Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 13
1.1. Современные подходы к терапии множественной миеломы 13
1.2. Терапия ММ ингибиторами протеосом 13
1.3. Лечение ММ иммуномодуляторами 32
1.4. Лечение ММ, осложненной почечной недостаточностью 46
1.5. Роль свободных легких цепей при диагностике и мониторировании остаточной болезни при ММ 56
1.6. Т-клеточный иммунитет при множественной миеломе 60
Глава 2. Материалы и методы исследования 69
2.1. Клиническая характеристика пациентов 69
2.2. Иммунологические методы исследования
2.2.1 Метод иммунофлуоресцентного анализа 71
2.2.2 Метод ПЦР 73
2.2.3. Free Light метод определения концентрации СЛЦ 76
2.2.4. Определение концентрации свободных легких цепей в сыворотке крови методом ИФА 76
2.3. Статистическая обработка результатов 78
Глава 3. Эффективность бортезомибсодержащих программ лечения множественной миеломы 79
3.1 Эффективность кумулятивного действия бортезомиба при рецидивной и резистентной множественной миеломе 80
3.2. Лечение рецидивной и резистентной множественной миеломы бортезомибом и его комбинациями с другими препаратами 85
3.3. Эффективность программы ВМП (бортезомиб, мелфалан, преднизолон) в терапии впервые диагностированной множественной миеломы 94
Глава 4. Эффективность леналидомида, бортезомиба и преднизолона при резистентной и рецидивной множественной миеломе к бортезомибсодержащим программам 111
Глава 5. Лечение множественной миеломы, осложненной почечной недостаточностью бортезомибсодержащими программами в сочетании с гемодиализом 124
Глава 6. Фармакодинамическая оценка бортезомиба и программ ВМП и РВП на основании анализа свободных легких цепей иммуноглобулинов сыворотки крови при резистентной/рецидивной множественной миеломе 139
6.1 Значение мониторинга концентраций свободных легких цепей иммуноглобулинов сыворотки крови в определении уровня резидуальной болезни и прогнозе течения множественной миеломы 141
6.2. Фармакодинимическая оценка применения бортезомиба и программ ВМП и РВП на основании анализа свободных легких цепей иммуноглобулинов сыворотки у пациентов с рецидивной/резистентной множественной миеломой 154
Глава 7. Мониторинг Т-клеточного иммунитета при множественной миеломе в процессе противоопухолевой терапии 174
7.1. Восстановление Т-лимфоцитов периферической крови у пациентов с впервые диагностированной множественной миеломой после проведения курса VCP (бортезомиб, циклофосфан, преднизолон) 175
7.2. Исследование роли тимуса в востановление Т-клеток у пациентов с впервые диагностированной множественной миеломой после проведения курса VCP 183
7.3. Значение Т-регуляторных лимфоцитов (CD4+CD25+FOXP3+) и их субпопуляций, экспрессирующих кророткую форму транскрипционного фактора FOXP32 при множественной миеломе 184
Глава 8. Заключение 193
Выводы 213
Список сокращений 216
Список литературы
- Лечение ММ, осложненной почечной недостаточностью
- Определение концентрации свободных легких цепей в сыворотке крови методом ИФА
- Эффективность программы ВМП (бортезомиб, мелфалан, преднизолон) в терапии впервые диагностированной множественной миеломы
- Фармакодинимическая оценка применения бортезомиба и программ ВМП и РВП на основании анализа свободных легких цепей иммуноглобулинов сыворотки у пациентов с рецидивной/резистентной множественной миеломой
Введение к работе
Актуальность проблемы. Совершенствование противоопухолевой терапии множественной миеломы (ММ) является актуальной проблемой клинической гематологии. Современный этап этой проблемы определяется несколькими основополагающими факторами. Главным, из которых, является смена химиотерапевтических подходов от программ на основе алкилирующих препаратов на программы, включающие противоопухолевые препараты новой генерации. Наиболее актуальными из них с практической точки зрения являются бортезомиб (ингибитор протеосомы) и леналидомид (препарат иммуномодулирующего действия).
В связи с этим, возникла новая необходимость показать их эффективность в доказательных клинических исследованиях как в монотерапии, так и в комбинациях в первой и во второй линиях лечения. Следует отметить, масштабные клинические исследования, направленные на изучение клинических свойств бортезомиба и комбинаций на его основе при резистентной/рецидивной ММ (Р/Р ММ) (Richardson et al. SUMMIT, 2003; Niesvizky et al/ APEX, 2006; Delforge M. et al. VISTA, 2012). Исследования показали большую эффективность многокомпонентных комбинаций на основе бортезомиба, по сравнению с монотерапией.
При сравнительном анализе опубликованных результатов следует
отметить трудности оценки из-за различия критериев включения в эти
программы. Так в клинической группе программы APEX состав пациентов
отличался меньшей предлеченностью и меньшей осложненностью. Кроме
перечисленных факторов, затрудняющих анализ результатов программ APEX
и SUMMIT существуют разночтения в оценке клинической эффективности
бортезомиба. Это связано с тем, что международная оценка эффективности
лечения ММ (Durie et al, 2006) применялась не всегда. Используя оценочную
систему EBMT (Blade et al,1998г.) программа SUMMIT отличалась от
результатов APEX по объективному ответу на 15%. Другие важные
показатели эффективности так же достаточно трудно оценивать в мета-
анализе из-за объективных проблем стандартизации групп, жесткого
селективного отбора, разных кумулятивных доз курсов и
химиотерапевтических (ХТ) циклов, длительности индукционного периода, наличия поддерживающего лечения. Все это делает актуальным проведение оригинальных клинических исследований, направленных на изучение эффективности бортезомибсодержащих программ лечения ММ.
