Содержание к диссертации
Введение
Материалы и методы исследований
1.1 Общая характеристика материала исследования
1.2 Методы исследования
1.2.1 Определение содержания оксида азота в тканях крыс
1.2.2 Исследование системной гемодинамики и микроциркуляции
1.2.3 Определение напряжения газов крови и кислотно-основного состояния в крови крыс
1.2.4 Статистическая обработка результатов исследований
1.3 Структура работы
2 Содержание оксида азота в тканях крыс при различных видах шока
2.1 Содержание оксида азота в тканях здоровых крыс
2.2 Содержание оксида азота в тканях крыс при ожоговом шоке
2.3 Оксид азота в тканях крыс при травматическом шоке
2.4 Содержание оксида азота в тканях крыс при геморрагическом шоке
3 Изучение влияния регуляторов синтеза оксида азота на течение геморрагического шока у крыс
4 Влияние донора оксида азота L-аргинина на течение геморрагического шока у крыс при инфузионной терапии
4.1 Воздействие инфузии изотонического раствора натрия хлорида на течение геморрагического шока у крыс (контроль)
4.2 Изучение возможности повышения эффективности инфузионной терапии геморрагического шока донором оксида азота L-аргинином
5 Течение геморрагического шока при введении изотонического раствора натрия хлорида и избирательных ингибиторов синтеза оксида азота
5.1 Инфузия N6-(1-иминоэтил)-L-лизин гидрохлорида
5.2 Инфузия N5-(1- иминоэтил)-L-орнитин дигидрохлорида
5.3. Инфузия аминогуанидина
5.4 Инфузия S-метилизотиола
5.5 Сравнительная эффективность применения селективных ингибиторов синтеза оксида азота при инфузионной терапии геморрагического шока ЗаключениеВыводы
Список литературы
- Определение содержания оксида азота в тканях крыс
- Статистическая обработка результатов исследований
- Оксид азота в тканях крыс при травматическом шоке
- Инфузия N5-(1- иминоэтил)-L-орнитин дигидрохлорида
Определение содержания оксида азота в тканях крыс
Гиперкоагуляция, развивающаяся на самых ранних этапах геморрагического шока, приводит к диссеминированному внутрисосудистому свертыванию (ДВС), что еще более способствует нарушению периферического кровообращения. Развитие стаза и появление микротромбов, повышение свертываемости способствует и ДВС синдрому, и вторичному фибринолизу. Появление микротромбов связано с посттравматической гипоксемией, которая возникает под влиянием серотонина и других активных аминов, выделяющихся из тромбоцитов, находящихся в тромбах [24, 29, 83].
Нарушение периферического кровообращения способствует ухудшению кислородного режима организма. Развитие циркуляторной гипоксии вызывает нарушение энергетического обмена. Образующийся при гликолизе пируват не поступает в цикл трикарбоновых кислот из-за недостатка кислорода в окружающей среде и накапливается в цитоплазме, где превращается в лактат. Происходит увеличение концентрации пирувата и лактата в крови. Отмечаются признаки нарушения окислительных процессов в тканях в виде накопления избытка лактата. Содержание молочной кислоты превышает концентрацию пировиноградной. В связи с гипоксией и ацидозом происходит снижение чувствительности гладкомышечных стенок сосудов к циркулирующим в крови катехоламинам [83]. Уменьшение ОЦК сопровождается перемещением значительных объемов внеклеточной жидкости в сосудистое русло, что ведет к нарушениям водно-электролитного равновесия. Жидкость, поступающая в сосудистое русло, практически лишена белков. Поэтому концентрация их в плазме понижается, и онкотическое давление плазмы падает. При достижении нового равновесия между онкотическим и гидростатическим давлением в капиллярах дальнейший приток межтканевой жидкости в сосудистое русло прекращается.
Глубина расстройств кровообращения, развитие тяжелой гипоксии и изменение метаболизма определяет тяжесть и исход геморрагического шока. Регулирующие системы не способны поддерживать гомеостаз, деструктивные эффекты цитокинов приводят к нарушению проницаемости и функции эндотелия капилляров, развитию органной дисфункции. При прогрессировании шока формируется полиорганная недостаточность [83, 193], сердечная недостаточность, отек головного мозга и процесс вступает в необратимую фазу, летальность при которой составляет 70-80%.
Значительная стойкая гипотензия в течение часа указывает на большую потерю крови и является показанием для немедленной трансфузионной терапии, направленной на коррекцию патологических изменений, возникающих в организме при шоке и кровопотере [3, 6, 83]. Современная терапия геморрагического шока включает большой комплекс лечебных средств, воздействующих на все звенья его патогенеза [200, 254]. Обязательным и безотлагательным при геморрагическом шоке является восполнение ОЦК, восстановление гемодинамики, газотранспортной функции крови, коррекция водно-солевого и кислотно-основного состояния [7, 83, 180]. Характер кровоснабжения различных регионов тела после кровопотери определяет устойчивость к гиповолемии. Исходя из большого значения гиповолемии в патогенезе шока, для устранения анемии, нарушений периферического кровообращения, улучшения реологических свойств крови применяют переливание кровезамещающих растворов, компонентов крови и биологически активных веществ [2, 3, 6, 161]. Трансфузионное обеспечение терапии кровопотери, особенно при массовом поступлении пострадавших, требует создания запаса трансфузионных сред и компонентов крови. Используется практически весь арсенал кровезамещающих растворов, начиная от физиологического раствора (0,9% раствор натрия хлорида) и заканчивая декстранами. Однако наиболее предпочтительными при восполнении ОЦК были и остаются компоненты крови: эритроцитная масса и тромбоконцентрат, свежезамороженная плазма [3, 6]. С появлениями новых знаний о механизме шока совершенствуются методы инфузионной терапии, включающие одновременно и фармакологические препараты, воздействующие на различные звенья патологического процесса [7, 254]. При оказании медицинской помощи при геморрагическом шоке и ликвидации гиповолемии, солевые растворы с различными добавками могут оказаться наиболее эффективными инфузионными средами. Они оказывают преимущественное действие на водно-солевое равновесие и кислотно-основное состояние организма. При инфузионной терапии ГШ изотонический раствор натрия хлорида при его введении в большом объеме не приводит к ухудшению функции сердечно-сосудистой системы [83]. Однако инфузия солевых растворов, несмотря на коррекцию гемодинамики, КОС, водно-электролитного баланса организма, не устраняет гипоксию, которая является важным фактором патогенеза шока и кровопотери. Cопровождающее массивную кровопотерю снижение артериального давления первично, является прямым компенсаторным защитным механизмом, но способствует тромбообразованию. