Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1. Острое повреждение почек в дебюте множественной миеломы 11
1.2. Критерии диагностики острого повреждения почек и хронической болезни почек 13
1.3. Биопсия почки при множественной миеломе 14
1.4. Миеломная каст-нефропатия 18
1.4.1. Патогенез миеломной каст-нефропатии 18
1.4.2. Морфологические признаки миеломной каст-нефропатии 20
1.5. Эпителиально-мезенхимальная трансформация эпителиальных клеток почечных канальцев – важный патогенетический фактор развития интерстициального фиброза и тубулярной атрофии при миеломной каст-нефропатии 23
1.5.1. Экспрессия Е-кадгерина, виментина и альфа-гладкомышечного актина в норме и при патологии 26
1.6. Морфологические изменения в биоптатах почек и их значимость в обратимости острого повреждения почек с потребностью в диализе при миеломной каст-нефропатии 28
Глава 2. Материалы и методы исследования 31
2.1. Общая характеристика работы 31
2.2. Методы исследования 33
2.2.1. Морфологическое исследование биоптатов почек 33
2.2.2. Иммуногистохимическое исследование нефробиоптатов 36
2.2.3. Статистический анализ 38
Глава 3. Характеристика больных и анализ данных 39
3.1. Общая характеристика больных 39
3.2. Результаты терапии больных миеломной каст-нефропатией с острым повреждением почек 3 стадии с потребностью в диализе 45
3.3. Анализ общей выживаемости 47
Глава 4. Результаты исследования 50
4.1. Результаты световой микроскопии нефробиоптатов у больных 50
4.2. Результаты иммуногистохимического исследования биоптатов почек 72
4.3. Сопоставление морфометрических данных состояния канальцевого аппарата почки при стандартной световой микроскопии и иммуногистохимическом исследовании 78
4.4. Сопоставление результатов экспрессии иммуногистохимических маркеров с почечным ответом на противомиеломную терапию 79
4.5. Суммарное прогностическое значение площади фиброза интерстиция и экспрессии Е-кадгерина в достижении почечного ответа на противомиеломной терапии 83
4.6. Сопоставление результатов морфологического и иммуногистохимического исследований биоптатов почек у пациентов с острым повреждением почек 3 стадии с и без потребности в диализе до начала противомиеломной терапии 86
Глава 5. Обсуждение 88
Заключение 95
Выводы 96
Практические рекомендации 97
Благодарность 97
Список литературы 98
Приложения 98
- Биопсия почки при множественной миеломе
- Морфологические изменения в биоптатах почек и их значимость в обратимости острого повреждения почек с потребностью в диализе при миеломной каст-нефропатии
- Результаты световой микроскопии нефробиоптатов у больных
- Сопоставление результатов морфологического и иммуногистохимического исследований биоптатов почек у пациентов с острым повреждением почек 3 стадии с и без потребности в диализе до начала противомиеломной терапии
Биопсия почки при множественной миеломе
Биопсия почки – инвазивный метод исследования, заключающийся в получении столбика ткани почки. Адекватность забора материала, грамотное его фиксирование и обработка/окрашивание являются ключевыми моментами для диагностики [20, 85]. Противопоказанием к выполнению биопсии почки являлся повышенный риск кровотечения, а также единственная почка [85]. По данным литературы информативность данного исследования составляет 92,8%, а риск кровотечения после биопсии не превышает 5% [59, 83, 146].
Исследование биоптата почки позволяет установить морфологический диагноз, однако оценка степени выраженности патологических изменений проводится полуколичественным методом и поэтому в определенной мере субъективна. В большинстве общепринятых морфологических классификаций используются критерии, основанные на полуколичественном анализе [38, 144, 145, 147, 154].
При гистологическом исследовании нефробиоптата можно увидеть капсулу, состоящую из коллагеновых и эластических волокон и слоя гладких мышц. Под капсулой располагается корковое вещество почки, которое содержит в себе нефроны и соединительнотканные прослойки между ними. Нефрон – структурная единица почки, включающая в себя клубочек, который вместе с капсулой Шумлянского–Боумена образует почечное тельце, и канальцы (проксимальные извитые и прямые, петля Генле, дистальные извитые и прямые и собирательные трубочки). Общее количество нефронов прямо связано с весом при рождении, уменьшается с возрастом и может влиять на развитие артериальной гипертензии и прогрессирование ХБП [85].
