Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 14
1.1. Множественная лекарственная устойчивость, обусловленная активностью транспортных белков . 14
1.2. Роль АВС-транспортеров в развитии резистентности к лечению алкилирующими препаратами и ингибитором протеасомы при множественной миеломе. 24
Глава 2. Материалы и методы исследования 37
2.1. Клиническая характеристика больных. 37
2.3. Исследование экспрессии генов множественной лекарственной устойчивости методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) с применением специфических праймеров к генам МЛУ MDR1, MRP1, BCRP, LRP. 41
2.4. Методика культивирования культур клеточных линий множественной миеломы человека, резистентных к бортезомибу 44
2.5. Оценка цитотоксического влияния лекарственных препаратов в культурах клеточных линий множественной миеломы человека методом МТТ-тест. 45
2.5. Методы статистической обработки результатов исследования. 46
Глава 3. Клиническая характеристика, ответ на противоопухолевую терапию и общая выживаемость пациентов с впервые выявленной множественной миеломой в зависимости от интенсивности экспрессии генов множественной лекарственной устойчивости 47
3.1. Интенсивность экспрессии генов множественной лекарственной устойчивости и клинические проявления впервые выявленной множественной миеломы 52
3.2. Оценка эффективности бортезомиб-содержащих программ лечения в подгруппах высокой и низкой экспрессии генов множественной лекарственной устойчивости 54
3.3. Анализ взаимосвязи экспрессии генов множественной лекарственной устойчивости с общей выживаемостью больных с впервые выявленной множественной миеломой на бортезомиб-содержащем лечении. 60
3.4. Итоги исследования экспрессии генов множественной лекарственной устойчивости у больных с впервые выявленной множественной миеломой. 65
Глава 4. Клиническая характеристика, ответ на противоопухолевую терапию и общая выживаемость пациентов с резистентной/рецидивной множественной миеломой в зависимости от интенсивности экспрессии генов множественной лекарственной устойчивости 68
4.1. Интенсивность экспрессии генов множественной лекарственной устойчивости и клиническая характеристика множественной миеломы резистентной к алкилирующим препаратам. 73
4.2. Эффективность противорецидивных бортезомиб-содержащих программ лечения в подгруппах больных с различной интенсивностью экспрессии генов множественной лекарственной устойчивости . 75
4.3. Анализ взаимосвязи экспрессии генов множественной лекарственной устойчивости с общей выживаемостью больных с множественной миеломой резистентной к алкилирующим препаратам. 80
4.4. Сравнительная оценка экспрессии генов множественной лекарственной устойчивости при впервые выявленной множественной миеломе и в фазе развития резистентности к терапии алкилирующими препаратами. 85
4.5. Интенсивность экспрессии генов множественной лекарственной устойчивости при множественной миеломе, резистентной к бортзомиб- содержащей терапии 90
4.6. Итоги изучения экспрессии генов множественной лекарственной устойчивости у больных с резистентным течением множественной миеломы. 96
Глава 5. Моделирование устойчивости к бортезомибу in vitro в клеточных линиях множественной миеломы человека 100
5.1. Интенсивность экспрессии генов множественной лекарственной устойчивости в клеточных линиях множественной миеломы человека 100
5.2. Выявление генов, ассоциированных с развитием устойчивости к бортезомибу в клеточных линиях множественной миеломы 102
Заключение 108
Выводы 121
Список сокращений 123
Список литературы 125
Приложения 135
- Множественная лекарственная устойчивость, обусловленная активностью транспортных белков
- Оценка эффективности бортезомиб-содержащих программ лечения в подгруппах высокой и низкой экспрессии генов множественной лекарственной устойчивости
- Эффективность противорецидивных бортезомиб-содержащих программ лечения в подгруппах больных с различной интенсивностью экспрессии генов множественной лекарственной устойчивости
- Выявление генов, ассоциированных с развитием устойчивости к бортезомибу в клеточных линиях множественной миеломы
Введение к работе
Актуальность темы. Проблема потери противоопухолевого ответа на проводимую полихимиотерапию остаётся нерешённой задачей в онко-гематологии, несмотря на расширяющиеся возможности фармакотерапии (Бессмельцев СС, 2014; Голенков А.К., 2010; Митина Т.А., 2011). Внедрение в широкую клиническую практику новых классов химиопрепаратов, а также их сочетанное использование не всегда позволяет преодолеть имеющуюся лекарственную резистентность, которая проявляется прогрессией или рецидивом заболевания (Голенков А.К., 2000; Митина ТА., 2010; Бессмельцев С.С, 2014). Детальное изучение механизмов устойчивости даёт возможность не только найти пути преодоления резистентности, но и прогнозировать её развитие и, возможно, обнаружить дополнительные генетические критерии прогноза ответа на лечение. В связи с этим возникает интерес к исследованию этой проблемы при множественной миеломе (ММ) -гемобластозе, который характеризуется выраженными клиническими признаками опухолевой прогрессии, главным из которых является отсутствие ответа на цитостатическую терапию (Голенков А.К., 1995).
