов у которых в качестве профилактики оРТПХ использовался ЦФ отмечен более высокая интенсивность экспрессии гранзима В в клетках, относящихся к популяции CD4+CD25 lg клеток.

Характеристика интенсивности экспрессии гранзима В и его доли в CD4+ и CD4+CD25hlgh клетках периферической крови у больных, у которых диагностирована острой реакции трансплантат против хозяина.

Чтобы оценить роль экспрессии гранзима В в различных клетках в момент развития оРТПХ, мы использовали метод «landmark-анализа». В первую группу пациентов (п=16) «без оРТПХ» мы включили всех пациентов независимо от диагноза и режима кондиционирования, у которых с 0 до 90 дня не было констатировано развития оРТПХ. Во вторую группу (п=4) были включены пациенты, у которых оРТПХ развилась на более чем +30 день (из них 2 после 60 дня) и более чем на +60 день (п=2). Больные у которых оРТПХ развилась до +30 дня, были объединены в третью группу(п=7), т.к. у них время оценки популяции было в день диагностики оРТПХ, а в контрольные сроки (на +30,+60 и +90 день) у них у всех была эскалированная иммуносупрессивная терапия.

Как показано на рис. 19, доля гранзим В положительных клеток в популяции CD4+CD25hlgh- была более высокой на +30 и +60 день при отсутствии РТПХ за время наблюдения и по сравнению с группой пациентов, развивших оРТПХ в течение +30... +90 дня. По нашим данным доля гранзим В положительных CD4+CD25hlgh событий у пациентов без оРТПХ составила 9,49+2,79(0-30) и 16,56+6,98(0-97,9) на +30 и +60 день, в группе без оРТПХ что было значимо выше, чем в группе с оРТПХ резвившейся после +30 дня (На +30 день р= 0.003, на +60 день р= 0.03). С нашей точки зрения, этот факт крайне интересен, поскольку свидетельствует о возможности предположить, у кого из больных при обследовании в контрольные сроки может развиться оРТПХ или нет, что открывает перспективу превентивной терапии оРТПХ.

Т-регуляторные клетки - одни из главных игроков, обеспечивающих периферическую толерантность за счет делеции аллореактивных клонов. Поэтому небольшое число клеток с гранзимом В среди популяции CD4+CD25 lg среди больных, у которых в последствии развилась оРТПХ представляется вполне логичным. Следует отметить, что в литературе вопрос об использовании гранзима В как фактора - предиктора развития оРТПХ не изучался. Учитывая это нами была выполнена попытка выполнить расчет отношения шансов (Odd ratio, OR) -оно составило 2.7 (С195=0.5-14), при пороге в 5%, значение р при расчете методом Хи-квадрат составило 0,24 - что недостоверно, и по всей видимости связано с малой выборкой. В таблице 8 приведены данные о р при различных порогах. Стоит отметить что расчет р велся при помощи z-статистики.

Характеристика интенсивности экспрессии гранзима В и его доли в CD4+ и CD4+CD25hlgh клетках периферической крови у больных, у которых диагностирована острой реакции трансплантат против хозяина

Регуляция Т клеточного звена иммунной системы представляет собой сложнейший каскад, состоящий как из клеточных, так и гуморальных механизмов. Совершенно очевидно, что гранзим В в субпопуляции Т лимфоцитов играет важную роль в процессе регуляции иммунного ответа и модулировании оРТПХ после трансплантации аллогенного костного мозга. Таким образом, именно возможность оценить эти механизмы регуляции и позволяет определить степень значимости этого фактора и использовать его в качестве предиктора в развитии оРТПХ.

Гранзим В, который содержится в различных субпопуляциях Т лимфоцитов, играет ключевую роль в регуляции эффекторного Т клеточного звена иммунной системы. Прежде всего чрезвычайно важна его функция в популяции Т-регуляторных клеток.

В исследование по изучению экспрессии гранзима В в Т клеточном звене иммунной системы были включены 27 больных после трансплантации аллогенного костного мозга. Оценка экспрессии исследуемых маркеров выполнена на лимфоидной CD4 положительной клеточной популяции ПК у больных после алло-ТКМ до и в контрольные сроки после алло-ТКМ - 30, 60 и 90 день после трансплантации. Также исследования выполнялись в день констатации развития оРТПХ и в группе здоровых доноров.