Проксимальные и дистальные канальцы несут разную функциональную нагрузку: в проксимальных канальцах происходит реабсорбция белков, углеводов, в дистальных – преимущественно воды и солей. В связи с этим, они имеют разную морфологическую структуру. Общая длина проксимальных и дистальных канальцев 1,5–2,3 мм. Диаметр проксимальных канальцев больше, около 60 мкм, по сравнению с дистальными (20–50 мкм), длина проксимального канальца составляет около 1,0–1,5 мм. Эпителий проксимальных канальцев каемчатый, имеет микроворсинки («щеточную кайму»), базальную исчерченность, а также мутную цитоплазму из-за пиноцитозных пузырьков. Эпителий дистальных канальцев низкопризматический с прозрачной цитоплазмой. Проксимальные и дистальные извитые канальцы оплетены перитубулярной сетью капилляров (разветвления выносящих артериол сосудистого клубочка почечных телец). По месту локализации и особенностям строения различают корковые (поверхностные и промежуточные) и околомозговые (юкстамедуллярные) нефроны – их соотношение в почке 80% к 20%. В корковом веществе почки проксимальные канальцы составляют 70%, дистальные – 30% [85]. При измерении площади интерстиция (соединительнотканных прослоек между структурными элементами почки) у здоровых пациентов получено, что в норме она не превышает 10% от коркового вещества [16].
Вопрос о роли биопсии почки в диагностике МКН широко обсуждается. Сомнения многих клиницистов в целесообразности проведения инвазивной процедуры для верификации МКН в ряде случаев оправданы. При использовании современных методов диагностики диагноз МКН можно с высокой долей вероятности установить с помощью клинико-лабораторных данных по критериям IMWG [47].
Биопсия почки важна для подтверждения диагноза МКН при оценке эффективности новых методов терапии. В частности, применение высокоселективных диализирующих мембран (high-cut off/high-flux) может быть целесообразно при ОПП только лишь вследствие МКН. В исследованиях по применению экстракорпоральных методов элиминации СЛЦ для исключения других вариантов нефропатий всем пациентам выполняли биопсию почки [35].
Биопсия почки необходима для дифференциации МКН от других причин ОПП при ММ, а также для выявления сочетанных вариантов парапротеин обусловленных нефропатий [27]. В настоящее время основными показаниями к выполнению биопсии почки при ММ является клубочковой характер протеинурии для исключения AL-амилоидоза или БОЛЦ [48, 98]. Кроме того, пациентам с содержанием СЛЦ 500 мг/л следует также выполнять биопсию почки, так как в этом случае МКН маловероятна [133].
В проведенных в последние годы исследованиях показано, что биопсия почки позволяет не только установить характер повреждения почек, но и определить выраженность патологического процесса [27, 51, 64]. Клинически это может быть полезно для выбора оптимальной тактики терапии [56].
Редкость проведения биопсии почки при ММ была продиктована опасностью развития жизнеугрожающих осложнений, общей тяжестью соматического статуса пациентов. Однако, по данным недавнего исследования, при выполнении биопсий 148 пациентам с моноклональными гаммапатиями частота геморрагических осложнений составила только 4,1% [59]. Повторные биопсии после лечения выполнялись в исключительных случаях [27, 28].
Гистологическими признаками ХБП являются глобальный гломерулосклероз, тубулярная атрофия, интерстициальный фиброз и артериосклероз, которые вместе описывают как «нефросклероз». В ряде случаев признаки нефросклероза можно увидеть в нефробиоптате даже при нормальной азотовыделительной функции почки. Опубликованные результаты исследования биоптатов почек 1203 доноров показали, что распространенность нефросклероза линейно возрастала с 2,7% в возрасте от 18 до 29 лет до 73% в возрасте от 70 до 77 лет. Эти результаты доказывают субклиническую возрастную нефропатию, которую можно обнаружить только с помощью биопсии почки [139].