В настоящее время в практике лечения ММ накапливаются случаи резистентности к бортезомибсодержащим программам. Это создает новую сложную и актуальную проблему, требующую научного анализа для ее решения. Ключевым звеном этой проблемы являются клинические исследования, направленные на изучение новых протоколов, включающих следующую новую генерацию препаратов, каким является леналидомид. В этой связи следует отметить работу, включающую более 700 пациентов с Р/Р ММ, леченных леналидомидом в сочетании с дексаметазоном с объективным противоопухолевым ответом (ОО) 60,6% и медианой общей выживаемости (ОВ) 29,6 мес. (Wang W. et al, 2008). Эту проблему может решить и монотерапия леналидомидом, но с меньшей эффективностью (ОО-26%, ОВ-23 мес. (Ме)). В то же время, практически нет работ, касающихся комбинаций леналидомида, бортезомиба и преднизолона при Р/Р ММ. На наш взгляд, соединение двух эффективных противоопухолевых препаратов в сочетании с преднизолоном представляет актуальную научную задачу, которая может быть решена в результате проведения клинического исследования. Целесообразность проведения такого исследования диктуется возможностью получения эффективного протокола для лечения резистентной к бортезомибу ММ.
Сложной задачей является проблема лечения ММ, осложненной почечной недостаточностью (ПН). Актуальность изучения данной темы определяется новыми данными, касающимися роли циркулирующих
свободных легких цепей иммуноглобулинов сыворотки крови (СЛЦ ИГСК) в патогенезе патологии почек при ММ, новыми лекарственными препаратами, широко внедряемыми в клиническую практику, возможностями аппаратного замещения ПН. Эти ключевые факторы проблемы находят свое отражение в отдельных публикациях (Gonsalves W.I. et al, 2005), но очевидно, что требуется обновленная концепция лечения ММ, осложненной ПН, которая включала бы вышеуказанные предпосылки. ММ относится к В-лимфопролиферативным процессам с сохраненной протеинсинтезирующей функцией. Поэтому данный маркер В-клеточного иммунитета используется как оценочный фактор эффективности терапии и дальнейшее развитие этой проблемы заключено в исследованиях, касающихся роли СЛЦ в диагностике трудных случаев ММ, патогенезе нефропатии при ММ, диагностике ремиссии и мониторинге остаточной болезни. Однако в литературе недостаточно работ, касающихся прикладного значения уникального свойства СЛЦ и их короткого периода полураспада, которое позволило бы определять противоопухолевую динамику препаратов в реальном времени.
Актуальность иммунологического мониторинга в процессе лечения
инновационными препаратами определяется состоянием Т-клеточного
иммунитета, который недостаточно изучен при ММ. В этой связи следует
отметить работу Franssen L.E. et al, 2015, показавшую ассоциацию высокой
экспрессии Т-регуляторных лимфоцитов (Treg) и короткой выживаемостью
после аллогенной трансплантации стволовых клеток (аллоТСК). Кроме того,
изучение процессов регенерации Т-системы после цитостатической терапии,
включая смену субпопуляций, время восстановления и роль тимуса (по
определению Т-рецепторных эксцизионных колец (TREC)) могут
определить параметры химиотерапевтических программ ММ.
Цель исследования
Разработать и внедрить оригинальные и эффективные программы
лечения впервые диагностированной и резистентной/рецидивной
множественной миеломы на основе противоопухолевых препаратов новой генерации (бортезомиб, леналидомид) с учетом иммунологического мониторинга, включающего динамику циркулирующих свободных легких цепей иммуноглобулинов сыворотки крови и субпопуляций Т-лимфоцитов.
Задачи исследования
-
Разработать и внедрить в клиническую практику новые оригинальные химиотерапевтические программы на платформе бортезомиба для лечения впервые диагностированной и Р/Р ММ.
-
Разработать и внедрить в клиническую практику новую оригинальную программу: леналидомид, бортезомиб, преднизолон (РВП) для лечения ММ, резистентной к бортезомибсодержащим программам.
-
Сформулировать обновленную концепцию лечения ММ, осложненной ПН, на основе приоритета в патогенезе циркулирующих СЛЦ ИГСК, эффективной фармакодинамики бортезомиба и гемодиализной поддержки.
-
Разработать метод фармакодинамической оценки эффективности бортезомиба; комбинаций бортезомиба, мелфалана, преднизолона (ВМП) и леналидомида, бортезомиба, преднизолона (РВП) на основании анализа концентрации циркулирующих СЛЦ ИГСК в процессе курсов противоопухолевой терапии.
-
Изучить процессы регенерации Т-клеточного иммунитета при ММ после индукционных курсов противоопухолевой терапии с анализом субпопуляций: наивных клеток (CD45RA+62L+), терминально-дифференцированных клеток (CD45RA+62L-), Treg лимфоцитов (CD4+25+FOXP3+) и их изоформ, а так же, оценить вклад тимуса в процесс восстановления Т-клеточного звена по анализу уровня TREC.
Новизна исследования
Впервые было показано, что индукционное лечение бортезомибом должно составлять не менее шести курсов у рецидивных и резистентных пациентов при этом достигался близкий к максимальному эффект. Эти данные послужили одним из факторов создания платформы бортезомиба, на базе которой были созданы многокомпонентные комбинации с высокой непосредственной и отдаленной эффективностью. Оригинальная ВМП программа была изучена у тяжелой группы пациентов с ММ в 1 и 2 линиях лечения с хорошей эффективностью и невысокой токсичностью за счет сниженных кумулятивных доз бортезомиба за индукционный период.
Программа РВП, где используются два инновационных препарата – бортезомиб и леналидомид, не имеет аналогов ни в нашей, ни в зарубежной литературе и обладает хорошим эффектом и невысокой токсичностью. Она применима во 2 линии лечения пациентов рецидивирующих и резистентных на бортезомибсодержащих протоколах.
Сформулированная в работе обновленная концепция ПН при ММ,
базирующаяся на достижениях иммунохимии последних лет и собственных
исследованиях, позволила получить оригинальные результаты,
подтвержденные в проспективном клиническом исследовании.
Изучение иммунологического мониторинга в процессе терапии ММ позволило получить важные научные результаты.
Фармакодинамический анализ бортезомиба и комбинаций на его основе с помощью метода определения СЛЦ ИГСК в процессе курсов ХТ позволил в реальном времени определить чувствительность к этим препаратам и прогнозировать наступление отдаленного эффекта. Результат проведенной работы защищен патентом № 25494558 от 30.03.2015 ''Способ определения эффективности лечения множественной миломы''.
