Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 13
1.1. Клиническая необходимость дополнительных методов тестирования и обработки крови и ее компонентов 13
1.2. Этапы внедрения различных методов редукции патогенов 15
1.3. Описание метода редукции патогенов, основанного на сочетанном действии рибофлавина и ультрафиолета 22
1.4. Исследования токсикологической безопасности технологии, основанной на сочетанном действии рибофлавина и ультрафиолета 26
1.5. Эффективность редукции различных инфекционных агентов технологией, основанной на сочетанном действии рибофлавина и ультрафиолета в цельной крови 29
1.5.1. Оценка эффективности редукции патогенов 29
1.5.2. Результаты исследований редукции патогенов 32
1.5.2.1. Эффективность против вирусов 32
1.5.2.2. Эффективность против бактерий 33
1.5.2.3. Эффективность против простейших 35
1.6. Эффективность подавления пролиферативной активности лейкоцитов в сравнении с гамма-облучением 38
1.7. Качество цельной крови и ее компонентов, полученных из обработанной рибофлавином и ультрафиолетом цельной крови 42
1.7.1. Качество цельной крови 42
1.7.2. Качество эритроцитных компонентов 44
1.7.3. Качество тромбоцитных компонентов 50
1.7.4. Качество плазмы крови 52
1.8. Результаты исследований безопасности и эффективности, проведенных на животных моделях и людях 53
1.8.1. Результаты испытаний, проведенных на животных моделях 53
1.8.2. Результаты клинических исследований, проведенных у людей 55
Глава 2. Материалы и методы исследования. 60
2.1. Лабораторный этап исследования 60
2.1.1. Подготовка образцов лабораторного этапа исследования 60
2.1.2. Проведение лабораторных исследований 61
2.2. Клинический этап исследования 64
2.2.1. Характеристика пациентов 64
2.2.2. Методы обследования пациентов 66
2.2.3. Выполнение лабораторных исследований 66
2.3. Статистическая обработка данных 67
Глава 3. Результаты исследования 69
3.1. Результаты определения лабораторных показателей качества 69
3.2. Результаты определения пролиферации и жизнеспособности лимфоцитов 76
3.3. Оценка клинической эффективности и безопасности трансфузий 79
Глава 4. Обсуждение результатов исследования 84
Выводы 97
Практические рекомендации 99
Список сокращений 100
Список литературы 103
- Этапы внедрения различных методов редукции патогенов
- Качество эритроцитных компонентов
- Результаты определения лабораторных показателей качества
- Обсуждение результатов исследования
Этапы внедрения различных методов редукции патогенов
ТРП перед внедрением в клиническую практику должны отвечать нескольким критериям [215].
1. Достаточная степень редукции широкого спектра гемотрансмиссивных патогенов.
2. Сохранение качества компонентов крови.
3. Не вызывать дополнительных побочных эффектов у реципиентов трансфузий, связанных с обработкой.
Большинство доступных методов редукции патогенов основаны на физико-химическом разрушении структурных элементов патогена или модификации нуклеиновых кислот для предотвращения репликации посредствам химического либо фотохимического воздействия [168]. Эти технологии действуют на широкий спектр инфекционных агентов и лейкоциты, которые могут вызывать иммунологические осложнения.
Исторически сложилось так, что первые методы редукции патогенов были успешно применены на плазме крови человека, в результате чего уже более трех десятилетий трансфузии обработанной плазмы крови и ее продуктов безопасны на предмет передачи HIV, HBV и вируса гепатита С (HCV) [14].
Пастеризация путем нагревания до 60C в течение 10-11 часов инактивирует как оболочечные, так и некоторые безоболочечные вирусы и применяется для производных плазмы крови [9]. Факторы свертывания чувствительны к нагреванию, поэтому для сохранения целостности белков при проведении процедуры используются различные стабилизаторы (обычно сахара или ацетат), которые удаляются после инактивации патогена [131].
Еще два метода термической обработки – нагревание сухим теплом и паровая обработка применяются для лиофилизированных производных плазмы крови [218, 240].