Множественная миелома - злокачественное заболевание кроветворной системы -составляет 1% от всех онкологических заболеваний и немногим более 10% среди всех гемобластозов. Ежегодно в России выявляют более 2000 новых пациентов с ММ, и более 1000 из состоящих на учете погибают (Голенков А.К., 2009; Бессмельцев СС, 2013). Введение в практику врачей-гематологов ингибитора протеасомы первого поколения бортезомиба в качестве «золотого стандарта» терапии ММ дало возможность получить около 70- 80% объективных ответов на лечение (Голенков А.К., 2009; Митина Т. А., 2010; San Miguel J.F., et al., 2008; Jagannath S., et al., 2005), но при возникновении рецидивов заболевания, частота достижения ответов на терапию значительно снижается, что сокращает время жизни больных с рецидивом/рефрактерностью заболевания к применению бортезомиба (Голенков А.К., 2010; Митина Т.А., 2010; Berenson J.R. et al., 2006; Richardson P.G. et al., 2003). В этой связи становится актуальным поиск новых биомаркеров раннего прогнозирования развития устойчивости к лечению ММ с использованием принципов трансляционной медицины (Fall D.J. et al., 2014; Jarmoziak К. et al., 2009).
Известно несколько молекулярных механизмов развития множественной
лекарственной устойчивости (МЛУ) при злокачественных новообразованиях, но одной из
самых распространенных причин МЛУ на сегодняшний день считается повышенная
экспрессия и активность транспортных белков семейства АВС (ATP Вinding Сassette),
З
которые способны экспортировать из клетки множество разных веществ, в том числе противоопухолевые препараты (Ставровская А.А., 2003).
В настоящее время в России онкологами и биологами роводится активное исследование лекарственной устойчивости, обусловленной функцией белков-транспортёров при солидных опухолях (Штиль А.А., 2003; Литвяков Н.В., Цыганов М.М., 2016), острых и хронических лейкозах (Панищева Л. А. и др. 2010; Захаров О.Д. и др. 2006; Стромская Т.П. и др. 2008). Однако, сведения об изучении этой проблемы при множественной миеломе немногочисленные (Шушанов С.С, 2016).
Исследованиям механизмов лекарственной устойчивости, связанной с активностью генов/белков, ассоциированных с МЛУ за рубежом также отведено особое внимание. Представленные работы подробно описывают структуру белков (Dean М., Allikmets R., 2001). Однако речь идёт в основном о солидных опухолях (Gottesman М.М., Fojo Т., Bates S.E., 2002; Higgins C.F., 2007), острых лейкозах (Damiani D. et al. 2007; Huh H.J. et al., 2006), или клеточных линиях (Carey S.S. et al., 2008; Dettmer S. Et al., 2016). Много исследований сосредоточено только на одном из возможных генов МЛУ (Mahadevan D., 2006; Robey R.W. et al., 2011) и не имеют связи с клиническими показателями (Sarkadi В. Et al., 2006; Wiberg К. et al., 2009).
Степень разработанности темы. Изучение механизмов развития устойчивости к
бортезомибу и путей их преодоления, в виду своей актуальности, являются предметом
научных исследований ряда отечественных и зарубежных ученых. Изучены некоторые
аспекты формирования устойчивости к ингибитору протеасомы с точки зрения активности
белков АВС-транспортёров на культурах малигнизированных клеток (хронического
миелолейкоза, острого миелобластного лейкоза, эпидермоидной карциномы полости рта,
аденокарциномы молочной железы человека), чувствительных и резистентных к
химиопрепаратам (Панищева ЛА. и др., 2010). Однако, в связи с широким клиническим
применением бортезомиба для лечения ММ, существует повышенное внимание к проблеме
МЛУ-опосредованной резистентности плазматических клеток. Обзорные статьи ведущих
изданий (Abraham J., 2014; Mutlu P. Et al., 2015) освещают неоднозначность имеющихся на
сегодняшний день сведений о роли генов МЛУ в механизмах устойчивости к бортезомибу
при ММ. С другой стороны, практическая медицина требует поиска новых маркеров
прогноза эффективности бортезомиб - содержащей терапии, позволяющих увеличить
эффективность лечения (Fall D.J., 2014). В связи с этим предпринято настоящее
исследование, направленное на изучение экспрессии генов МЛУ в различных фазах течения
ММ с анализом противоопухолевого эффекта лечения бортезомиб-содержащими схемами полихимиотерапии.
Цель исследования. Определить значение интенсивности экспрессии генов MDRJ/ABCBJ, MRP1/ABCC1, BCRP/ABCG2, LRP/A4VP, ассоциированных с развитием множественной лекарственной устойчивости, у больных с множественной миеломой на различных этапах течения заболевания для прогноза эффективности применения бортезомб-содержащих программ терапии в непосредственном и отдалённом периодах.
Задачи исследования
-
Охарактеризовать профиль экспрессии генов, ответственных за развитие МЛУ в группах больных с впервые выявленной ММ и при развитии клинической резистентности.
-
Проанализировать взаимосвязь интенсивности экспрессии генов МЛУ с клиническими характеристиками течения заболевания при впервые выявленной и резистентной/ рецидивной к лечению алкилирующим препаратам ММ.
-
Оценить клиническую эффективность бортезомиб- содержащей терапии в зависимости от интенсивности экспрессии генов МЛУ на различных фазах течения ММ.
-
Выявить гены, ассоциированные с устойчивостью к бортезомиб - содержащим программам полихимиотерапии у больных с ММ, находящихся на различных стадиях чувствительности к ингибитору протеасомы.