Впервые были получены данные о регенерации Т-клеточной системы
иммунитета после курсов лечения VCP (бортезомиб, циклофосфан,
преднизолон) с анализом субпопуляций и определением времени
восстановления, что было учтено при разработке параметров курсовой ХТ.
Установлено преобладание гомеостатической пролиферации над тимопоэзом
при восстановлении Т-лимфоцитов, на что указывают усиление
пролиферации периферических Т-клеток и снижение уровня TREC в периферической крови.
Впервые проведено исследование Т-регуляторных клеток
(СD4+25+FOXP3+) в разных фазах течения ММ, установлена достоверная прямая связь между активностью опухолевого процесса и экспрессией короткой изоформы, лишенной экзона 2, транскрипционного фактора FOXP3.
Практическая значимость
Результаты, полученные в процессе проспективных клинических исследований, включающих 311 пациентов с ММ, имеют большое практическое значение.
Разработанные одно- и многокомпонентные программы на основе
бортезомиба характеризовались высокой эффективностью, умеренной
токсичностью, за счет сниженной кумулятивной дозы бортезомиба за индукционный период. Причем, формирование клинических групп для исследования осуществляли по неселективному принципу.
Все это делает их оптимальными программами для реальной клинической практики с широким спектром применения в 1 и 2 линиях у пациентов не являющихся кандидатами на аутологичную трансплантацию стволовых кроветворных клеток (ауТСК).
Программа, включающая леналидомид, бортезомиб, преднизолон (РВП), является на сегодняшний день единственной программой в отечественной гематологии, эффективность которой во 2 линии лечения была подтверждена в проспективном клиническом исследовании. Внедрение этой программы в реальную клиническую практику по существу решает проблему химиотерапевтического лечения ММ в целом, так как она преодолевает резистентность к ВМП, которая применима в 1 линии лечения. При этом достигается хороший показатель по ОВ, который равен 82 мес. (Ме) от момента диагноза. Разработанные нами оригинальные протоколы лечения используются в клинике гематологии МОНИКИ и гематологических отделениях Московской области (ЦРБ г. Коломна, ЦРБ г. Королев).
Разработанные принципы терапии ММ, осложненной ПН, имеют
большое значение для практики, поскольку восполняют информационный
пробел в лечении этого состония. Применение метода определения СЛЦ
ИГСК в процессе проведения ПХТ позволяет практически в реальном
времени определить чувствительность опухоли к проводимой терапии и в
случае негативного результата произвести смену курса лечения.
Иммунологический мониторинг, проводившийся в процессе
противоопухолевой терапии, позволил получить важные для клинической практики результаты. Прежде всего, это данные по Т-клеточному гомеостазу в процессе лечения, которые имеют практическое значение, поскольку позволяют клиницистам обратить внимание на эту проблему и оптимизировать лечение с учетом новой научной информации.
Положения, выносимые на защиту
1. Разработанная оригинальная ВМП программа (бортезомиб,
мелфалан/циклофосфан, преднизолон) обладает высокой непосредственной и
отдаленной результативностью, невысокой токсичностью и может
применяться в 1 и 2 линиях лечения при широком спектре клинических
проявлений ММ.
-
Разработанная оригинальная РВП программа (леналидомид, бортезомиб, преднизолон) обладает высокой непосредственной и отдаленной результативностью, невысокой токсичностью и может применяться при рецидивирующей и резистентной ММ к программам на основе бортезомиба.
-
Применение обновленной концепции лечения ММ, осложненной ПН, основанной на признании ведущей роли циркулирующих СЛЦ ИГСК в патогенезе этого осложнения, анализе уровня СЛЦ, обусловленном фармакодинамикой бортезомиба, гемодиализной поддержке, и клиническом эффекте, позволяет достичь более высокого противоопухолевого эффекта и улучшения почечной функции.
-
Разработанный метод фармакодинамической характеристики бортезомиба и многокомпонентных комбинаций на его основе с использованием анализа циркулирующих СЛЦ ИГСК позволяет определить чувствительность опухолевых клеток к проводимой терапии и прогнозировать отдаленные клинические результаты.
-
Т-клеточная система иммунитета при впервые выявленной ММ характеризуется повышением значений по всем изучаемым субпопуляциям Т-лимфоцитов, что может косвенно свидетельствовать об ее участии в первичном противоопухолевом ответе. Регенерация после цитостатической редукции происходит через 30 дней межкурсового интервала. Ремиссия при ММ сопровождается нормализацией показателей Тreg.
Апробация работы
Материалы и основные положения диссертации доложены и
обсуждены на Российских съездах (“Человек и лекарство”, Москва, 2007,
2010г.,2011г.,2012г.,2013г.); на Всеросcийской научно-практической
конференции “Отечественные противоопухолевые препараты”,
Москва,2007г.; научно-практической конференции “Современная
гематология. Проблемы и решения”, ноябрь 2014; Всероссийской
конференции с международным участием “Злокачественные лимфомы” октябрь 2013г.; Всероссийской конференции трансфузиологов и гематологов, С-Петербург, июнь 2014г.
Диссертация апробирована на совместной научно-практической
конференции сотрудников клинических и лабораторных отделов ГБУЗ МО
МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского; курса трансфузиологии ФУВ ВПО
МОНИКИ, кафедры клинической иммунологии и аллергологии Первого
Московского государственного медицинского университета им. И.М.
Сеченова 10 сентября 2015 г.
Внедрение результатов работы в практику
Результаты исследования и практические рекомендации, выработанные на основании проведенного исследования, используются в работе отделения клинической гематологии и иммунотерапии ГБУЗ МО МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского, отделениями гематологии ЦРБ г. Королев, г. Коломны. По результатам исследования опубликована 41 печатная работа.
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 257 страницах машинописного текста и состоит из введения, 8 глав, выводов, списка литературы. Библиография включает в себя 296 источников литературы, в том числе 30 отечественных и 266 зарубежных. Работа иллюстрирована 39 таблицами 36 и рисунками.