Ведущие исследователи в данной области считают, что биопсия почки играет важную роль в диагностике и исследовании пациентов с ОПП [97]. Однако прогностическое значение морфологических изменений в нефробиоптате при ОПП у пациентов с МКН остается не ясным. Тем не менее, очень важно разграничить морфологические изменения в биоптатах на обратимые и необратимые. Прогнозирование ПО на противомиеломную терапию может быть целесообразным при определении тактики индукционной терапии особенно у пожилых пациентов с ОПП вследствие МКН.
Полуколичественный метод исследования нефробиоптата впервые был применен C. Pirani и соавт. для оценки всех элементов гистологии почки в совокупности. Полуколичественный анализ, основанный на стандартном подсчете баллов, широко применяется и по настоящее время, демонстрируя хорошую корреляцию между почечной патологией и функцией органа [130, 144].
Наряду с рутинной полуколичественной оценкой все шире стали использовать морфометрическое исследование нефробиоптатов с использованием современных компьютерных программ и модулей для получения четких количественных измерений. Для точной оценки патологических изменений и возможности прогнозирования результатов лечения используется термин «вычислительная нефропатология» [25]. Международной группой патологов в 2016 году был разработан протокол использования широкоформатной цифровой оценки для стандартизации результатов биопсии почки на примере изучения нефротического синдрома [26]. Количественная компьютерная морфометрическая оценка патологических изменений в нефробиоптате повышает точность изучаемых явлений и может быть использована в прогностических моделях.
Морфологические изменения в биоптатах почек и их значимость в обратимости острого повреждения почек с потребностью в диализе при миеломной каст-нефропатии
Данные, касающиеся морфологических факторов обратимости ОПП 3 стадии с потребностью в диализе при МКН, единичны и противоречивы. Большинство исследователей согласны с тем, что к формированию диализзависимой ОПП приводит быстропрогрессирующий (в течение нескольких недель) патологический процесс в почках и поздняя диагностика основного заболевания [9, 13, 27]. По некоторым данным медиана времени от первой стадии ОПП до начала ЗПТ, может составлять всего 2 мес. (0–7) [11]. В этом же исследовании из 22 больных с гистологически подтвержденной МКН в дебюте ММ в 15 (68%) случаях в нефробиоптате был выявлен распространенный тубуло-интерстициальный фиброз (или умеренная степень ИФ/ТА). Из них функция почек улучшилась только у 20% больных. Группа пациентов с отсутствием выраженной ИФ/ТА статистически значимо отличалась, и ПО был получен в 57% случаев (p=0,04). Таким образом, распространенная степень ИФ/ТА была отнесена к неблагоприятным прогностическим факторам в отношении восстановления функции почек. Однако в этой работе использовались полуколичественные методы анализа, количественное морфометрическое исследование нефробиоптатов не проводилось.
Подобный вывод сделан и в более раннем исследовании, где статистически значимо доказано, что ПО различался в зависимости от степени тубулярной атрофии (p 0,05). При этом отмечено, что число белковых цилиндров, выраженность гломерулосклероза и острого канальцевого повреждения не влияли на ПО [137]. В единственном недавнем исследовании, где применялись полуколичественный и частично количественный анализ нефробиоптатов 41 больного с МКН, получены противоположные данные. Было установлено неблагоприятное прогностическое значение числа белковых цилиндров (25 в 10 полях зрения). По полученным результатам выраженность ФИ достоверно не влияла на ПО. Однако в этой работе распросраненность ФИ представлена в полуколичественной градации, что включает большой диапазон значений и неточность оценки. Авторы изучили также группу с гематологическим ответом, и статистически достоверная связь с ПО была установлена по числу цилиндров и распространенности тубулярной атрофии. Однако эти данные были проанализированы на неоднородной выборке пациентов (с различной степенью тяжести ОПП), что снижает их ценность [51].