-
Изучить изменения интенсивности экспрессии генов МЛУ при развитии устойчивости к бортезомибу на экспериментальной модели культивируемых клеток линий ММ человека.
Научная новизна. Выявлены новые аспекты развития множественной лекарственной
устойчивости, ассоциированной с экспрессией генов, кодирующих синтез белков АВС-
зависимых транспортёров при ММ, а именно: впервые показано, что повышенная
интенсивность экспрессии гена LRP влияет на ОВ пациентов с впервые выявленной ММ на
лечении бортезомиб- содержащими программами лечения, но не влияет на достижение
лучшего противоопухолевого ответа. Также обнаружено, что полученные в результате
культивирования на среде, содержащей бортезомиб, клеточные линии ММ человека,
резистентные к бортезомибу, характеризуются повышением интенсивности экспрессии гена
LRP по сравнению с исходными линиями. В настоящем исследовании впервые обнаружена ассоциация между интенсивностью экспрессии гена MDR1 и количеством парапротеина сыворотки крови в различных фазах течения ММ. Впервые на клиническом материале подтверждено влияние интенсивности экспрессии генов, ассоциированных с развитием МЛУ на непосредственную и отдаленную эффективность лечения ММ бортезомиб-содержащими программами лечения.
Теоретическая и практическая значимость. Полученные в ходе исследования фундаментальные сведения об особенностях экспрессии генов, ассоциированных с развитием множественной лекарственной устойчивости, на различных тапах течения множественной миеломы, исходя из принципов трансляционной медицин, могут быть использованы в клинической практике как дополнительные факторы прогноза эффективности бортезомиб-содержащих программ лечения. Ассоциация между интенсивностью экспрессии гена MDR1 и количеством парапротеина сыворотки крови позволяет формулировать понятие генетического моделирования фармакодинамики, доказанное на клеточной линии и в клиническом анализе. Влияние экспрессии гена LRP на развитие устойчивости к бортезомибу, также может служить основанием для фармакогенетического моделирования сочетаний противоопухолевых препаратов для лечения ММ. В результате исследования созданы клеточные линии ММ человека, резистентные к ингибитору протеасомы первого поколения, которые станут материалом для дальнейшего детального изучения механизмов МЛУ к бортезомибу, а также системой для тестирования новых цитостатических препаратов, предназначенных для лечения тяжелой группы резистентных к бортезомибу пациентов.
Методология и методы исследования. Исследование является фундаментально -клинической работой, направленной на подтверждение гипотезы о причинно - следственной связи экспрессии генов МЛУ и клиническими особенностями течения ММ, а также ответом на терапию бортезомиб-содержащими программами лечения, включая динамику снижения маркера опухоли - парапротеина - и общую выживаемость. Данная гипотеза соответствует принципам трансляционной медицины, направленной на изучение влияния фундаментальных факторов на течение и исходы заболевания. Сочетание фундаментальных и клинических данных увеличивает информационный потенциал исследования и делает доказательными полученные результаты. Выбор главного предмета исследования (экспрессия генов MDRJ, MRPJ, LRP, BCRP) позволяет минимизировать влияние неучтенных факторов на причинно - следственную связь, изучаемую в работе.
Исследованием и включает в себя клинические методы обследования больных с целью подтверждения диагноза, стадирования, оценки ответа на терапию; лабораторные методы (выделение РНК из опухолевых клеток костного мозга, полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией); работу с клеточными культурами; оценку выживаемости клеток в среде, содержащей цитостатический препарат, МТТ методом; математические методы обработки полученных результатов.
Положения, выносимые на защиту
-
Экспрессия генов MDR1/ABCB1, MRP1/ABCC1, BCRP/ABCG2, LRP/MVP обнаружена в опухолевых плазмоцитах при впервые выявленной множественной миеломе. Резистентность заболевания к алкилирующим препаратам обусловлена повышением интенсивности исходной экспрессии изучаемых генов МЛУ в опухолевых клетках.
-
Низкая интенсивность экспрессии мРНК гена MDR1 при впервые выявленной ММ сопровождается усиленным синтезом парапротеина, что является благоприятным условием для высокой эффективности индукционной бортезомиб-содержащей терапии, включающий алкилирующие препараты. Развитие резистентности к алкилирующим препаратам приводит к потере выявленной связи между интенсивностью экспрессией генов МЛУ и синтезом парапротеина.
-
Низкая интенсивность экспрессии генов MDR1 и BCRP является благоприятным фактором прогноза эффективности индукционного бортезомиб-содержащего лечения при впервые выявленной ММ, но не влияет на ОВ больных.
-
Высокая интенсивность экспрессии гена MDR1 у пациентов с клинической резистентностью к алкилирующим препаратам ассоциирована с низкой о бщей выживаемостью. Высокая интенсивность экспрессии гена LRP при впервые выявленной ММ связана с низкой выживаемостью больных на бортезомиб – содержащем лечении.
-
Клеточные линии ММ человека, резистентные к бортезомибу, характеризуются повышением интенсивности экспрессии гена LRP по сравнению с исходными чувствительными линиями. Высокая интенсивность экспрессии гена LRP являться определяющим фактором развития устойчивости опухолевых плазмоцитов к воздействию бортезомиба.