Лечение ММ, осложненной почечной недостаточностью
Бортезомиб первый обратимый ингибитор протеосом, нарушающий гомеостаз в опухолевой клетке путем блокады активности химотрипсина протеосомы 26 S. В результате этого нарушается функция опухолевой клетки, что приводит ее к гибели. При изучении фармакокинетики бортезомиба у больных с множественной миеломой было установлено, что при введении 1,3мг/м2 препарата максимальная концентрация препарата составляла 1300нг/мл, среднее время полувыведения составляло 9-15 часов. Установлено так же, что 83% препарата связывается с белками крови. Метаболизм велкейда происходит в основном в микросомах печени с участием цитохрома-450. При этом происходит отщепление бора с последующим гидроксилированием метаболитов. Доклинические исследования показали, велкейд оказывал цитотоксическое действие in vitro в средней концентрации (IС-50-57нм) в отношении 60 клеточных линий опухолей [2--5]. При изучении токсического действия велкейда на животных отмечены анемия, тромбоцитопения и выраженная неврологическая токсичность. Нейротоксичность характеризовалась отеком и дегенерацией аксонов периферических нервов, задних корешков и проводящих путей спинного мозга.
Клинические свойства велкейда были изучены в исследованиях II фазы, которые показали гастроэнтерологическую, гематологическую и нейротоксичность в виде сенсорной периферической нейропатии (ПНП) [6,7]. В этих же исследованиях определена разовая доза препарата (1,3мг/м2), кратность введения на 1 курс (4 раза), интервалы 2-3 дня и интервалы между курсами - 10 дней, количество курсов - 8. Клиническая эффективность велкейда была изучена так же в клинических исследованиях II фазы (SUMMIT)[8]. В исследование были включены 202 пациента ММ, получившие ранее не менее 2-х линий химиотерапии с развитием прогрессирования болезни. Предшествующие программы терапии включали алкилирующие препараты, антрациклины, талидомид и высокодозную химиотерапию с пересадкой аутологичных стволовых клеток. Результаты лечения оценивали после 6 курсов. Полный ответ (ПО) установили у 4%, близкий к полному (БПО) у 0%, частичный (40) у 18%. Общий ответ (ПО+ЧО) был равен 28%. Среднее время до достижения максимального ответа составляло 38 дней, средняя продолжительность ответа - 12 месяцев. Степень выраженности гематологической, неврологической и гастоэнтерологической токсичности, требующих прекращения терапии были у 22% больных. В исследовании III фазы клинических испытаний (APEX) , направленном на изучение сравнительной эффективности и безопасности велкейда и высокой дозы дексаметазона было включено 669 больных ММ, ранее получавших 1-3 схемы терапии [9,10]. Сравнивая два указанных многоцентровых исследования APEX и Summit, следует отметить существенные различия критериев включения и исключения в этих программах. В соответствии с этим, в клинической группе программы APEX состав больных отличался меньшей предлеченностью, меньшим количеством курсов предшествующей противоопухолевой химиотерапии, меньшей осложненностью заболевания. Кроме перечисленных факторов, затрудняющих анализ результатов исследования двух программ, существуют разночтения в критериях клинической эффективности велкейда (унифицированная оценка противоопухолевого действия применялась не всегда). Используя оценочную систему EBMT [11], программа SUMMIT отличается от результатов APEX: ПО соответственно 4 %и 9%; ЧО 24% (включая близкий к полному ответ) и 34%. Следовательно, оценка по общему ответу (ПО+ЧО) составляла 28% и 43% соответственно. Другие показатели, такие как время наступления максимального эффекта, длительность ответа (ДО), время до прогрессирования (ВДП), общая выживаемость (ОВ), не подлежат сравнительной оценке, т.к. не использовались одновременно в каждой программе. Исключение составляет общая выживаемость, результаты которой в исследовании SUMMIT составила 17 месяцев, а в исследовании APEX – 29,8 месяцев. В дальнейшем, при сравнении эффективности монотерапии велкейдом и талидомидом при резистентной ММ, было показано преимущество велкейда по ЧО - 53% и 32%, и выживаемости в течение 1 года - 80% и 63% [12].
Для полноценного анализа эффективности изучаемого препарата необходимо его рассматривать в аспекте избирательности противоопухолевого действия. Самая общая характеристика этого явления заключается в соотношении эффекта и токсичности. В исследовании SUMMIT токсичность гематологическая и общая оценивалась по 14 позициям. Однако тяжелая степень токсичности, требующая отмены лечения, встречалась в 14% случаев. Отмечалась некоторая избирательность токсического действия велкейда, касающаяся тромбоцитопении, нейтропении и ПНП. Причем цитопении носили преходящий характер, а полинейропатия отличалась длительным течением – по исследованию SUMMIT. В исследовании APEX изучалась обратимость ПНП – в итоге в 55% случаев ПНП была полностью обратимой, в 45% случаев достигалось значительное улучшение ПНП, медиана срока до исчезновения нейропатии составила 107 дней. В связи с этим анализом, становится очевидной достаточно высокая избирательность противоопухолевого действия велкейда с превалированием клинической результативности над общей токсичностью. Таким образом, сравнение результатов лечения ММ монотерапией велкейдом в исследованиях SUMMIT и APEX с клиническими группами с разной предлеченностью показало несколько большую эффективность препарата в группе с меньшей предлеченностью. В исследовании APEX так же доказана большая эффективность велкейда по сравнению с высокими дозами дексаметазона у предлеченных больных с множественной миеломой [13,14]. Важной особенностью исследования SUMMIT и APEX является возможность оценки ответа на лечение велкейдом больных с делецией хромосомы 13 (del-13). Полученные результаты, свидетельствуют о том, что велкейд преодолевает резистентность, связанную с этой генетической аномалией [15]. Анализ результатов клинических исследований SUMMIT и APEX показал также, что качество противоопухолевого ответа монотерапии велкейдом существенно влияло на отдаленный клинический результат. Показано, что время до прогрессии при ПО или близким к полному ответе (БПО) составляло 16,4 мес., а при частичном – 9,2 мес. (SUMMIT). В исследовании APEX аналогичные показатели составляли 12,2 и 8,3 месяца [9]. Представляет интерес рассмотрение результатов многоцентровых клинических исследований, какими являются SUMMIT и APEX с исследованиями расширенного доступа монотерапии велкейдом (IIIb фаза). Если в исследовниях SUMMIT и APEX существующие жесткие критерии включения позволяют моделировать клиническую ситуацию под решение фармакологической задачи, то в программах расширенного доступа результаты лечения практически отражают реальную практику. Исходя из такой предпосылки, результаты лечения, полученные в этих программах должны быть несколько хуже, чем в многоцентровых исследованиях. Тем не менее, в работе, где проведен анализ 624 рецидивных и рефрактерных больных ММ зарегистрировано 12% ПО, 23% БПО и 19% ЧО. Общий ответ (ОО) на монотерапию велкейдом (ПО+ЧО) составлял 54%. Причем перерывы в лечении в связи с неблагоприятными явлениями составляли 26%. Эти результаты были несколько лучше, чем в сравниваемых программах, где ПО+.ЧО было от 30% до 45% зависимости от предлеченности. Вероятно, что эти различия связаны с разнородностью клинических групп, включенных в иследования (по предлеченности, цитогенетике). В других сообщениях о результатах эффективности монотерапии велкейдом в рутинной гематологической практике сообщается об 69% ЧО у 83 рецидивных и рефрактерных больных ММ, достигнутых после 3 цикла [16].