Обработка сольвент-детергент (СД) впервые была описана в 1986г. [106, 193]. В этом процессе предварительно фильтрованная плазма обрабатывается органическим растворителем – сольвентом (например, три-N-бутил фосфатом) и неионным детергентом (например, 1% полиоксиэтилен-октилфенолом, Triton X-100 или Tween 80). Сольвент растворяет липиды из вирусных и бактериальных мембран, а детергент разрушает липидный бислой. Таким образом, их сочетанное действие приводит к разрушению оболочечных вирусов и мембран бактерий [106, 152]. После обработки СД должен быть удален; как правило, для этого используются экстракция или хроматография [70]. В последующем продукты плазмы подвергаются дополнительной обработке (например, термообработке), для удаления безоболочечных вирусов, устойчивых к СД [106, 152].
Фильтрация и нанофильтрация применяются только для предварительно очищенных продуктов плазмы. Диаметр пор фильтра составляет 220нм или 15-50нм для фильтрации или нанофильтрации соответственно. После фильтрации/нанофильтрации продукты плазмы считаются безопасными на предмет передачи простейших и бактерий, но сохранение мелких вирусов и прионов является недостатком этой методики. [9]. Нанофильтрация может применяться для продуктов плазмы, в которых размер белковых молекул не превышает размер пор фильтра и в основном ограничивается факторами свертывания с небольшой молекулярной массой (например, F IX или FVIII) [47].
Все вышеописанные методы редукции патогенов используются в крупных производствах, где происходит заготовка плазменных продуктов из больших пулов плазмы крови.
Начиная с 1990-х годов стали активно развиваться химические и фотохимические методы обработки крови и ее компонентов. Основной мишенью этих методов являлись нуклеиновые кислоты патогенов и лейкоцитов [215].
Большинство современных ТРП применяемых для обработки одного компонента крови имеют в основе фотохимическую реакцию. Именно этот тип ТРП, как было показано, является оптимальным для клеточных компонентов крови [34]. Инактивация патогенов и лейкоцитов такими системами достигается за счет сочетанного действия фотосенсибилизатора и света ультрафиолетового (УФ) или видимого диапазона, которые повреждают нуклеиновые кислоты, предотвращая репликацию клеток [34]. Однако такая обработка должна учитывать потенциально негативное воздействие на качество клеток и белков крови, а также быть нетоксичной, немутагенной и неканцерогенной [96, 214]. Процессы, которые направленны на повреждение нуклеиновых кислот, могут оказывать негативное воздействие на мембраны и белки клеток, а также белки в растворе [96, 214]. Воздействие на белки может привести к ошибкам трансдукции в клетках, нарушению клеточного дыхания и метаболизма, а также структурным изменениям [186].
Один из таких фотохимических методов, который применялся для обработки фильтрованной плазмы, имеет в основе сочетанное действие мителенового синего (МС) и света видимого диапазона (THERAFLEX MB Plasma, Macopharma, Франция). После обработки остаточное количество МС удаляется специальным фильтром. Фильтрация перед обработкой является обязательной, так как МС неэффективен против внутриклеточных патогенов [131]. Хотя данная технология активно применялась в клинической практике, сейчас ее использование снижается из-за риска аккумуляции МС и риска аллергических реакций у пациентов получающих множественные трансфузии [152, 195].
Самые ранние методы редукции патогенов (СД и МС в сочетании со светом видимого спектра), использованные для обработки плазмы крови невозможно использовать для клеточных компонентов крови из-за разрушения мембран клеток [224].
Облучение УФ диапазона длин волн С (THERAFLEX UV-PLATELETS, Macopharma, Франция) относится к методам редукции патогенов физического действия и применялось для обработки концентратов тромбоцитов. Данная технология еще находится на стадии клинических испытаний. Результаты проведенных исследований демонстрируют, что технология оказалась менее эффективна, чем методы, использующие фотосенсибилизатор, и оказывала большее влияние на функцию свертывания. [195, 210, 217].