В клиническом случае, описанном K.Basnayake и соавт. в 2008 г., пациентке через 6 мес. после успешной комбинированной терапии (регидратации, химиотерапии и удаления свободных легких цепей с использованием высокоселективных диализирующих мембран) была выполнена повторная биопсия почки. В нефробиоптате не было обнаружено характерных цилиндров в дистальных канальцах и собирательных трубочках, однако, сохранялся интерстициальный клеточный воспалительный инфильтрат с диффузной ИФ/ТА. При этом, ПО достигнуто не было [28]. Позже автор проанализировал данные еще 4-х пациентов с МКН и повторными биопсиями, выполненными пациентам через 6 недель после начала противомиеломной терапии. Было показано, что наряду с существенным сокращением числа белковых цилиндров прогрессировал индекс хронического повреждения интерстиция с 10 до 42%, который включал в себя процент склерозированных клубочков, клеточную воспалительную инфильтрацию и ФИ. У одного пациента, у которого через 6 недель число белковых цилиндров сохранялось высоким, не было последующего восстановления почек. У остальных пациентов, напротив, ПО был достигнут через 67 (51–105) дней [27]. Таким образом было предположено, что резорбция белковых цилиндров – предиктор ПО у пациентов с МКН.
Результаты световой микроскопии нефробиоптатов у больных
Исследование выполнено на биоптатах почек 42 пациентов с МКН и ОПП. Пациенты были разделены на 2 группы: в первую группу вошли 35 пациентов с диализзависимой стадией ОПП с медианой СКФ 4 мл/мин (2–11), во вторую – 7 пациентов с тяжелым, но не диализзависимым ОПП – медиана СКФ составила 29 мл/мин (18–35). Среди всех 42 пациентов у 25 (60%) был достигнут гематологический ответ на индукционную ХТ. У больных из первой группы в трех случаях функция почек улучшилась до начала противоопухолевого лечения после проведения регидратационной терапии, и ГД удалось прекратить. Таким образом, на ГД к началу индукционной ХТ оставалось 32 пациента.
Оценка состояния клубочков
Процент склерозированных клубочков варьировал от 0 до 85,7% (Ме 4,7%) (Рисунок 8).
Примечание: пациенты расставлены в порядке увеличения процента склерозированных клубочков (синий цвет). Те пациенты, у которых наблюдался гематологический и почечный ответ дополнительно отмечены оранжевым цветом. У пациентов с гематологическим и ПО медиана склерозированных клубочков составила 4,8% (0–33,3), без ПО – 3,5% (0–40). Статистических различий по этим группам выявлено не было (p=0,84). Был проведен дополнительный анализ с учетом факторов, которые могут вызывать самостоятельные повреждения почек. Рассмотрено сочетание МКН с БОЛЦ или AL-амилоидозом, а также такими сопутствующими заболеваниями, как хронический пиелонефрит, артериальная гипертензия, сахарный диабет. Пациенты были разделены на 3 группы: в первую вошли больные с изолированной МКН (n=9), во вторую – c МКН в сочетании с БОЛЦ или AL-амилоидозом (n=12), в третью – МКН с сопутствующими заболеваниями (n=21) (Таблица 7).
При изолированной МКН медиана количества склерозированных клубочков составила 0%, при сочетании МКН с одним или несколькими сопутствующими заболеванием – 9,1%, при парапротеин обусловленных сочетанных нефропатиях – 7,9%. Несмотря на большее количество склерозированных клубочков при сочетанных вариантах нефропатий, статистически значимого различия не получено как при сравнении МКН с каждой из групп отдельно, так и при сопоставлении изолированной МКН со всеми остальными пациентами (0% и 8,1%; p=0,089). Максимальный процент склерозированных клубочков (85,7%) наблюдали у пациента с диабетической нефропатией и пиелонефритом, у этого больного не было получено ни гематологического, ни ПО на терапию. На Рисунке 9 показано распределение пациентов в каждой подгруппе от минимального до максимального значения процента склерозированных клубочков.
У пациентов с изолированной МКН максимальный процент склерозированных клубочков составил 25%. При этом у 7 (77%) пациентов клубочки были интактны. Предположение о том, что возраст пациентов прямо коррелирует с процентом склерозированных клубочков статистически не подтвердилось (r= –0,054, p=0,7). Статистически значимо чаще ПО достигался в группе пациентов с парапротеин обусловленными нефропатиями, чем в группе пациентов с сочетанной сопутствующей патологией (58% против 33% пациентов, p=0,028). Других статистически значимых различий получено не было.
Таким образом, гломерулосклероз у пациентов с МКН и тяжелым ОПП объясняется наличием сопутствующей патологии или другой парапротеин обусловленной нефропатии. Исследование состояния канальцев
В 5 (12%) случаях оценка оказалась затруднительной, в связи с тотальным фибротическим изменением почечной ткани, либо неадекватным качеством препарата.