Определение концентрации свободных легких цепей в сыворотке крови методом ИФА
Иммунологические методы исследования были проведены в лаборатории клинической иммунологии и тканевого типирования ГБУЗ МО МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского (руководитель профессор, д.м.н. Яздовский В.В.), лаборатории биохимии РОНЦ им. Блохина (зав. лабораторией д.м.н. Н.В. Любимова), лаборатория дифференцировки лимфоцитов ФГБУ «ГНЦ институт иммунологии» ФМБА России (и.о. зав. лаборатории к.м.н. Митин А.Н.).
Исследования иммунокомпетентных клеток проводили с помощью иммунофлуоресцентного анализа на проточном лазерном цитофлюориметре BD FACSCanto II (Becton Dickinson, США).
Принцип метода: специфические антитела, меченные различными флурохромами, связываются с мембранными антигенами живых клеток, находящихся в суспензии. Чтобы предотвратить кэппинг и шеддинг антигенов после взаимодействия с антителами, к суспензии клеток добавляют 0,1% раствор азида натрия. Окрашенные клетки анализировали на проточном лазерном цитофлуориметре.
Проточная цитофлуориметрия имеет ряд преимуществ. Это значительная скорость анализа (более 500 клеток в секунду) и высокая точность количественной оценки двух независимых параметров одной и той же клетки: величины светорассеяния и интенсивности флуоресценции. Компьютерная схема цитофлуориметра снабжена программами для расчета процентного и абсолютного содержания маркированных клеток. Проточный цитометр, проанализировав заданное количество клеток, выводит результаты на дисплей в виде цитограмм, затем компьютерная система интегрирует цитограммы для расчета процентных и абсолютных отношений результатов.
Забор периферической крови производился в пробирки с антикоагулянтом. Выделение мононуклеров периферической крови (МНПК) и последующий анализ проводился в течение последующих 6 часов. Подсчет клеток проводился по общепринятой методике. МНПК выделялись на градиенте концентрации. Клетки суспензировали в PBS с 1% BSA и 0,1% NaN3, затем инкубировали с моноклональными антителами (МАТ) к поверхностным маркерам в том же буфере в течение 30 мин при 4С. В случае определения внутриклеточных маркеров клетки отмывали и пермеабилизировали в течение 40 мин буфером фирмы «eBioscience» (США) («Foxp3 Fixation/Permeabilization Buffer») согласно методическим указаниям фирмы. Затем клетки отмывали и инкубировали в течение 30 мин при при 4С в темноте с МАТ против FOXP3 и Ki-67, снова отмывали и сразу без фиксации анализировали на проточном цитометре. Учитывая минорность фракции FOXP3+ клеток, для уменьшения ошибки анализировали не менее 105 клеток, попадающих в гейт лимфоцитов. Лазерную цитометрию клеток осуществляли на проточном цитометре BD FACSCanto II (Becton Dickinson) в стандартном режиме. Анализ данных проводили с помощью программного обеспечения BD FACSDiva и FCS Express.
Использовали МАТ, меченные различными флуорохромами – FITC (флуоресцеина изотиоцианат), PE (фикоэритрин), PE-Cy7 (фикоэритрин-цианин7), APC (алофикоцианин), eFluor 660 и APC-eFluor 780 (алофикоцианин-eFluor 780). Использовали следующие комбинации МАТ фирмы «eBioscience» (США) (препараты для изотипических контролей той же фирмы): CD3-APC+CD4-FITC+CD8-APC-eFluor 780+CD45RA-PE-Cy7 + CD62L-PE; CD3-APC+CD4-PE-Cy7+CD8-APC-eFluor 780+ki-67-FITC; CD3-PE-Cy7+CD4-FITC+FOXP3-eFluor 660; СD3-PE-Cy+CD4-FITC+CD25-PerCP-eFluor710+FoxP3(PCH101)-APC; СD3-PE-Cy+CD4-FITC+ FoxP3(PCH101)-APC+FOXP3(150D/E4)-PE. МАТ клона РНС101 специфичны к продукту экзона 1 молекулы FOXP3 и выявляют все изоформы, а 150D/E4 – к продукту экзона 2 молекулы FOXP3. При сочетании данных МАТ их одновременное связывание с клеткой указывает на экспрессию целой молекулы FOXP3, а при связывании только МАТ РНС101 – на экспрессию изоформы FOXP3 с делецией продукта экзона 2.