В первую очередь нами были статистически доказаны различия (р=0,0008) и обоснованность используемого нами методологического подхода.

В исследовании выявлены отличия в доли и экспрессии гранзима В в популяции клеток с фенотипом CD4+CD25 lg у больных до алло-ТКМ вне и в ремиссии, и в контрольной группе доноров.

Так у доноров и пациентов в ремиссии процент этих клеток был выше чем у пациентов находящихся вне ремиссии до алло-ТКМ. Даже на малой группе хотелось бы отметить что у больных ОЛЛ в ПР процент гранзим В положительных CD4+ клеток был существенно выше, в сравнении и с ОМЛ в ПР и с донорами (р=0.06). Объяснением этому может служить факт различия в распределении гранзима В в популяции Т хелперов. По большому числу сообщений его количество преобладает в популяции Т хелперов первого типа, нежели в остальных субпопуляциях. Таким образом, вероятнее всего, при ОЛЛ имеет место преобладание популяции Т хелперов первого типа.

Экспрессия гранзима В внутри CD4+ клеток, у пациентов с ОМЛ после трансплантации вне ремиссии достоверно нарастала и к +90 дню достоверно отличалась (р=0,03) в сравнении с пациентами в ремиссии ОМЛ. Это по, всей видимости, связано с более «интенсивной» антигенной стимуляцией у больных трансплантировавшихся вне ремиссии.

Нами была значимость интенсивности иммуносупрессивной терапии у пациентов после алло-ТКМ. Так у больных после алло-ТКМ от неродственного донора, что предполагает более интенсивную ИСТ, доля гранзим В положительных CD4+CD25hlgh клеток на +30 день было значимо ниже (р=0.04), нежели чем у пациентов после алло-ТКМ от родственного донора. Данная тенденция сохранилась и для интенсивности экспрессии гранзима В в CD4+ клетках на +30 и +90 день после алло-ТКМ. Так, у пациентов после алло-ТКМ от неродственного донора интенсивность экспрессии гранзима В по MFI был значимо ниже (Р=0.0003 и Р=0,001) на +30 и +90 день по сравнению с пациентами после алло-ТКМ от родственного донора. Что, по всей видимости, связано с интенсивностью иммуносупрессии и/или источником трансплантата.

В нашем исследовании также было показано, что доля экспрессирующих гранзим В клеток в популяции CD4+CD25 lg - была более высокой на всех контрольных сроках на (+30 и +60 день) при отсутствии РТПХ за время наблюдения и статистически более низким (Р= 0.003 и Р= 0.03) в сравнении с долей таких клеток в день развития оРТПХ. А также при сравнении доли гранзим В-позитивных CD4+\CD25hlgh клеток на +30 день у пациентов без оРТПХ и пациентов с оРТПХ после +30 дня (р=0.003).

Этот факт крайне интересен, поскольку свидетельствует о возможности предположить, у кого из больных при обследовании в контрольные сроки может развиться оРТПХ или нет, что открывает перспективу превентивной терапии оРТПХ. Учитывая это, была выполнена попытка выполнить расчет отношения шансов (Odds ratio, OR) -он составил 2.7 (С195=0.5-14), при пороге в 5%, значение р при расчете методом Хи-квадрат составило 0,24 - что недостоверно, и по всей видимости связано с малой выборкой.

Также была предпринята попытка проанализировать изменение субпопуляций Т лимфоцитов после введения МСК.

Однако при анализе нам лишь в очередной раз удалось подтвердить достоверно большее абсолютное число Т клеток (Р=0.03), Т-регуляторных клеток (Р=0.014), Т хелперов (Р=0.04 ) и цитотоксических Т лимфоцитов (Р=0.006 ) у доноров нежели реципиентов костного мозга. Также нами было показано неправомочность использования соотношения CD4\CD8 клеток как какого-то интегрального показателя у больных после трансплантации аллогенного костного мозга. Таким образом, выявленные изменения свидетельствуют о необходимости проведения дальнейших исследований в этой области и попытке использовать количество гранзим В положительных CD4+CD25 lg клеток как маркера-предиктора развития оРТПХ.

Похожие диссертации на Исследование экспрессии гранзима В в CD4+ лимфоцитах и Т-регуляторных клетках у пациентов после трансплантации аллогенного костного мозга