Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Современные представления о деятельности банков пуповинной крови и применении стволовых клеток в клинической практике (обзор литературы) 14
1.1. Возможности применения клеток пуповинной крови в гематологии и смежных областях медицины 14
1.2. Организационные принципы деятельности банков пуповинной крови 20
1.3. Современные технологии заготовки, хранения и обеспечения качества пуповинной крови 23
1.4. Значение аллельного полиморфизма CCR5 delta 32 для трансплантации стволовых клеток 29
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 41
2.1. Общая характеристика обследованных образцов 41
2.2. Методы исследования 46
2.2.1. Молекулярно-биологические методы 46
2.2.2. Иммуногенетические методы 48
2.2.3. Измерение длины теломер 49
2.2.4. Гематологические методы 54
2.2.5. Иммунологические методы 54
2.2.5. Статистические методы 55
ГЛАВА 3. Результаты обследования образцов пуповинной крови на наличие аллельного полиморфизма CCR5 delta 32 57
3.1. Разработка методики определения аллельного полиморфизма CCR5 delta
3.2. Исследование частоты выявления аллельного полиморфизма CCR5 delta 32 в образцах пуповинной крови 61
3.3. Результаты HLA-типирования образцов пуповинной крови с генотипом CCR5 delta 32/delta 32 62
ГЛАВА 4. Показатели качества образцов пуповинной крови с генотипом CCR5 delta 32/delta 32 67
4.1. Клеточный состав образцов пуповинной крови с генотипом CCR5 delta 32/delta 32 67
4.2. Длина теломер клеток пуповинной крови с генотипом CCR5 delta 32/delta 32 69
ГЛАВА 5. Научно-организационные аспекты создания банка пуповинной крови с генотипом ccr5 delta 32/delta 32 75
5.1. Разработка алгоритма обследования пуповинной крови для создания банка стволовых клеток пуповинной крови с генотипом CCR5 delta 32 75
5.2. Разработка требований к созданию банка стволовых клеток пуповинной крови с генотипом CCR5 delta 32/ delta 32 79
Заключение 84
Выводы 92
Практические рекомендации 93
Список литературы
- Современные технологии заготовки, хранения и обеспечения качества пуповинной крови
- Иммуногенетические методы
- Исследование частоты выявления аллельного полиморфизма CCR5 delta 32 в образцах пуповинной крови
- Разработка требований к созданию банка стволовых клеток пуповинной крови с генотипом CCR5 delta 32/ delta 32
Современные технологии заготовки, хранения и обеспечения качества пуповинной крови
Первый общественный банк пуповинной крови был открыт в 1991 году в Нью–Йоркском Центре Крови [Rubinstein P. et al., 1999]. В скором времени были основаны другие банки в Париже, Милане, Дюссельдорфе и других городах [Gluckman E. et al., 2005]. Появление общественных регистров пуповинной крови в США и Европе позволило провести первые неродственные трансплантации ГСК пуповинной крови в 1993 и 1994 годах [Kurtzberg J. et al., 1994; Wagner J. et al., 1996]. Выделяют следующие типы банков пуповинной крови: частные или коммерческие и общественные или некоммерческие. Общественные банки предоставляют клиническим центрам находящиеся на хранении клетки пуповинной крови на некоммерческой основе. Лицензированный банк стволовых клеток общественного хранения доступен для всех потенциальных реципиентов клеток пуповинной крови, образцы на хранение поступают после информированного согласия роженицы. Соответственно образцы пуповинной крови принадлежат банку стволовых клеток и могут быть в дальнейшем предоставлены для аллогенного применения. Перед включением в общественный регистр анализируется объём образцов, количество и типы клеток, проводится обследование на инфекционные агенты [Stewart C.L., 2013]. В противоположность таким организациям, частные банки предоставляют родителям коммерческие услуги именного хранения клеток пуповинной крови ребёнка [Aznar L.J., 2012; Petrini C., 2014]. В настоящее время большое количество банков являются гибридными – наряду с именным регистром банки поддерживают и общественное хранилище образцов пуповинной крови. Такая гибридная модель считается сейчас наиболее сбалансированной и предоставляет ряд преимуществ как для самой организации, так и для потенциальных реципиентов [Guilcher G.M. et al., 2015].