Алгоритм гейтирования функционально-возрастной структуры по экспрессии маркеров CD45RA и CD62L проводился поэтапно: из лимфоцитарного пула выделяются CD3+ клетки, по экспрессии CD4 и CD8 Т-клетки разделяются на CD3+4+ и CD3+8+ субпопуляции. Далее по экспрессии CD45RA и CD62L производится фенотипический анализ функционально-возрастной структуры каждой субпопуляции. Наивные Т-клетки (Tnaive) имеют фенотип CD45RA+62L+, центральные Т-клетки памяти (Tcm) – CD45RA-62L+, эффекторные Т-клетки памяти (Tem) – CD45RA-62L-, терминально-дифференцированные эффекторные или вновь экспрессирующие CD45RA Т-клетки (Temra) – CD45RA+62L- [9].
Полимеразная цепная реакция (ПЦР, PCR – polymerase chain reaction) – метод получения множества копий определенных фрагментов ДНК (генов) в биологическом образце. Образование нуклеотидной цепи осуществляется ферментом ДНК-полимеразой. Для начала реакции ферменту необходима стартовая площадка. В качестве площадок выступают "праймеры" (затравки) -синтетические олигонуклеотиды длиной 15-20 нуклеотидов. Праймеров должно быть два (прямой и обратный), комплементарные участкам ДНК-матрицы и именно фрагмент ДНК, ограниченный праймерами, будет многократно копироваться ДНК-полимеразой. Роль полимеразы заключается в последовательном добавлении нуклеотидов, комплементарных последовательности ДНК-матрицы. Таким образом, в одном цикле заново синтезируется два новых фрагмента ДНК (т.к. молекула ДНК - двухцепочечная, то и матриц изначально две). В результате, за 25-35 циклов в пробирке накапливаются миллиарды копий участка ДНК, исследуемого праймерами. Структуру отдельного цикла составляют три этапа: 1.денатурация ДНК (плавление, расхождение цепей ДНК) - 95С от 1 до 2 минут; 2.отжиг праймеров (затравки связываются с ДНК-матрицей, температура данной стадии определяется нуклеотидным составом праймера) - 60С (к примеру) -1 минута; 3.элонгация ДНК (полимераза синтезирует цепь ДНК) - 72С - 1 минута (время зависит от длины синтезируемого фрагмента).
Для проведения метода полимеразной цепной реакции необходимо следующее оборудование: амплификатор(термоциклер); системы для гель-электрофореза с источником питания (для визуализации результатов ПЦР); системы гель-документации(для анализа результатов ПЦР); ПЦР-бокс(для пробоподготовки); вортекс; микроцентрифуги; набора автоматических дозаторов (механических или электронных). Необходимы и расходные материалы: стерильные наконечники, пробирки, штативы для пробирок и дозаторов. Реагентная база в включает в себя фермент ДНК-полимеразу с буфером, праймеры (небольшие синтетические фрагменты ДНК, комплементарные началу и концу анализируемого участка ДНК-матрицы), смесь нуклеотидов (А, Т, Г, Ц). Также абсолютно необходима очищенная вода.
Чувствительность метода такова, что амплифицировать в ПЦР и выявить целевую последовательность можно даже в том случае, если она встречается однажды в образце из 105 клеток. ПЦР позволяет выявлять ДНК конкретного инфекционного либо агента другой природы в присутствии ДНК других микроорганизмов и ДНК организма-хозяина, а также проводить генотипирование. Важное преимущество ПЦР – отсутствие стадий культуральной микробиологической работы. Подготовка образцов, проведение реакции и анализ результатов максимально облегчен и во многом автоматизирован. Благодаря этому, время получения результата может сокращаться до 4-5 часов. ПЦР помогает избежать известных сложностей, возникающих при выращивании труднокультивируемых, некультивируемых или персистирующих форм микроорганизмов для диагностики латентных и хронических инфекций. Эффективен метод ПЦР и при скрининге возбудителей с высокой антигенной изменчивостью, а также внутриклеточных паразитов. Все перечисленные выше достоинства этого уникального метода - высокая чувствительность и специфичность, идентификация инфекционного агента и проведение генотипирования любого гена человека, высокая эффективность и экономия времени, универсальность приборной базы – позволяют широко применять сегодня метод ПЦР в клинической диагностике, медицинской практике, научных исследованиях.
Эффективность программы ВМП (бортезомиб, мелфалан, преднизолон) в терапии впервые диагностированной множественной миеломы
Причем за процедуру удаляли до 40г циркулирующих СЛЦ. Тем не менее, использовать только экстракорпоральное очищение от СЛЦ при ОПН недостаточно, чтобы снять пациента с гемодиализа. Для этого необходимо сочетание с ХТ. Считается, что удаление 60% СЛЦ может создать условия для восстановления почечной функции. Подтверждением этому являются работы указывающие не только на восстановление почечной функции при ММ и ОПН после ХТ и эктракорпорального очищения крови но и уменьшение морфологических проявлений cast-синдрома по данным биопсии почек до и после лечения. Для точной диагностики cast-нефропатии, которая является основным механизмом поражения почек, необходима их биопсия, которая исключит другие механизмы ОПН и может определить тактику лечения [253].
Таким образом, проблема почечной патологии при ММ, которая является тяжелым осложнение заболевания, в настоящее время получает новое прочтение. Ключевыми факторами современной концепции миеломной нефропатии являются хорошо разработанная теория СЛЦ иммуноглобулинов, методология их определения и роль в патогенезе поражения канальцевого аппарата. Важным является достаточно широкая оснащенность медицинских учреждений аппаратурой для стандартного гемодиализа, что может использоваться для замещения утраченной почечной функции при острой или хронической фазах патологии.
Говоря об эктракорпоральных методах лечения миеломной почки, следует отметить перспективное направление, каким является селективная элиминация опухолевых циркулирующих СЛЦ. Работа в этом направлении была обусловлена необходимостью более эффективного воздействия на СЛЦ, учитывая, что плазмообмен обладает ограниченной эффективностью, а ГД и ПД практически не удаляет СЛЦ из циркуляции. В связи с тем, что исследований по этой проблеме еще недостаточно, говорить о реальном вкладе этого метода в положительное решение данной проблемы пока нет убедительных оснований. Тем не менее, отдельные исследования с использованием гемодиализа с расширенными фильтрационными возможностями дают хорошие результаты по элиминации СЛЦ и повышают шансы пациентов на снятие их с ГД после ОПН.