В одной из ТРП фотохимичексого типа для плазмы и тромбоцитных концентратов - INTERCEPT (Cerus Corporation, США) амотосален вещество, относящее к группе псораленов, выступает в качестве фотосенсибилизатора и нековалентно связывается с пиримидными основаниями ДНК или РНК. Последующее воздействие УФ спектра А (320 400 нм) превращает нековалентную связь в ковалентную, предотвращая репликацию дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) и блокируя транскрипцию рибонуклеиновой кислоты (РНК). После обработки амотасален должен быть удален из компонента крови из-за его высокой токсичности [229]. Данная технология хорошо зарекомендовала себя в клинической практике как безопасная и эффективная в плане профилактики большого количества гемотрансимиссвных инфекций [56, 124, 246]. Однако, данная ТРП менее эффективна против некоторых вирусов и неэффективна против прионов [77].
Разработка ТРП для эритроцитных компонентов представляла значительные трудности из-за хрупкости самих клеток и поглощения света гемоглобином [158].
В различные исторические периоды развития трансфузионой медицины функцию редукции патогенов в эритроцитсодержащих компонентах крови приписывали отмыванию (с предварительным замораживанием и без) [163, 220, 238], фильтрации [139]. Изучалось влияние гамма- [130, 237] и УФ-облучения [153, 194] на инфекционные агенты и даже предпринимались попытки использовать озон для инактивации патогенов [88-89, 243].Так как спектр поглощения света гемоглобином включает длины волн до 600нм, развивали идеи использования фотосенсибилизаторов и источников света с большей, чем 600нм длинной волны [72, 119, 123, 147, 171, 175-176, 222]. Эти попытки по различным причинам не увенчались успехом.
Использование фотохимического метода, основанного на МС и воздействии светом видимого диапазона на эритроцитные компоненты, приводило к выраженному повреждению мембран клеток, а также неспецифическому связыванию IgG и альбумина с поверхностью эритроцитов [208, 245].
Качество эритроцитных компонентов
Обработка Рф+УФ не вызывала изменений иммунофенотипа, концентрации или содержания гемоглобина в эритроцитах, а также не демонстрировала индукцию иммуногенности в прямом антиглобулиновом тесте и в перекрестных тестах на совместимость [51, 252].
Концентрация калия увеличивалась в процессе хранения, а концентрация натрия снижалась; полученные значения достоверно отличались от необработанных образцов и соответствовали показателям гамма-облученных эритроцитов [51-52, 58-59, 212, 252]. Tran и соав. обнаружили достоверные различия в концентрации калия и натрия между гамма-облученной ЭВ и ЭВ из Рф+УФ -обработанной цельной крови с 7 по 21 день хранения. При этом динамика высвобождения калия из клеток была одинакова: медленный выход калия после 7 дня хранения с последующим плато концентрации к 21 дню. Несмотря на статистически достоверные различия в концентрации калия, полученные в данном исследовании значения, не являются клинически значимо различными, что говорит об аналогичном риске посттрансфузионной гиперкалиемии после обоих методов обработки [235].
Возможно, обнаруженные изменения в концентрации калия и натрия связаны с нарушенной работой Na/K-обменника (АТФ-азы) не только из-за истощения АТФ, но так же, как и у гамма-облученных клеток, с непосредственной утратой его функции [166].
В исследовании Schubert и соав. не обнаружено статически значимых различий в динамике снижения рН и продукции лактата, потребление глюкозы в ЭВ, полученной из цельной крови, обработанной Рф+УФ, было несколько ниже, чем в необработанной ЭВ, но эти различия не достигли статистической значимости [212]. Cancelas и соав. обнаружили более низкую концентрацию лактата в ЭВ в конце хранения, но это не сопровождалось различиями в значении рН, pCO2 и концентрации глюкозы [52].
Концентрация АТФ прогрессивно снижалась в процессе хранения [52, 197, 212] и была статистически значимо ниже во все дни хранения в группе, обработанных Рф+УФ ЭВ, по сравнению с необработанным контролем [197, 212]. Гидролизация АТФ и накопление аденозинмонофосфата (АМФ) и аденозиндифосфата (АДФ) усиливались с применением гамма-облучения и обработки Рф+УФ, по сравнению с необработанными эритроцитами [58].