Одним из необходимых условий проведения успешной ТГСК является строгая совместимость донора и реципиента по системе HLA [Афанасьев Б.В. и соавт., 2015]. Однако для многих пациентов не удаётся вовремя найти HLA-совместимого донора, в особенности это касается небольших этнических популяций [Румянцев С.А. и соавт., 2010]. Показано, что совместимый неродственный донор костного мозга может быть подобран для 75% реципиентов западноевропейского происхождения, для многих других этнических групп вероятность нахождения неродственного совместимого донора костного мозга составляет не более 20–30%. Вероятность нахождения HLA-совместимого неродственного донора во многом зависит от этнического происхождения реципиента [Navarrete C. et al., 2009]. Существует значительное количество пациентов, которым не удаётся подобрать неродственного донора ГСК костного мозга или периферической крови во всемирном регистре доноров [Sullivan M.J., 2008]. Частота и распределение HLA-гаплотипов в каждом национальном банке пуповинной крови значительно различаются, что говорит об уникальном наборе гаплотипов в группах расовых и этнических популяций [Селиванов Е.А. и соавт., 2009; Логинова М.А. и соавт., 2012]. В этом заключалась одна из предпосылок возникновения региональных банков пуповинной крови [Rubinstein P., 2006].
Общественные банки контролируются национальными регулирующими органами, а также могут получить аккредитацию для участия в международных проектах. Разработаны международные протоколы оценки качества и стандартизации технологий. В 2013 году вышло пятое издание международных стандартов NETCORD-FACT (Foundation for the Accreditation of Cellular Therapy) International Standards for Cord Blood Collection, Processing, Testing, Banking, Selection and Release [http://www.netcord.org]. Образцы пуповинной крови, закладываемые на хранение, проходят серию тестов, в частности определяется ОЯК, количество CD34+ клеток, проводится HLA-типирование и обследование на инфекционные агенты. Эти исследования проводятся для решения вопроса о целесообразности хранения данного образца и использования его в клинических целях в дальнейшем. Если характеристики образца соответствуют стандартам, результаты тестирования попадают в международные регистры, после этого образцы становятся доступны национальным и иностранным трансплантационным центрам для проведения аллогенной трансплантации. Информация о тестированных образцах пуповинной крови, хранящихся в общественных регистрах, находится в двух международных базах данных – в NETCORD содержится информация о замороженных образцах пуповинной крови и в регистре BMDW (Bone Marrow Donors Worldwide) находятся данные о донорах ГСК костного мозга, периферической крови и образцах пуповинной крови [Navarrete C. et al., 2009].
В Российской Федерации до 2003 г. банков пуповинной крови не было. По состоянию на 2013 год в России существовал объединенный национальный регистр публичных образцов пуповинной крови и доноров ГСК, в который вошли данные о публичных образцах пуповинной крови Покровского банка стволовых клеток (Санкт-Петербург), государственного банка крови Самарской области, донорах ГСК из Оренбургской станции переливания крови и Карельского регистра доноров костного мозга, всего 10 000 потенциальных доноров ГСК и образцов пуповинной крови [Тюмина О.В. и соавт., 2013]. В России деятельность банков пуповинной крови регламентируется Приказом Минздрава России № 325 от 25.07.2003 г. «О развитии клеточных технологий в Российской Федерации». Однако научно-организационные принципы создания банка пуповинной крови с генотипом CCR5 delta 32/delta 32 в Российской Федерации не разработаны.