Одним из главных факторов данной проблемы является внедрение в клиническую практику инновационных противоопухолевых препаратов для лечения ММ. Прежде всего, к ним следует отнести ингибитор протеосомы бортезомиб (велкейд), который обладает высокой противоопухолевой активностью и не обладает токсическим влиянием на почки.
Суммируя вышеизложенное, становится понятным, что основным фактором поражения почек при ММ является миеломная клетка, которая продуцирует СЛЦ даже при интактной молекуле М-протеина. При этом создается предпочечная нагрузка при концентрации свыше 500мг/л токсичных СЛЦ на нефрон, вызывая повреждение эпителия, разрывы базальной мембраны, перитубулярный воспалительный процесс, вязкие преципитаты в канальцах, атрофию нефрона и почечную недостаточность. Лечебные мероприятия должны предусматривать воздействие на все звенья патогенеза этого синдрома. Прежде всего воздействия на миеломную клетку, и препаратом выбора здесь является бортезомиб. Однако, можно использовать и комбинации бортезомиба с дексаметазоном (преднизолоном), циклофосфаном и антрациклином. При ОПН, развившейся при ММ, важно использовать и эктракорпоральную селективную элиминацию СЛЦ, что в сочетании с ХТ позволяет нормализовать концентрацию СЛЦ и создать условия для восстановления функции почек и прекратить диализную зависимость. В тоже время, существует и другая точка зрения, основанная на приоритете ХТ с использованием инновационных препаратов (бортезомиб) и стандартного гемодиализа. В этой связи, следует отметить, что оптимальным подходом лечения ОПН при ММ должно быть сочетание этих методов, так как категории противоопухолевого ответа, который достигается при ХТ инновационными препаратами не подразумевает оценки концентрации СЛЦ. Это означает, что при достижении ответа по указанным категориям, а так же в случаях резистентности , может сохраняться опасная для почек концентрация СЛЦ, что требует эктракорпорального воздействия для их элиминации.
Проведенный аналитический обзор опубликованных результатов исследования по данной проблеме, позволяет сделать вывод о том, что нет исчерпывающей информации относительно инновационных противоопухолевых препаратов при ММ, осложненной почечной недостаточностью. В отечественной литературе имеется небольшое количество публикаций о возможностях снятия пациентов с ГД на сочетанном лечении и отдаленных результатах лечения [254].
Учитывая это предпринято одноцентровое проспективное сравнительное клиническое исследование II фазы, направленное на изучение эффективности бортезомибсодержащих программ лечения ММ, осложненной почечной недостаточностью в сочетании с гемодиализом, с анализои возможности прервать диализную зависимость у этих пациентов и изучить их выживаемость, что по существу позволяет создать программу лечения этого тяжелого осложнения ММ.
Под нашим наблюдение находилось 27 пациентов с ММ, у которых была диагностирована почечная недостаточность на основании повышенной концентрации креатинина в крови и снижения показателей скорости клубочковой фильтрации. Распределение больных по фазам течения болезни показало, что в момент диагноза ММ ПН диагностирована у 21 больного (77,7%). Причем у 2-х из них установлены дополнительные факторы воздействия на почки, не связанные с ММ. В одном наблюдении были применены аминогликозиды по поводу пневмонии, в другом бисфосфонаты в связи с сильными болями в костях. В этих случаях диагностирована олигурическая форма ПН, потребовавшая экстренного применения ГД.
В момент рецидива болезни ПН диагностирована у 5 больных, причем в одном случае это было связано с проведением оперативного вмешательства по поводу перелома бедра. У одного пациента ПН развилась в периоде проведения индукционной ХТ.
Фармакодинимическая оценка применения бортезомиба и программ ВМП и РВП на основании анализа свободных легких цепей иммуноглобулинов сыворотки у пациентов с рецидивной/резистентной множественной миеломой
Во второй группе пациенты не отвечали на 1 курс РВП программы. Среднее значения концентрации ОСЛЦ на 2 и 12 дни исследования достоверно не различались. Сравнительная кинетика ОСЛЦ у 2х-групп пациентов в процессе проведения курса РВП терапии во всех точках исследования достоверно различалась. Это свидетельствовало о закономерности снижения и позитивной противоопухолевой фармакодинамике в 1 группе пациентов. Анализ отдаленных клинических результатов РВП программы был проведен по окончании индукционного периода РВП терапии через 8 месяцев (Ме) после проведения 6 (Ме) циклов лечения (таблица 33). Ответ на лечение был оценен с использованием международной оценочной системы [154].
Кинетика опухолевых свободных легких цепей у 16 пациентов с резистентной/рецидивирующей множественной миеломой в процессе РВП терапии в сравнении с отдаленными клиническими результатами Фармакодинами ка РВП Концентраци я ОСЛЦ на 2день РВП в % кисходной Концентрация ОСЛЦ на12 день РВПв % кисходной Длительност ь РВП-терапии (Ме/мес) Кол-во РВП курсо в (Ме) Ответ после6 курсовРВП(%) 1 линия терапии есть ответ (n=7) 74 +9 36+3,4 8 (6-15) 6 (4-10) 6/7 (85,7%) ВМП9(8-14) нет ответа(n=9) 94,5+4,9 93+6 1/9(11,1%) Установлено, что в группе пациентов, отвечающих на 1 курс РВП-терапии по кинетике ОСЛЦ, отдаленный позитивный результат по международной оценочной системе [154] , был зафиксирован у 6 из 7 пациентов (85,7%). Во второй группе пациентов не отвечающих на 1 курс РВП по кинетике ОСЛЦ отдаленный позитивный результат был зафиксирован у 1 из 9 пациентов (11,1%). Следовательно, положительная фармакодинамика РВП программы, определение в процессе 1 курса РВП терапии по анализу ОСЛЦ имеет прогностическое значение и может предсказывать отдаленный положительный клинический результат в 85,7%. Причем достоверность различий между группами чувствительными и нечувствительными к РВП комбинации устанавливается на 2 день после начала терапии. Следовательно, для данной комбинации лекарственных препаратов падение концентрации ОСЛЦ 26% от исходной через 24 часа от начала лечения может свидетельствовать о целесообразности применения этой комбинации в качестве противорецидивной программы и прогнозировать положительный отдаленный клинический результат с высокой вероятностью. Изучение кинетики НСЛЦ не показало закономерных изменений в процессе курса РВП терапии (таблица 34).