Гемолиз увеличивался во время хранения как в обработанных Рф+УФ образцах, так и в контрольной эритроцитной массе. Уровень гемолиза на 35 и 42 дни хранения был значительно выше в единицах, обработанных Рф+УФ, которые подвергались воздействию более высоких доз энергии 80 и 110 Дж / мл эритроцитов. [97]. Концентрация свободного гемоглобина была статистически значимо выше уже на 5 день хранения в группе образцов ЭВ, хранившихся в растворе SAGM, полученных из обработанной Рф+УФ цельной крови, по сравнению с необработанной ЭВ [197]. В другом исследовании было продемонстрировано, что значения гемолиза в эритроцитной массе, полученной из обработанной Рф+УФ цельной крови, было выше не только по сравнению с необработанным контролем, но и по сравнению с гамма-облученными эритроцитами и значительно возрастало после 21 дня хранения [58-59]. Tran и соав. обнаружили достоверные различия в гемолизе по сравнению с гамма-облученными эритроцитами уже на 14 день хранения [235].
Уровень гемолиза оставался ниже 0,8% на протяжении 21 дня хранения в добавочном растворе AS-III [212], а в растворе SAGM - в течение 14 дней хранения [252].
Кривые осмотической резистентности Рф+УФ-обработанных эритроцитов были аналогичны кривым контрольных необработанных эритроцитов на протяжении 28 дней хранения [51, 59, 97], но значительно ухудшились к 42 дню хранения и имели значения хуже, чем гамма-облученные эритроциты [59].
ЭВ, полученная из цельной крови, обработанной Рф+УФ, показала более выраженный рост значения гематокрита и показателя среднего объема эритроцита (MCV) на 28 день хранения по сравнению с необработанными и гамма-облученными эритроцитами [59]. Schubert и соав. также описывают увеличение значения MCV, которое достигло статистической значимости по сравнению с необработанной ЭВ на 3 неделе хранения [212]. Увеличение объема эритроцитов уже после 4 дня хранения по сравнению с необработанными образцами обнаружили Qadri и соав. [197]. Результаты этих работ свидетельствуют о том, что обработка Рф+УФ вызывает выраженный отек клеток.
Обработка Рф+УФ, как и гамма-облучение, вызывала морфологические изменения, которые были более выражены в эритроцитах, обработанных Рф+УФ [58-59].
Обработка Рф+УФ усиливала микровезикуляцию мембраны эритроцитов, в то время как микровезикуляция необработанных и гамма облученных эритроцитов была сопоставима [58-59]. Qadri и соав. описывают повышенную микровезикуляцию уже на 5 день хранения по сравнению с необработанной ЭВ [197].
Экспрессия фосфатидилсерина (ФС) достигла статистически значимых различий с необработанной группой образцов после 21 дня хранения [197, 212]. В экспериментах «энергетического стресса», в которых проводилась инкубация эритроцитов в растворе Рингера без глюкозы, было продемонстрировано, что уже после 4 дней хранения экспрессия ФС значительно выше на эритроцитах, полученных из обработанной Рф+УФ цельной крови, чем на необработанных эритроцитах, что говорит о большей склонности к эритроптозу [197]. Также в эритроцитах, полученных из цельной крови, обработанной Рф+УФ, обнаружена повышенная активность цитозольного кальция и сфингомиелиназы. Эти два механизма независимо друг от друга усиливают экспрессию ФС на эритроцитах [197].
Экспрессия CD47 - поверхностного белка, который защищает эритроциты от фагоцитоза in vivo, не различалась по сравнению с необработанными эритроцитами [197]. Тоже самое касается фосфолирирвания р38-киназы, которая участвует в эритроптозе [197].
Концентрация 2,3-дифосфоглицерата (ДФГ) быстро снижалась после 5 дней хранения [197], но не отличалась между группами ЭВ, полученной из обработанной Рф+УФ крови и необработанной ЭВ [197].
Влияние на профиль мембранных белков оказалось более выраженным у Рф+УФ-обработанных эритроцитов, по сравнению с необработаными и гамма-облученными эритроцитами [58-59]. Не было обнаружено биологически значимых изменений экспрессии белка с 5 по 28 день хранения, что аналогично осмотической резистентности эритроцитов, и предполагает, что целостность мембраны не может быть серьезно изменена в течение 28 дней хранения. Гамма-облучение вызвало незначительные изменения протеинового профиля на мембране эритроцитов. Эритроциты, полученные из Рф+УФ-обработанной крови, демонстрируют выраженное снижение уровня мембранного пероксиредоксина-2, каталазы и 20S-протеасомы по сравнению с необработанными и гамма-облученными эритроцитами [59].