Иммуногенетические методы
Подходящими кандидатами для проведения ТГСК пуповинной крови с CCR5 delta 32/delta 32 генотипом могли бы стать пациенты с онкогематологическими заболеваниями или другой патологией, которым показана ТГСК, и сопутствующей ВИЧ-инфекцией. Применение высокоактивной антиретровирусной терапии позволяет замедлить прогрессирование заболевания и значительно увеличить продолжительность жизни больных, однако не приводит к полной эрадикации вируса, а также сопровождается токсическими эффектами и распространенностью резистентных штаммов. Пациенты со СПИДом, плохо отвечающие на антиретровирусную терапию, имеющие неблагоприятный прогноз течения заболевания и информированные о значительных рисках и потенциальных выгодах ТГСК могут быть допущены к участию в клинических испытаниях при наличии HLA-совместимого CCR5 delta 32/delta 32 образца пуповинной крови с адекватной клеточностью [Petz L.D. et al., 2013]. Известно, что среди ВИЧ-инфицированных пациентов наблюдается значительный рост заболеваемости злокачественными новообразованиями. Поэтому предполагается, что также будет наблюдаться рост пациентов с ВИЧ, которым необходимо проводить ТГСК [Hutter G. et al., 2011]. В частности, А. Krishnan и Forman показали значимое увеличение заболеваемости лимфомой Ходжкина и неходжкинскими лимфомами у ВИЧ инфицированных пациентов [Krishnan A. et al., 2010]. Действительно, злокачественные новообразования, связанные с развитием стадии СПИДа, являются одной из главных причин смертности среди ВИЧ-инфицированных больных [Bonnet F. et al., 2004]. Проводились сравнительные рандомизированные исследования исходов ТГСК у ВИЧ-инфицированных пациентов с неходжкинской лимфомой и у ВИЧ-негативных пациентов с неходжкинской лимфомой. Была продемонстрирована хорошая переносимость ТГСК у пациентов с ВИЧ-инфекцией. Показано, что ВИЧ положительный статус пациента не влияет на долгосрочный исход ТГСК и не является противопоказанием для проведения ТГСК [Krishnan A. et al., 2010]. Данные, полученные в течение более 25 лет, свидетельствуют об успешных ТГСК у ВИЧ-инфицированных пациентов с гематологическими заболеваниями, не только при лейкемии и рецидиве лимфомы, но и при незлокачественных заболеваниях, таких как апластическая анемия [Hutter G. et al., 2011].
Существует возможность проведения аллогенной ТГСК ВИЧ-инфицированным пациентам с онкогематологической патологией. Группа учёных под руководством профессора Б.В. Афанасьева сообщила об опыте проведения в Санкт-Петербурге аллогенной ТГСК трём пациентам с острым лейкозом и ВИЧ-инфекцией. Трансплантации проводились с применением режима кондиционирования редуцированной интенсивности (РИК) на фоне ВААРТ. При этом один из доноров был гетерозиготным носителем мутации CCR5 delta 32. У пациентки, получившей этот образец, развился полный донорский химеризм (наличие мутации CCR5 delta 32 в гетерозиготном состоянии). При этом не наблюдалось признаков реактивации ВИЧ, было отмечено выраженное увеличение CD4+ клеток и снижение вирусной нагрузки. Авторы считают, что данный пациент близок к функциональному излечению [Афанасьев Б.В. и соавт., 2015].
В настоящее время разрабатываются альтернативные технологии по использованию мутации CCR5 delta 32/delta 32 в клинической практике. В частности, перспективным подходом считается генная терапия. Значительная часть исследований связана с попытками выключить ген CCR5, то есть попытаться искусственно создать популяцию клеток, резистентных к ВИЧ инфекции. Так, проводятся исследования, в которых показана возможность блокирования экспрессии гена CCR5 с помощью малых интерферирующих молекул рибонуклеиновой кислоты (миРНК). Метод основан на феномене РНК-интерференции, при этом происходит деградация матричной РНК (мРНК) и останавливается экспрессия определённого гена на уровне транскрипции. Показано, что данный метод может быть успешно применён на практике, однако недостатком является то, что не происходит постоянной блокады гена CCR5 и необходимо повторять лечение с помощью данного метода [Subramanya S. et al., 2010]. Кроме того, в ряде исследований с применением миРНК не удалось добиться полного ингибирования ВИЧ-1, а также присутствовали нежелательные побочные эффекты [Martinez M.A. et al. 2002; Qin X.F. et al., 2003]. Другими перспективными подходами являются методы редактирования генома с использованием эндонуклеаз «цинковые пальцы», TALEN-метода, CRISPR/Cas9 технологиия. Эти методы основаны на связывании искусственной конструкции, содержащей фермент эндонуклеазу, обладающей способностью разрезать двухцепочечную молекулу ДНК, со специфичной последовательностью ДНК. Данные методы также позволяют блокировать экспрессию определённого гена, в данном случае гена CCR5. Преимущество редактирования генома с помощью эндонуклеаз перед блокированием гена с помощью РНК-интерференции в том, что при этом методе дефектный ген наследуется и поэтому есть вероятность, что будет достаточно однократного введения подобной конструкции для достижения стойкой блокады экспрессии гена CCR5 [Holt N. et al., 2010; Tebas P. et al., 2013; Maier D.A. et al., 2013; Li L. et al., 2013; Cho S.W. et al., 2013; Ye L. et al., 2014; Mussolino C. et al., 2014; Mandal P.K. et al., 2014; Tebas P. et al., 2014].