Степень достоверности. Исследование выполнено на клиническом материале, полученном от пациентов в динамике высокотехнологичного лечения с использованием новейших противоопухолевых агентов. Для определения экспрессии генов МЛУ использован метод полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) с применением высокоспецифичных праймеров к мРНК генов MDR1, MRP1, BCRP, LRP, который является достоверным показателем функции гена. Все пациенты, включенные в исследование, обследованы согласно международным клиническим рекомендациям с применением высокотехнологичных методов диагностики (иммунохимической, цитологической, лучевой). Статистическая обработка результатов проводилась при помощи сертифицированных для медицинской статистики, компьютерных программ с вычислением общепринятых показателей достоверности.
Апробация результатов. Материалы диссертации доложены на: Российском национальном Конгрессе «Человек и лекарство» (г. Москва, апрель 2012г., апрель 2013г., апрель 2015г.); Всероссийской научно – практической конференции «Молекулярно-генетические и иммуногенетические методы диагностики в практике врача гематолога» (г. Санкт-Петербург, апрель 2013г.); научно-практической конференции гематологов Московской области (г. Москва, апрель 2013г., апрель 2014г.); Междисциплинарной научно-практической конференции молодых ученых и специалистов (г. Москва, ноябрь 2015г.); V Евразийском гематологическом форуме (г. Санкт-Петербург, апрель 2017г.). По материалам исследования опубликовано 17 печатных работ, в том числе 2 статьи в издании, которое входит в перечень рецензируемых научных журналов и изданий, определенных Высшей аттестационной комиссией.
Внедрение результатов исследования в практику. Сведения, полученные в ходе выполнения работы, используются в клинической практике отделения клинической гематологии и иммунотерапии ГБУЗ МО МОНИКИ им.М.Ф.Владимирского. Субпопуляции клеточных линий, устойчивых к бортезомибу, полученные в процессе исследования, применяются в лаборатории генетики опухолевых клеток ФГБНУ «РОНЦ им.Н.Н.Блохина» в качестве модели резистентной множественной миеломы для детального изучения генетических механизмов развития феномена множественной лекарственной устойчивости.
Структура и объем диссертации. Материал диссертации изложен на 135 страницах машинописного текста и содержит введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследования, 3 главы, отражающие результаты собственных исследований,
Множественная лекарственная устойчивость, обусловленная активностью транспортных белков
Множественная лекарственная устойчивость (МЛУ) – биологический феномен, значительно улучшающий выживаемость опухолевых клеток в условиях воздействия цитостатических препаратов, что в конечном итоге отрицательно сказывается на длительности жизни пациентов со злокачественными новообразованиями. Проявляется МЛУ резистентностью малигнизированных клеток к влиянию различных по структуре и механизму действия лекарственных средств [3; 19; 20]. Особую важность проблема приобретает при новообразованиях кроветворной ткани, когда основным методом лечения злокачественного процесса является применение химиотерапии. Внедрение в широкую врачебную практику новых классов противоопухолевых препаратов, а также их сочетанное использование не всегда позволяет преодолеть лекарственную резистентность, которая клинически проявляется прогрессией или рецидивом заболевания.
Известно несколько молекулярных механизмов развития множественной лекарственной устойчивости (МЛУ), которые условно можно распределять на 2 категории:
1. фармакодинамическая устойчивость - включает в себя клеточные механизмы, направленные на изменение субстрата противоопухолевого агента, нарушение чувствительности злокачественных клеток к проапоптотическим сигналам, повышение репаративной способности ДНК;
2. фармакокинетическая устойчивость развивается за счет препятствия поступления цитостатического средства к мишени за счет элиминации или внутриклеточной инактивации препарата [39; 79]. В опухолевой клетке одновременно может работать несколько механизмов лекарственной устойчивости (так называемый феномен мультифакториальной резистентности) [79], однако чаще всего преобладает один механизм [3].
Резистентность опухолевой клетки к лекарственным средствам может быть первичной (базовой) и вторичной (приобретенной) [24]. Первичная устойчивость характеризуется отсутствием чувствительности опухолевых клеток к химиотерапии в начале лечения. Как правило, первично резистентными бывают опухоли, развивающиеся из нормальных тканей, в которых физиологически экспрессированы защитные механизмы (рак почки, печени, поджелудочной железы). При приобретенной резистентности, злокачественные клетки изначально чувствительны к воздействию химиотерапии, но в процессе лечения теряют устойчивость не только к тем препаратам, которыми проводилось лечение, но и к другим цитостатикам (кросс- резистентность), отличающимся по структуре и механизму действия [24; 52; 81].
Самой распространенной причиной МЛУ на сегодняшний день считается повышенная активность транспортных белков семейства АВС (ATP Вinding Сassette), которые способны экспортировать из клетки множество различных веществ, в том числе противоопухолевые препараты [20; 21]. Повышение активности этих белков - следствие гиперэкспрессии генов МЛУ клетками новообразования [20; 21]. Количество белка в мембране опухолевой клетки зависит от количества мРНК гена, кодирующего данный белок: чем больше мРНК в цитоплазме опухолевой клетки, тем больше белка синтезируется клеткой [25].
АТФ-зависимые транспортеры семейства АВС это молекулярные насосы, большинство из которых осуществляют транспорт субстратов через клеточную мембрану против градиента концентрации, используя при этом энергию, выделяющуюся при гидролизе АТФ [3; 39; 43]. В настоящее время известно около 50 АВС транспортеров, которых подразделяют на 7 подсемейств (A, B, C, D, E, F, G), в зависимости от гомологичности последовательности аминокислот, а также их доменной организации [3; 20; 21; 39]. Функциональные транспортеры, как правило, содержат два трансмембранных домена, которые отвечают за субстратную специфичность. Кроме того, есть два нуклеотид-связующих домена, которые связывают и гидролизуют АТФ, предоставляя энергию для транслокации субстрата [3; 20; 21; 39].
Транспортеры семейства ABC выявляют в стволовых клетках, полученных из нескольких типов нормальных тканей, в том числе и гемопоэтических. Изучается роль таких белков – транспортеров, как Р-гликопротеин (Pgp, он же ABCB1), MRP1 (ABCC1), BCRP (ABCG2) в развитии феномена МЛУ при многих злокачественных заболеваниях, в том числе онкогематологических [10; 22; 34; 52; 55].
Р- гликопротеин (ABCB1) наиболее изученный белок транспортёр подсемейства В. В норме экспрессия гена Р-гликопротеина обнаруживается в организме человека в энтероцитах, гепатоцитах, клетках проксимальных почечных канальцев, и эндотелиоцитах гистогематических барьеров (гематоэнцефалического, гематоовариального, гемотестикулярного и гемоплацентарного) [22; 53]. Физиологическая функция Р-гликопротеина состоит в выведении токсичных веществ и ксенобиотиков из клетки, предупреждая её химическое повреждение [3; 22; 53]. Субстратами Pgp в основном являются гидрофобные молекулы небольших размеров, которые содержат несколько групп доноров электронов [23; 53]. Многие химиотерапевтические препараты, используемые для лечения гематологических заболеваний (доксорубицин, винка-алкалоиды, эпиподофилотоксины), также распознаются опухолевой клеткой в качестве токсина и выводятся из цитоплазмы посредством этого насоса. Повышенная продукция Р-гликопротеина снижает эффективность цитостатиков-субстратов Pgp [3; 19; 23].
P-гликопротеин кодируется геном MDR1, расположенным на длинном плече хромосомы 7 (7q21) [10; 44; 53]. Увеличение количества мРНК MDR1 и как следствие, белка P-гликопротеина, может служить причиной устойчивости злокачественного новообразования к лечению и привести к клинической агрессивности заболевания. Ген MDR1 гиперэкспрессируется в различных солидных опухолях и при злокачественных заболеваниях кроветворной системы. Например, повышенная экспрессия Pgp обнаружена в плохо поддающихся цитостатической терапии солидных опухолях кишечника, почки, надпочечников [22; 68]. Некоторые ранние исследования показали, что до начала цитостатической терапии P-гликопротеин экспрессируется практически при всех видах гемобластозов, в том числе при острых и хронических лейкозах, множественной миеломе и злокачественных лимфомах [10; 22; 40; 75; 100]. Более позднее исследование экспрессии MDR1 показало наличие экспрессии этого гена только у 20–50% больных с острым миелобластным лейкозом (ОМЛ) до начала цитостатического лечения [41]. Одни работы показывают достоверно больший процент достижения полных ремиссий в группе пациентов с ОМЛ без экспрессии P-гликопротеина в опухолевых клетках [10; 104], другими авторами подобного различия не отмечено [22; 67]. При хроническом миелоидном лейкозе обнаружены достоверные различия выживаемости пациентов в зависимости от наличия или отсутствия выброса родамина 123 клетками крови и костного мозга (скорость выведения родамина 123 является косвенным показателем активности Р-гликопротеина) [22].
Существует мнение, что приобретение клинически значимой МЛУ, связанной с повышенной активностью Р-гликопротеина происходит только при тех заболеваниях (например, ОМЛ и ММ), которые подлежат лечению препаратами, индуцирующими МЛУ. Вероятно, под влиянием препаратов-индукторов активности Р-гликопротеина происходит селекция изначально экспрессирующих Р-гликопротеин опухолевых клеток [114]. С другой стороны, поскольку Р-гликопротеин присутствует на мембране нормальных гемопоэтических клеток, также, вполне вероятно, что Р-гликопротеин-положительные гематологические новообразования развиваться в ходе злокачественной трансформации Р-гликопротеин-синтезирующих нормальных гемопоэтических предшественников [103].
MRP - белок, ассоциированный с МЛУ, член подсемейства С ABC транспортеров, впервые обнаружен на клеточной линии мелкоклеточного рака легких резистентной к доксорубицину, которая не экспрессировала P-гликопротеин. Подсемейство С включает в себя 9 белков, но наибольшее значение для развития МЛУ в опухолевых клетках из них имеет белок MRP1/ABCC1 [101], ген которого расположен на хромосоме 16 (регион 16р13.1) [10; 103].
Низкая интенсивность экспрессии мРНК гена MRP выявляется во многих нормальных тканях, в том числе лимфоцитах периферической крови, железах внутренней секреции (надпочечниках и щитовидной железе), поперечнополосатых мышцах, в клетках лимфоидной системы (селезенки и миндалин), пищеварительного тракта (слюнные железы, пищевод, печень, желчный пузырь, поджелудочная железа и кишечник), дыхательных путей (легкие) и органов мочеполовой системы (почки, мочевой пузырь, яички и яичники) [51;82]. В физиологических условиях субстратами ABCC1 являются глутатион, окисленный глутатион, эстроген и лейкотриен C4 [44; 56].