Мембранный пероксиредоксин-2 - биомаркер липопероксидации хранивщихся эритроцитов [205, 239], играет важную роль в обеспечении выживания эритроцитов в условиях окислительного стресса [122, 146] . Каталаза обеспечивает нейтрализацию экзогенных окислителей в эритроцитах [167]. Протеасомы удаляют окисленные белки с помощью АТФ и убиквинтин-независимого механизма, обеспечивая защиту от окислительного повреждения [64]. Обнаруженные изменения свидетельствуют в пользу того, что обработка Рф+УФ снижает способность эритроцитов защищаться от липопероксидации и окисления белка, а также способности удалять окисленные белки, чтобы свести к минимуму их цитотоксичность [59]. Поскольку белки, участвующие в реакции окислительного стресса, также поддерживают целостность мембраны эритроцитов, была проанализирована взаимосвязь между наблюдаемыми изменениями в профиле мембранного белка и гемолизом. Снижение экспрессии пероксиредоксина-2, каталазы и 20S-протеасомы необработанных, гамма-облученных и Рф+УФ -обработанных эритроцитов коррелировало с повышением гемолиза на 28-й день хранения [59].
Дополнительно повышенная активность перекисного окисления липидов после обработки Рф+УФ может подтверждаться снижением концентрации восстановленного глутатиона (GSH) по сравнению с необработанным контролем, но в исследовании Qadri и соав. различия не достигли статистической значимости [197].
Таким образом, индукция перекисного окисления, вызванная обработкой Рф+УФ, приводит к целому ряду неблагоприятных событий: повреждение мембраны и потеря ее частей в виде везикул, экстернализации ФС, снижению деформабельности эритроцитов, которое выражается в худшей резистентности эритроцитов к осмотическому стрессу, в большей выраженности гемолиза. Микровезикуляция мембраны также приводит к изменению морфологии клеток.
В эксперименте с отмыванием эритроцитов, полученных из обработанной Рф+УФ цельной крови, было показано, что полученная ЭВ сохраняет качества, отвечающие критериям AABB в течение 24ч после отмывания, но выраженность гемолиза возрастает во время хранения, поэтому рекомендуется использовать отмытую ЭВ как можно скорее [118].
Большой интерес представляет работа Schubert и соав, в которой они оценивали качество эритроцитов, полученных из цельной крови, обработанной Рф+УФ в условиях деоксигенации. Было показано, что при проведении редукции патогенов по технологии Рф+УФ с предварительной деоксигенацией в процессе дальнейшего хранения обнаруживаются более низкие показатели гемолиза и микровезикуляции. Эти данные еще больше подчеркивают роль окислительного стресса как основного механизма индуцирующего более выраженное повреждение эритроцитов. Эта работа открывает интересные возможности для дальнейшего развития технологии, однако требуется оценка влияния деоксигенации на инактивацию патогенов. [213].
Несмотря на ряд возникающих под действием Рф+УФ изменений эритроцитов, на основании исследования, проведенного на 61парных образцах лейкоредуцированных эритроцитов было продемонстрировано, что все критерии приемлемости, основанные на стандартах AABB, были удовлетворены: гемолиз оставался ниже 1%, рН был больше или равным 6,2, сохранность эритроцитов после лейкоредукции превышало 85% и перекрестные тесты с аутологичной плазмой были совместимы [252]. Таким образом, эритроцитные компоненты сохраняют качество пригодное для клинического использования, которое, в том числе, зависит от консервирующего раствора.
Результаты определения лабораторных показателей качества
Показатели фильтрованной цельной крови обеих групп исследования до применения соответствующих методов обработки не отличались по всем исследованным параметрам (Таблица 3). Количество лейкоцитов после лейкофильтрации во всех образцах было ниже рекомендованного Советом Европы предельного уровня 1106/Ед [6] и не отличалось между сравниваемыми группами как в цельной крови, так и в ЭВ в день 0.