Исследование частоты выявления аллельного полиморфизма CCR5 delta 32 в образцах пуповинной крови
Для оценки качества образцов пуповинной крови с генотипом CCR5 delta 32/delta 32 и его пригодности для трансплантации был изучен клеточный состав и наиболее важные для трансплантации характеристики клеточного концентрата пуповинной крови. Группы сравнения – 40 образцов пуповинной крови с генотипом CCR5 delta 32/delta 32 и 920 HLA типированных образцов пуповинной крови, хранящихся в Покровском банке стволовых клеток, с нормальным вариантом гена CCR5. Проверка нормальности распределения результатов исследования с помощью критерия Шапиро-Уилка показала отсутствие нормального распределения (p 0,001) для значений ОЯК, количества CD34+ и жизнеспособности. Поэтому статистический анализ данных был выполнен с помощью непараметрического U-критерия Манна-Уитни. ОЯК в образцах пуповинной крови с генотипом CCR5 delta 32/delta 32 не превышало значение аналогичного показателя образцов пуповинной крови с нормальным вариантом гена CCR5 (табл. 14). Расчёт U-критерия Манна-Уитни не показал достоверность различий для значения ОЯК в обеих группах сравнения (U критерий = 21867; p 0,05).
Содержание CD34+ клеток в образцах пуповинной крови с генотипом CCR5 delta 32/delta 32 по сравнению с образцами с нормальным вариантом гена CCR5 достоверных различий не имело (табл. 15). Статистический анализ по Манну-Уитни не выявил статистически значимых различий между группами сравнения (U критерий = 13264; p 0,05).
При оценке жизнеспособности концентратов пуповинной крови с генотипом CCR5 delta 32/delta 32 по сравнению с образцами с нормальным вариантом гена CCR5 не было выявлено достоверных различий (табл. 16). Оценка достоверности различий двух выборок по Манну-Уитни показала, что полученное эмпирическое значение находится в зоне незначимости (U критерий = 25145; p 0,05).
Таким образом, полученные результаты значений клеточных характеристик концентратов пуповинной крови соответствуют имеющимся данным исследований показателей качества пуповинной крови [Абдулкадыров К.М. и соавт, 2006; Rocha V. et al., 2009; Meyer T.P. et al. 2006: Querol S. et al., 2010; Иволгин Д.А. и соавт., 2012]. По данным рабочей группы Eurocord, рекомендованное значение ОЯК составляет 3 х 107/кг при сборе пуповинной крови и 2 х 107/кг при инфузии, рекомендованная концентрация CD34+ клеток составляет от 1,2 до 1,7 х 105/кг [Gluckman E. et al., 2006].
Для оценки пролиферативного потенциала ГСК была использована методика измерения длины теломер методом ПЦР в реальном времени. Выполнено исследование длины теломер клеток 40 образцов пуповинной крови с генотипом CCR5 delta 32/delta 32. Группы сравнения – 40 образцов пуповинной крови с генотипом CCR5 delta 32/delta 32 и 283 образца пуповинной крови с нормальным вариантом гена CCR5. С помощью критерия Шапиро-Уилка была выявлена нормальность распределения результатов исследования длины теломер CCR5 delta 32/delta 32 клеток (p = 0,082) и клеток с нормальным вариантом гена CCR5 (p = 0,932). Результаты исследования представлены в таблице 16. Установлено, что средняя длина теломер CCR5 delta 32/delta 32 клеток пуповинной крови достоверно не отличалась от этого значения клеток с нормальным вариантом гена CCR5. Оценка достоверности различий двух выборок по Стьюденту показала, что полученное эмпирическое значение t (1,19) находится в зоне незначимости (t критическое 1,96). То есть можно утверждать, что статистически значимых различий между группами сравнения не было выявлено. По литературным данным в норме средняя длина теломер клеток пуповинной крови составляет 10,4±1,9 т.п.н. [Engelhardt M., 1997].