Полуколичественная оценка
Распространенность острого повреждения канальцев У всех пациентов были выявлены признаки острого повреждения канальцевого эпителия (Рисунок 10).
Примечание: Пациент Г., 55 лет, PAS–окрашивание, х100. Звездочками указаны просветы канальцев с признаками острого канальцевого повреждения: уплощение канальцевого эпителия, расширение просвета канальцев, отсутствие щеточной каймы; некоторые эпителиальные клетки гипертрофированы, многие из них с митотической активностью.
При этом число канальцев с острым повреждением значительно варьировало. У 10 (24%) больных острое повреждение отмечалось в 10–25% от всех канальцев, у 17 (40%) пациентов – в 26–50% канальцев, у 10 (24%) больных более чем в 50%.
Таким образом, у большинства больных (64%) более чем в 25% канальцев (2–3 степень) были выявлены признаки острого повреждения. При этом в 24% случаев в процесс было вовлечено более половины канальцев. Распространенность острого повреждения канальцев не различалась у пациентов с ОПП 3 стадии с потребностью в диализе и без таковой. В этих группах у 66% и 57% больных, соответственно, распространенность острого повреждения канальцев достигала 2–3 степени (2= 0,397, р 0,05).
Корреляции между степенью острого повреждения канальцев и количеством секретируемого белка B-J не выявлено (Rs = 0,223, p=0,197).
Проведен анализ распространенности острого повреждения канальцев в зависимости от сопутствующих заболеваний (Таблица 8).
Статистически значимого различия в группах пациентов с изолированной МКН и с сочетанными нефропатиями по распространенности острого повреждения канальцев не обнаружено. Это подтверждает, что острое повреждение канальцев ассоциировано с МКН и менее связано с сопутствующими заболеваниями.
В группе пациентов с достигнутым гематологическим ответом проанализировано влияние степени острого повреждения канальцев на достижение ПО (Рисунок11).
При 1 степени острого повреждения канальцев ПО был получен у 17,4% пациентов, у 8,7% – отсутствовал. При 2 степени ПО наблюдали у 39,1% больных, у 13% не наблюдали. При 3 степени острого повреждения канальцев ПО диагностировали в 17,4% случав, у 4,3% ПО отсутствовал. Однако во всех группах статистически значимой связи выявлено не было (p 0,05). Таким образом, степень острого повреждения канальцев не влияла на ПО.
Распространенность тубулярной атрофии
У всех пациентов была выявлена та или иная степень тубулярной атрофии (Рисунок 12). У 15 (36%) пациентов она соответствовала 1 степени (т.е. отмечалась в 10–25% канальцев), у 21 (50%) – 2 степени (26–50% канальцев) и у 2(5%) пациентов – 3 степени ( 50% канальцев). У 4 пациентов анализ тубулярной атрофии был затруднен. Рисунок 12. Тубулярная атрофия у пациентов с миеломной каст-нефропатией и острым повреждением почек 3 степени.
Тубулярная атрофия 2–3 степени в диализзависимой группе выявлена у 60% пациентов, в то время как в группе без потребности в диализе лишь у 29% больных. Однако статистически значимых различий получено не было, что вероятнее всего обусловлено малочисленной группой пациентов без потребности в диализе (2 =3,777, р 0,05).
Проанализирована распространенность тубулярной атрофии в зависимости от дополнительных факторов повреждения почки (Таблица 9.).
Распространённость тубулярной атрофии была существенно больше у пациентов с наличием сопутствующих заболеваний, чем в случаях с изолированной МКН. Тубулярная атрофия 2 и 3 степени была выявлена у 84,2% больных с сопутствующими заболеваниями, и в 33,3% случаев – при изолированной МКН (р=0,024).
ПО наблюдался лишь при 1 и 2 степени тубулярной атрофии и отсутствовал при 3 степени (Рисунок 13).
При 3 степени тубулярной атрофии во всех случаях ПО отсутствовал. Корреляционный анализ подтвердил наличие значимой обратной взаимосвязи между степенью тубулярной атрофии и частотой ПО (Rs= – 0,439, p=0,036). Таким образом, при нарастании степени тубулярной атрофии ПО наблюдался реже. Связи между острым повреждением канальцев и ПО на противомиеломную терапию не обнаружено.