Усредненные значения всех исследованных параметров для контрольных (n=25) и экспериментальныхх (n=25) образцов ЭВ на разных сроках хранения представлены в Таблице 4.
Общая концентрация гемоглобина в ЭВ не изменялась на протяжении хранения и не отличалась между группами.
Значение гематокрита (Рисунок 4) статистически значимо увеличивается в процессе хранения в контрольной группе на 14 день (р 0,0001), а в группе Рф+УФ на 7 день (р=0,02), по сравнению с показателями в день 0. Достоверные различия между группами выявлялись с 7 дня (р=0,03) и сохранялись до конца периода наблюдения (в день 14 р=0,002, в день 21 р=0,0002).
Концентрация свободного гемоглобина и уровень гемолиза (Рисунок 5) достоверно увеличивались в каждом временном интервале в обеих группах и достоверно различались между группами начиная с 14 дня хранения (для свободного гемоглобина р=0,0003, для гемолиза р=0,0004). На 21 день хранения в 9 образцах (36%) экспериментальной группы процент гемолиза был равен или превышал 0,8%. В контрольной группе уровень гемолиза ни в одном из образцов не достиг порогового уровня за все время наблюдения.
Концентрация внеклеточного калия (Рисунок 6) значительно увеличивалась в каждом временном интервале, но не различалась между группами.
В процессе хранения наблюдается прогрессирующее снижение значения рН. Между группами статистически достоверные различия значения рН (Рисунок 6) обнаруживались на 7 (р=0,02) и 14 (р=0,002) день хранения с более низкими показателями в группе Рф+УФ, но к 21 дню хранения эти различия нивелировались (р=0,1).
Концентрация внеклеточной глюкозы (Рисунок 7) в день 0 оказалась достоверно выше в контрольной группе (р=0,0002). Эти различия сохранялись на протяжении всего хранения, хотя несколько сглаживались к 21 дню (день 7 р 0,0001; день 14 р=0,001; день 21 р=0,03).
Концентрация лактата (Рисунок 7) была статистически значимо ниже в экспериментальной группе образцов начиная с 7 дня хранения (р 0,0001), и эти различия сохранялись до конца периода наблюдения (день 14 р 0,0001; день 21 р=0,006).
Непосредственно после обработки осмотическая резистентность (Рисунок 8) статистически значимо ухудшалась в обеих группах по сравнению с цельной кровью (в экспериментальной группе р=0,046; в контрольной группе р=0,006). В контрольной группе изменения показателя осмотической резистентности на протяжении всего периода хранения не достигли статистической значимости по сравнению с показателями в день 0 после обработки. В группе образцов, обработанных Рф+УФ, осмотическая резистентность значимо ухудшалась между 7 и 14 (р=0,005), а также 14 и 21 днями (р=0,005) хранения. Осмотическая резистентная в экспериментальной группе была достоверно хуже, по сравнению с контрольной группой уже с 7 дня хранения (р=0,002) и продолжала ухудшаться на протяжении периода наблюдения. В то же время ширина распределения эритроцитов по осмотической устойчивости (Рисунок 8) достоверно не различалась между группами ни в одной из контрольных точек. Непосредственно после обработки значение ширины распределения не изменялось в обеих группах, однако на 7 день хранения определялось достоверное увеличение значения ширины распределения (р 0,0001 для обеих групп). В последующем ширина распределения в экспериментальной группе значимо увеличивалась между 7 и 14 днем хранения, а в контрольной группе между 7 и 21 днем.
Непосредственно после обработки концентрация GSH снижалась, а концентрация АТФ повышалась (Рисунок 9). В экспериментальной группе эти изменения достигли статистической значимости (для АТФ р=0,05, для GSH р=0,03), но не в контрольной группе. Концентрации АТФ и GSH не отличались между группами на протяжении всего периода наблюдения. Интересно, что статистически значимое снижение концентрации АТФ и GSH по сравнению с показателями полученными в день 0 в группе Рф+УФ отмечалось на 14 день хранения (для АТФ р=0,02; для GSH р=0,014), а в контрольной группе только на 21 день (для АТФ р=0,007, для GSH р=0,001).