Оценка эффективности бортезомиб-содержащих программ лечения в подгруппах высокой и низкой экспрессии генов множественной лекарственной устойчивости
Пациенты, включенные в исследование, получали индукционное лечение на основе бортезомиба. Выбор программы лечения (VMP, VCP, VMCP) зависел от возраста, коморбидности, индивидуальных особенностей течения заболевания у каждого пациента. При этом, в анализируемых подгруппах применяемые программы распределились одинаково.
У больных подгруппы с низкой экспрессией мРНК гена MDR1 относительно среднего значения по группе (таблица 9), количество парапротеина после лечения уменьшилось на 67% по сравнению с исходным (с 43,9±3,6г/л до 14,3±4,2г/л, p 0,05), что соответствует категории частичной ремиссии. В подгруппе с высокой экспрессией гена MDR1 зарегистрировано недостоверное снижение количества парапротеина на 22% относительно исходного значения, что входит в категорию стабилизации болезни.
Исходя из полученных данных, низкая экспрессия гена MDR1, сопровождающаяся высоким уровнем парапротеина служит показателем благоприятного прогноза лечения бортезомибом пациентов с впервые выявленной ММ, а высокая экспрессия этого гена препятствует достижению ремиссии заболевания.
Анализ непосредственного противоопухолевого ответа на индукционное лечение бортзомиб- содержащими схемами ПХТ в подгруппах пациентов, различающихся по интенсивности экспрессии гена MRP1 (таблица 10) показал достоверное снижение количества М-градиента после терапии в подгруппе с высокой интенсивностью экспрессии этого гена (парапротеин до лечения 32,8±3,9г/л, после терапии – 17,5±5,1г/л, p 0,05). Однако, согласно критериям ответа на терапию EBMT, в обеих подгруппах зарегистрирован минимальный ответ (процент снижения парапротеина 47% в подгруппе высокой интенсивности экспрессии гена и 32% в подгруппе низкой интенсивности экспрессии гена MRP1).
Установлено, что экспрессия мРНК гена MRP1 не имеет самостоятельного прогностического значения для прогноза эффективности индукционного бортезомиб-содержащего лечения при впервые выявленной ММ. Эффективность бортезомиба одинакова при высокой и низкой экспрессии гена MRP1 и не зависит от исходного количества парапротеина.
Анализ противоопухолевого эффекта в подгруппах пациентов, различающихся по экспрессии гена BCRP (таблица 11), показал в подгруппе с низкой экспрессией мРНК достоверное снижение количества парапротеина после индукционного бортезомиб-содержащего лечения на 50% от исходного (с 36,6±3,9г/л до начала терапии до 18,6±5,6г/л после завершения лечения p 0,05), что соответствует частичной ремиссии. В подгруппе с высокой экспрессией мРНК гена BCRP достоверного снижения количества парапротеина не выявлено (процент снижения абсолютного количества парапротеина от исходного составил 30%) -противоопухолевый ответ достигнут в рамках минимального ответа.
Таким образом, низкая экспрессия гена BCRP является прогностически благоприятным фактором для лечения бортезомибом пациентов с впервые выявленной ММ. Гиперэкспрессия мРНК гена BCRP ассоциирована с плохим ответом на бортезомиб-содержащее индукционное лечение. При этом для гена ВСRР не обнаружено ассоциации между интенсивностью экспрессии мРНК и количеством парапротеина до начала терапии.
В подгруппах с различной интенсивностью экспрессией гена LRP не выявлено достоверного изменения количества парапротеина до и после индукционного лечения бортезомиб-содержащими программами ПХТ (таблица 12). Согласно критериям ЕВМТ в подгруппах пациентов с высокой и низкой экспрессией гена LRP относительно среднего показателя, достигнут минимальный ответ.
Данные исследования показали, что интенсивность экспрессии гена LRP не влияет на эффективность лечения бортезомибом при впервые выявленной ММ. Бортезомиб одинаково эффективен при высокой и при низкой экспрессии мРНК гена LRP.
Полученные результаты могут свидетельствовать о том, что в подгруппе больных с высокой экспрессией мРНК гена MDR1 и низкой продукцией парапротеина, применяемая программа лечения оказывала меньшее противоопухолевое действие. Можно предположить, что в этой подгруппе больных бортезомиб действует со сниженной эффективностью – продукция парапротеина ниже и точка приложения для воздействия бортезомиба уменьшена. В то же время, повышенная экспрессия мРНК гена МЛУ в этой же подгруппе больных способствует быстрому выведению алкилирующих препаратов (мелфалана, винкристина, доксорубицина) из клетки, что снижает их противоопухолевый эффект.
При анализе результатов лечения больных в подгруппе с низкой экспрессией мРНК гена MDR1 лучший результат лечения обусловлен синергизмом воздействия бортезомиба при повышенном синтезе парапротеина – мишени ингибитора протеасомы, и достаточным противоопухолевым воздействием алкилирующих препаратов, входящих в комбинацию, за счет сниженного их выведения из клетки белками МЛУ. Выявленные факторы оказывают благоприятные условия для создания эффективной противоопухолевой фармакодинамики используемых схем терапии. Результаты исследования подтверждают ранее известную высокую клиническую эффективность комбинированного применения бортезомиба с алкилирующими препаратами в сравнении с режимом монотерапии [1;15;59; 94] и объясняют обоснованность такого комплексного лечения впервые выявленной ММ.