Различия в каждой точке исследования у двух групп пациентов были недостоверны, за исключением 12 дня, что может быть связано с доклиническим и обратимым нарушением функции почек или уменьшением активности Т-супрессоров под влиянием РВП комбинации противоопухолевых препаратов (рисунок 24).
Кинетика СЛЦ неопухолевых антителпродуцентов у пациентов с ММ в зависимости от ответа на 14-дневный курс терапии РВП 1 – есть ответ; 2- нет ответа
Суммарная оценка фармакодинамики 1-го 12-дневного курса лечения бортезомибом и комбинациями ВМП и РВП позволила выявить закономерные изменения (рисунок 25).
Фармакодинамическая характеристика бортезомибсодержащих курсов лечения по динамике концентраций ОСЛЦ у 20 пациентов с рецидивирующей/резистентной ММ, отвечающих на терапию (p1, 2 и p3 0,05) 1-терапия ВМП; 2-терапия РВП; 3-терапия В(бортезомибом). Фармакодинамические кривые имели трехфазный характеру отвечающих на лечение пациентов. Быстрое снижение ОСЛЦ отмечалось через 24 часа (на 2 день) после начала лечения. Со 2 по 5 день лечения снижение ОСЛЦ продолжалось, причем более интенсивное на комбинациях препаратов (ВМП, РВП). С 5 по 9 дни курса отмечено кинетическое плато остаточной опухоли. С 5 по 12 дни курса отмечена третья фаза фармакодинамической кривой, которая характеризовалась второй волной снижения ОСЛЦ, являющейся маркером опухоли. В конечной точке анализа отмечена достоверность различий между бортезомибсодержащими комбинациями и монотерапией бортезомибом. На комбинациях достигалась большая редукция опухоли.
Общим критерием положительной фармакодинамики было снижение ОСЛЦ в пределах 30% на 2 день исследования. Следовательно, этот показатель может свидетельствовать о высокой чувствительность опухоли к применяемым цитостатическим препаратам.
Таким образом, обобщая полученные результаты исследований, представленные в данной главе, следует обсудить главные из них. Прежде всего, метод определения СЛЦ ИГСК хорошо отражает изменения массы опухоли при ММ с интактной молекулой М-протеина. Из 20 исследованных пациентов с ММ с высокой и низкой массой опухоли, которая определялась по оценочной системе Durie et al по ЭФ сыворотки и мочи только у 2 не было корреляций. Это были пациенты с ЛЦММ. Известно, что при этом варианте болезни метод СЛЦ является более точным, чем ЭФ мочи. Учитывая полученные результаты, данный метод был применен для мониторирования остаточной опухоли болезни при различных иммунохимических вариантах ММ и при ММ, осложненной ХПН.
В результате предпринятого анализа было установлено, что определение концентрации СЛЦ через 3-х месячный интервал позволяет определить ранний доклинический рецидив болезни. На основании этого был предложен термин кинетическая активность плато остаточной опухоли, характеристика которого может осуществляться через 3-х месячные интервалы. Диагностика доклинического рецидива осуществляется по селективному нарастанию ОСЛЦ с одновременным измерением k/ -отношения. Неселективный характер увеличения СЛЦ (ОСЛЦ и НСЛЦ) является фактором риска ХПН, что может быть связано с нефротоксичным действием цитостатиков. У пациентов с ММ, осложненной ХПН, находящихся на ГД , противоопухолевый ответ на ХТ сопровождался снижением или стабилизацией НСЛЦ, что расценивалось как фактор благоприятного прогноза в улучшении функции почек. Плазмообмен так же снижал концентрации ОСЛЦ.
Изменений концентрации СЛЦ в процессе 12 дневных курсов ХТ бортезомибом, ВМП, РВП, зафиксированное в наших исследованиях стало возможным в результате короткого периода полураспада СЛЦ, что позволяет определить их концентрацию практически в реальном времени.
В связи с этим был предложен термин фармакодинамическая характеристика противоопухолевых препаратов и их комбинации, так как результаты их взаимодействия с опухолевыми клетками фиксировались через 24 часа после начала лечения. Установлена фармакодинамическая закономерность при применении бортезомибсодержащих программ лечения. Она заключалась в 3-х фазном характере снижения ОСЛЦ: 1 фаза- наибольшего снижения (2-5 дни), 2-фаза- плато (5-9 дни), 3 фаза -вторая волна снижения (9-12 дни).
Важно подчеркнуть, что у пациентов с положительной фармакодинамикой отдаленные результаты (ремиссии) диагностировали в 85,7-100% случаев. Не было достоверных различий в позитивной фармакодинамике между программами, изученными в наших исследованиях, кроме монотерапии бортезомибом на 12 день исследования по сравнению с более высоким эффектом ВМП и РВП.
С практической точки зрения представляется важным тот факт, что у пациентов отвечающих на применение ХТ програмы, факт снижения ОСЛЦ в пределах 25,3% (22%-28%) установлен через 24 часа от начала терапии. По существу речь идет об определении чувствительности опухоли к применяемым препаратам в реальном времени.
Касаясь анализа НСЛЦ в процессе лечения, следует отметить что, полученные результаты позволили расширить наши представления о клинической значимости этого маркера. При этом можно думать не только об изменении функции почек при увеличении их концентрации. Повышение НСЛЦ в процессе лечения может рассматриваться как уменьшение супрессивного влияния Т-регуляторных супрессивных лимфоцитов на гуморальный иммунитет при ММ.