Экспрессия ФС (Рисунок 10), измеренная посредством процента эритроцитов, связавших аннексин V, достоверно не менялась после обработки по сравнению с показателями цельной крови в обеих группах. В контрольной группе обнаружено достоверное увеличение экспрессии ФС на 14 день хранения, по сравнению с днем 0 (р=0,016), а в группе Рф+УФ только на 21 день (р=0,008). Статистически значимые межгрупповые различия обнаружены только на 21 день хранения с большими показателями в экспериментальной группе (р=0,003).
Все образцы как экспериментальной, так и контрольной групп были отрицательны на наличие бактериальной культуры в день 0 и день 28.
Обсуждение результатов исследования
Первоочередной задачей нашего исследования было определить качество ЭВ, полученной из обработанной Рф+УФ цельной крови, и сроки, в течение которых ЭВ отвечает всем критериям качества Совета Европы [6] и Российской Федерации [10] и может безопасно применяться для трансфузий. Для решения этой задачи мы провели ряд исследований, оценивающих качество ЭВ, обеспечивающих безопасность трансфузий, а также показателей, которые, как было продемонстрировано в других исследованиях, влияют на выживаемость эритроцитов после трансфузии.
На сегодняшний день продолжаются споры по поводу того, какие пациенты имеют высокий риск развития птРТПХ, а эффективные методы лечения данного осложнения не разработаны, поэтому до сих пор птРТПХ является фатальным осложнением в абсолютном большинстве случаев [16, 236]. Единственным эффективным методом профилактики птРТПХ является облучение компонентов крови ионизирующим излучением. Эксплуатация источников ионизирующего излучения сопряжена с рядом проблем: необходимость специальных помещений для установки аппаратуры, требования безопасности при установке и использовании, сложность обслуживания, необходимость регулярного контроля отсутствия радиоактивной утечки. В современных условиях также необходимо учитывать тот факт, что используемые источники ионизирующего излучения могут быть мишенью террористских атак.
Аппаратура технологии Рф+УФ имеет в качестве источника облучения безопасные для человека и окружающей среды УФ-лампы. Сам процесс облучения происходит внутри аппарата, через который не проходят волны УФ-излучения. Комплекты для обработки Рф+УФ не содержат токсичных веществ. Эксплуатация и обслуживание аппаратуры технологии Рф+УФ не требуют особых условий и требований безопасности. Поэтому второй, но не менее важной задачей нашего исследования было определить возможность применения данной технологии как альтернативы облучению компонентов крови.
В лабораторном этапе исследования в ЭВ были обнаружены дегенеративные изменения, которые происходят после донации, т.е. ex vivo, в компонентах крови и обозначаются термином «повреждение в процессе хранения». Этот процесс демонстрирует прогрессирующую деградацию компонентов крови, которая происходит при последовательных манипуляциях (сбор, лейкофильтрация, замораживание, размораживание и др.) [18, 169]. Применение в производственной цепи дополнительных методов обработки, таких как облучение и редукция патогенов усиливают повреждение компонентов крови [113].
В обеих сравниваемых группах были обнаружены: прогрессирующее снижение pH, концентрации глюкозы, АТФ, GSH; повышение концентрации лактата, внеклеточного калия, свободного гемоглобина, уровня гемолиза, гематокрита. Для описания причинно-следственных аспектов этих изменений необходимо обратиться к особенностям метаболизма эритроцитов.
Гликолиз (путь Эмбдена-Мейерхофа) (Рисунок 18) является единственным источником энергии для эритроцитов. В этом процессе происходит расщепление глюкозы до лактата или пирувата и протонов, с целью получения АТФ [18]. Регуляция гликолиза сложна. С одной стороны, накапливающиеся протоны повышают кислотность среды, и по механизму обратной отрицательной связи ингибируют гексокиназу и фосфофруктокиназу. Это приводит к замедлению гликолиза и прогрессирующему снижению продукции АТФ. А с другой стороны, низкое значение рН стимулирует активность фосфатазы, а активность мутазы ингибируется, что приводит к быстрому истощению 2,3-ДФГ и увеличению производства АТФ[18]. Поэтому кислотность среды в процессе хранения имеет большое значение: при рН более 7,2 фермент ДФГ-мутаза-фосфатаза превращает почти весь 1,3-ДФГ в 2,3-ДФГ, лишая клетку АТФ; при рН ниже 6,4 активность гексоксикиназы и фосфофруктокиназы слишком низка для поддержания продукции АТФ. Таким образом, продукция АТФ происходит в узком диапазоне рН от 6,4 до 7,2 [18].