В подгруппах, разделённых по интенсивности экспрессии гена MRP1, согласно критериям, EBMT достигнут минимальный ответ (процент снижения парапротеина в подгруппе высокой интенсивности экспрессии 47%, в подгруппе с низкой интенсивностью экспрессии гена 32%). Несмотря на то, что по абсолютным значениям М-градиента, в подгруппе высокой интенсивности экспрессии гена зарегистрировано достоверное снижение количества парапротеина после индукционного лечения, экспрессия гена MRP1 не является значимым фактором прогноза лечения бортезомибом при впервые выявленной ММ.
Эффективность противорецидивных бортезомиб-содержащих программ лечения в подгруппах больных с различной интенсивностью экспрессии генов множественной лекарственной устойчивости
Анализ непосредственного противоопухолевого ответа на бортезомиб-содержащую терапию второй и последующих линий лечения по протоколам VMP, VCP, VMCP не выявил прогрессирования заболевания в ближайшем периоде после завершения лечения (таблицы 17, 18, 19, 20).
Полученные сведения дают основание предполагать, что высокая интенсивность экспрессии гена MDR1 не является препятствием для клинической эффективности бортезомиба при резистентном течении ММ. Поскольку одним из механизмов индукции апоптоза в клетках ММ под воздействием бортезомиба является чрезмерный стресс эндоплазматического ретикулума, вызванный протеасомным торможением в клетках с активным синтезом протеина [75], то эффективность бортезомиба в подгруппе высокой интенсивности экспрессии гена MDR1 объясняется высоким уровнем парапротеина в этой подгруппе больных. В подгруппе больных с низкой экспрессией гена MDR1 абсолютное количество парапротеина достоверно ниже, что привело к стабилизации болезни под влиянием бортезомиба.
В подгруппе резистентных/рецидивных больных с низкой экспрессией гена MRP1 (таблица 18) после лечения бортезомиб-содержащими программами полихимиотерапии удалось получить существенное снижение количества парапротеина (на 35% по сравнению с исходным, что соответствует минимальному ответу по критериям EBMT). В подгруппе с высокой интенсивностью экспрессии этого гена после лечения зарегистрирована стабилизация болезни – снижение парапротеина на 22% по сравнению с исходным.
Данные результаты подтверждают концепцию о высокой эффективности бортезомиба в подгруппах больных с высоким абсолютным количеством парапротеина до начала терапии ингибитором протеасомы первого поколения. Интенсивность экспрессии гена MRР1 не оказывает решающего влияния на противоопухолевую активность бортезомиба у пациентов с резистентным течением ММ.
При резистентной/рецидивной ММ непосредственный противоопухолевый эффект в подгруппе с высокой интенсивностью экспрессии гена BCRP (таблица 19) достиг стабилизации болезни (падение количества парапротеина на 15%), а в подгруппе низкой интенсивности экспрессии гена BCRP зарегистрирован минимальный ответ - падение парапротеина на 27% от исходного.
В подгруппах с высокой и низкой экспрессией гена BCRP количество парапротеина до начала лечения одинаковое, а более выраженное снижение количество патологического белка обнаружено при низкой экспрессии гена. Таким образом, экспрессия гена BCRР ассоциирована с непосредственным противоопухолевым ответом на лечения бортезомибом и не зависит от исходного количества парапротеина. Данное предположение послужило основанием для углублённого изучения этого феномена с применением клеточных линий множественной миеломы человека.
Применение бортезомиб-содержащих программ терапии при резистентности/ рецидиве ММ в подгруппах пациентов с различной интенсивностью экспрессии гена LRP (таблица 20) привело к снижению количества парапротеина в подгруппе высокой экспрессии гена на 42%, а в подгруппе низкой экспрессии на 25%.
Таким образом, для гена LRP, как и для генов MDR1 и MRP1, более выраженное снижение парапротеина после лечения ассоциировано с высоким количеством патологического белка до начала терапии бортезомибом. Однако по международным критериям оценки эффективности терапии в подгруппах высокой и низкой экспрессии гена LRP ответ на лечение бортезомибом входит в категорию минимального, что свидетельствует об отсутствии ассоциации между интенсивностью экспрессии гена и эффективностью бортезомиба у пациентов с резистентным течением ММ.
Выявление генов, ассоциированных с развитием устойчивости к бортезомибу в клеточных линиях множественной миеломы
В клинической практике первая оценка эффективности терапии проводится после 2- 4 курсов лечения [7;16], что во временном интервале составляет в среднем от 80 до 100 дней терапии. Для фармакодинамического моделирования устойчивости к бортезомибу in vitro также был выбран временной отрезок не менее 90 дней культивирования клеток на среде, содержащей бортезомиб. На первых этапах для культивации использовали концентрацию препарата, равную IC20, постепенно повышая её до IC50. В полученных клеточных линиях, культивируемых в условиях постоянного присутствия бортезомиба, повторно были определены IC50(рисунок 18) бортезомиба и доксорубицина.