Соотношение распространенности острого повреждения канальцев и тубулярной атрофии
У пациентов с МКН и ОПП 3 стадии повреждение канальцевого аппарата настолько значительно, что количество нормальных канальцев не превышает 10%, и точно определить их количество не представляется возможным. Кроме того, острое повреждение канальцев может переходить в атрофию. Соотношение распространенности острого повреждения канальцев и тубулярной атрофии на основании полуколичественного исследования представлено в Приложении 3.
Проведён корреляционный анализ соответствия полуколичественных показателей распространенности острого повреждения канальцев и тубулярной атрофии у каждого пациента. Статистически значимых соответствий не получено (r= –0,134, p=0,383).
Сопоставление результатов морфологического и иммуногистохимического исследований биоптатов почек у пациентов с острым повреждением почек 3 стадии с и без потребности в диализе до начала противомиеломной терапии
При сравнении морфологических и ИГХ изменений в группе больных без потребности в диализе (5 пациентов) и диализзависимой группе (26 пациентов) статистически значимых различий получено не было. Тем не менее, у пациентов с потребностью в диализе медиана экспрессии альфа-ГМА была больше (42,3% от площади интерстиция), чем в группе без потребности в диализе (27%). Площадь экспрессии виментина составила 29,6% и 19,9%, соответственно. Возможно, что отсутствие статистических различий обусловлено малой группой пациентов без потребности в диализе.
Степень ИФ/ТА также была больше в диализзависимой группе. В группе с потребностью в диализе в сравнении с группой без диализа 1 степень ИФ/ТА была выявлена соответственно у 32% и 71% пациентов, 2 степень – у 64% и 29% больных, 3 степень – 4% и 0% случаев. Таким образом, маркеры ИФ/ТА были более выражены в группе пациентов с диализзависимым ОПП. Отсутствие статистически значимых различий, вероятно, обусловлено малой выборкой пациентов.
В Приложении 5 приведены все морфологические параметры, определённые нами в процессе работы у пациентов с достигнутым гематологическим ответом в зависимости от ПО.
В Таблице 19 приведена совокупность основных морфологических характеристик нефробиоптатов пациентов с и без потребности в диализе.
В 87–94% случаев развитие ОПП 3 стадии с потребностью в диализе в дебюте ММ обусловлено МКН [55, 78, 137]. ОПП – показание к немедленному началу противоопухолевой терапии по трехкомпонентным бортезомибсодержащим программам с высокими дозами дексаметазона с целью достижения как гематологического ответа, так и ПО. Если гематологический ответ у пациентов на ГД достигается в 60–85,3% случаях, то ПО – только в 23,5–48% [12, 13, 44, 101]. При этом у 66–87,5% пациентов функция почек восстанавливается не полностью, а соответствует частичному или минимальному ПО (рСКФ не превышает 59 мл/мин) [9, 13, 44, 89, 166].
В качестве предикторов восстановления функции почек при МКН рассматривали достижение гематологического ответа, сохранную водовыделительную функцию почек, длительность и степень тяжести повреждения почек [9, 45, 46, 81]. Лишь в единичных работах оценивали морфологические изменения в нефробиоптатах в сопоставлении с ПО [27, 51]. Однако морфологические критерии, позволяющие прогнозировать обратимость ОПП 3 стадии с потребностью в диализе, не определены. Для решения этой задачи применены полуколичественный и количественный анализ морфологических изменений в почке, включающий компьютерную морфометрию. Полученные результаты в сопоставлении с клиническими данными были использованы для создания прогностической модели.
По полученным данным, среди всех сопутствующих факторов, которые могут вызвать ОПП или усугубить тяжесть МКН, наибольшее значение имеет дегидратация. В 7% случаев при коррекции водного состояния функция почек улучшилась еще до начала индукционной противомиеломной терапии. Установлено, что сохраненная водовыделительная функция у больных на ГД не является статистически значимым благоприятным прогностическим признаком обратимости ОПП. Однако ранее, на большей выборке пациентов, показаны обратные результаты [9].