Согласно полученным нами данным в группе образцов, обработанных Рф+УФ с момента заготовки ЭВ, была достоверно более низкая концентрация глюкозы. Мы считаем, что причиной этого является использование ручного фракционирования в отличие от образцов контрольной группы, для которых применялось автоматическое фракционирование. Вероятно, именно это стало причиной меньшего введения консервирующего раствора SAGM в образцы экспериментальной группы.
Продукция лактата также была значимо снижена в патоген-редуцированных образцах, что, вероятно, является результатом сниженной активности потребления глюкозы в данной группе, которое ранее было описано и в других исследованиях [52, 212], а не исходно ее низкой концентрации по сравнению с контрольной группой.
Хотя продукции лактата была выше в контрольной группе, значение рН среды оказалось ниже в экспериментальной группе в середине хранения. Нивелирование различий значения рН между группами к концу периода наблюдения, вероятно, является следствием большей активности гликолиза в контрольной группе.
Все антикоагулянты и консервирующие растворы имеют кислую среду. Поэтому после донации рН венозной крови, резко снижается от 7,35 до 7-7,2. Этот резкое снижение рН приводит к всплеску продукции АТФ [18]. Этим объясняется повышение концентрации АТФ в ЭВ в день 0, по сравнению с цельной кровью.
В процессе хранения концентрация АТФ прогрессивно снижалась, и примечательно, что в экспериментальной группе статистически значимое снижение концентрации АТФ происходило раньше, чем в контроле по сравнению с показателями в день 0. Хотя между группами существовали различия в концентрации АТФ, они не достигли статистической значимости. Эта находка может иметь важное клиническое значение, поскольку, как было показано, концентрация АТФ прямо коррелирует с посттрансфузионным восстановлением и выживаемостью эритроцитов [50-52].
Низкая температура хранения помимо снижения активности гликолиза [207] отключает натрий-калиевый насос (Na-K-АТФазу), работа которого также зависит от АТФ. В результате калий по градиенту концентрации медленно вытекает из эритроцитов во внеклеточное пространство [113]. Высокая концентрация внеклеточного калия может иметь клинические последствия: стать причиной аритмии и внезапной сердечной смерти [101]. Согласно нашим данным теоретически частота посттрансфузионной гиперкалиемии и ее последствий после трансфузии ЭВ, полученной из Рф+УФ-обработанной цельной крови, не будет превышать таковую, чем при трансфузии, облученной ЭВ, соответствующих сроков хранения.
Как известно, экстернализация ФС является признаком эритроптоза (запрогромированной гибели эритроцитов) [140-141], может стать причиной быстрого их клиренса из циркуляции после трансфузии [25, 92] и вносить вклад в прокоагулянтную и провоспалительню активность эритроцитов in vivo [114-115, 154]. В нашем исследовании средний процент связывания аннексина V не превышал 1% во все дни хранения в обеих группах. По сравнению с показателями, полученными в день 0, в контрольной группе повышение экспрессии ФС на эритроцитах наблюдалось раньше, чем в экспериментальной, а именно на 14 день хранения. Также именно на 14 день хранения обнаруживались значимые различия в уровне гемолиза, который был более выражен в экспериментальной группе. Возможно, различия в экспрессии ФС связаны с тем, что в экспериментальной группе эритроциты (вероятно, наименее устойчивые популяции) подвергались большему разрушению, а на оставшихся, более устойчивых клетках, экспрессия ФС в среднем оказалась ниже, чем в контрольной группе, в которой выжило большее количество клеток к 14 дню. Как было продемонстрировано в других исследованиях [197, 212], достоверное увеличение экспрессии ФС на обработанных Рф+УФ эритроцитах происходит на поздних сроках хранения, в нашем случае на 21 день.