Как видно на рисунке 18, IС50 для бортезомиба в резистентной клеточной линии IM9/Vlk значительно повысилась – с 0,8±0,3х10-8 М в исходной линии до 1,6±0.4х10-8 М в резистентной, тогда как в клеточной линии ММ человека RPMI8226/Vlk, изначально более устойчивой к бортезомибу, IС50 в резистентной линии почти не изменилась (2,7±0,6х10-8 М исходная линия и 3,1±0,4х10-8 М резистентная).
В резистентных к бортезомибу линиях ММ человека снизилась чувствительность клеток не только к бортезомибу, но и к доксорубицину (рисунок 19). В изучаемых клеточных линиях произошло повышение IС50 доксорубицина на равное количество единиц (таблица 27).
В клеточной линии ММ человека IM9/Vlk в условиях культивирования в среде с наличием бортезомиба, снизилась чувствительность в 2 раза как к бортезомибу, так и к доксорубицину. В клеточной линии RPMI8226/Vlk, при одинаковых условиях культивирования, чувствительность к бортезомибу изменилась незначительно, а к доксорубицину снизилась почти в 2 раза. Полученные данные могут свидетельствовать о влиянии бортезомиба на развитие резистентности в доксорубицину.
Следующим этапом работы было определение изменений экспрессии мРНК генов МЛУ в резистентных к бортезомибу клеточных линиях ММ человека (рисунок 20).
Как видно из рисунка 20, экспрессия гена MDR1 обнаружена только в клеточной линии IM9 (столбцы 3 и 4). Интенсивность экспрессии этого гена не меняется с приобретением резистентности к бортезомибу. Клетки RPMI8226 (столбцы 1 и 2) ген MDR1 не экспрессируют ни до воздействия бортезомибом, ни после.
Гены BCRP и MRP1 экспрессированы во всех изучаемых клеточных линиях ММ человека, однако в клеточной линии IM9 интенсивность экспрессии гена BCRP ниже, чем в RPMI8226. Интенсивность экспрессии мРНК генов BCRP и MRP1 также не меняется в резистентных к бортезомибу линиях.
Экспрессия мРНК гена LRP в изучаемых клеточных линиях ММ человека неоднородна. В линии IM9 интенсивность экспрессии этого гена меньше, чем в линии RPMI8226. Вероятно, низкая исходная экспрессия мРНК гена LRP в клеточной линии IM9 и приводит к высокой чувствительности к бортезомибу данной клеточной линии. Однако, с развитием резистентности к бортезомибу в обеих клеточных линиях интенсивность экспрессии гена LRP увеличивается. Видимо, именно повышение интенсивности экспрессии мРНК гена LRP в резистентных к бортезомибу клеточных линиях приводит также к развитию перекрёстной резистентности к доксорубицину, что проявляется снижением чувствительности клеток к этому препарату.
Сведения, полученные в ходе исследования клеточных линий ММ человека дополнили предшествующие результаты об отрицательном влиянии высокой интенсивности экспрессии гена LRP на общую выживаемость больных с впервые выявленной ММ на бортезомиб – содержащем лечении. Совокупность данных позволят сделать вывод о ведущей роли гипреэкспрессии гена LRP для развития устойчивости опухолевых плазмоцитов к бортезомибу.
Исследование экспрессии генов МЛУ в 2-х различающихся по иммунофенотипу клеточных линиях ММ человека RPMI8226 и IM9 показало, что линии разнятся также и по интенсивности экспрессии генов МЛУ, что приближает исследование к клинической практике. В клетках RPMI8226 не обнаружено транскриптов гена MDR1, экспрессия генов MRP1, LRP в них выражена умеренно, а ген BCRР гиперэкспрессирован. Клетки IM9 гиперэкспрессируют MDR1, интенсивность экспрессии MRP1 и ВCRP выражена умеренно, а интенсивность экспрессии гена LRР низкая.
Изучение чувствительности исходных клеточных линий к бортезомибу и доксорубицину показало, что клетки IM9, интенсивно экспрессирующие MDR1 и слабо BCRP и LRP, более чувствительны к бортезомибу, чем клетки RPМI8226, в которых методом ОТ-ПЦР, ген MDR1 не определяется, а экспрессия транскрипта гена LRP выражена умеренно (IС50 0,8±0,3х10-8 М и 2,7±0,6х10-8 М соответственно). Чувствительность к доксорубицину в обеих клеточных линиях была одинакова. Развитие устойчивости к бортезомибу сопровождалось 2-х кратным снижением чувствительности к воздействию доксорубицина и повышением интенсивности экспрессии гена LRP.
Моделирование устойчивости к бортезомибу культур ММ человека, различающихся по интенсивности экспрессии генов МЛУ, впервые показало повышение интенсивности экспрессии гена LRP в резистентных клеточных линиях при стабильной экспрессии MDR1, MRP1 и BCRP. Обнаружено также, что развитие устойчивости к ингибитору протеасомы сопровождается снижением чувствительности к доксорубицину.
Таким образом, в условиях воздействия бортезомиба, происходит отбор плазматических клеток с высокой экспрессией гена LRP, что приводит к повышению устойчивости миеломных клеток не только к бортезомибу, но и к препаратам иного механизма действия, в частности к доксорубицину. Данный факт свидетельствует о ведущей роли интенсивности экспрессии гена LRP для развития резистентности плазматических клеток к бортезомибу.