Разработка требований к созданию банка стволовых клеток пуповинной крови с генотипом CCR5 delta 32/ delta 32
Для создания банка стволовых клеток пуповинной крови с генотипом CCR5 delta 32 проведен анализ возможностей использования для этой цели трех организационных форм деятельности: общественного банка, банка персонального хранения и гибридного банка стволовых клеток. В общественном банке хранятся образцы пуповиной крови с генотипом CCR5 delta 32 после получения информированного согласия роженицы, соответственно образцы пуповинной крови принадлежат банку стволовых клеток и могут быть выданы для аллогенного применения. В свою очередь в банках персонального хранения могут содержаться именные образцы пуповинной крови с генотипом CCR5 delta 32 для индивидуального применения для самого новорожденного или членов его семьи. Соответственно именной образец является собственностью ребёнка и его родителей, и применение такого образца для других реципиентов имеет ограниченные возможности. В гибридном банке стволовых клеток на хранении могут находиться именные образцы пуповинной крови с генотипом CCR5 delta 32 и общественные образцы с подобным генотипом для аллогенного применения. Такой подход позволяет оптимизировать деятельность банка стволовых клеток, повысить производительность персонала и оборудования, снизить себестоимость хранения образцов пуповинной крови, предназначенных для передачи в трансплантационные центры. Поэтому предпочтительно создание общественных и гибридных моделей банков стволовых клеток пуповинной крови с генотипом CCR5 delta
Качество образцов пуповинной крови в банке стволовых клеток с таким генотипом должно соответствовать национальному стандарту, определяемому Приказом МЗ РФ № 325 от 25 июля 2003 г. «О развитии клеточных технологий в Российской Федерации», и требованиям международных стандартов Eurocord [Gluckman E. et al., 2004] и CIBMTR (Центр по международным исследованиям трансплантации крови и костного мозга) [Eapen M. et al., 2007]. Согласно этим критериям минимальная доза ядросодержащих клеток до замораживания должна быть не менее 3,0 х 107/кг массы тела пациента, минимум 2,0 – 2,5 х107/кг массы тела пациента после размораживания, минимальное количество CD34+ клеток должно составлять 1,2 – 1,7 х 105/кг массы тела пациента. В результате исследования был разработан алгоритм обработки пуповинной крови после поступления в банк стволовых клеток, предназначенных для последующего тестирования на наличие мутации CCR5 delta 32 (рис. 15).
Перед криоконсервированием необходимо провести комплексный анализ качества клеточного концентрата пуповинной крови, предназначенного для детекции CCR5 delta 32. С этой целью была разработана стандартизированная программа оценки качества концентрата пуповинной крови, помещаемого на длительное хранение (рис. 16).
В результате внедрения разработанного алгоритма и программы оценки качества на базе Покровского банка стволовых клеток был создан банк стволовых клеток пуповинной крови, содержащий 721 образец с генотипом CCR5/CCR5 delta 32 и 40 образцов с генотипом CCR5 delta 32/delta 32, годных для клинического использования. Идентифицированные образцы были внесены в регистр стволовых клеток пуповинной крови с аллельным полиморфизмом CCR5 delta 32 и доступны для трансплантационных центров. Существующая технология позволяет хранить такие образцы в течение длительного времени в замороженном состоянии и размораживать их по унифицированным программам без существенной потери качества и пролиферативного потенциала. ПУПОВИННАЯ КРОВЬ
Обследование образцов пуповинной крови Покровского банка стволовых клеток для детекции аллельного полиморфизма CCR5 delta 32 выполнялось с октября 2011 года по апрель 2015 года. В процессе работы был предложен и внедрен алгоритм создания регистра CCR5 delta 32/delta 32 образцов пуповинной крови (рис. 17). При этом были разработаны требования к организации банка стволовых клеток пуповинной крови с генотипом CCR5 delta 32/delta 32. Несомненно, что оптимальной организационной структурой такого банка является создание его в форме сегмента банка стволовых клеток пуповинной крови, позволяющего осуществлять сбор, тестирование, обработку и хранение не менее 4 тысяч концентратов стволовых клеток. Вместе с тем, организация деятельности банка стволовых клеток пуповинной крови с генотипом CCR5 delta 32/delta 32 имеет определенные особенности, которые должны учитываться при его создании. Выявление этих особенностей явилось основой для разработки требований, включающих организационные, медицинские, технологические и информационные аспекты создания банка и регистра стволовых клеток пуповинной крови с генотипом CCR5 delta 32/delta 32.
Организационные требования включают в себя решение правовых, кадровых, организационно-штатных и логистических вопросов функционирования регистра. Получение образца пуповинной крови для тестирования на наличие мутации CCR5 delta 32 должно сопровождаться медицинской и правовой документацией, свидетельствующей об отсутствии противопоказаний к взятию и хранению пуповинной крови, наличием информированного согласия женщин. Следует отработать логистическую схему движения образцов пуповинной крови с момента их заготовки до клинического использования.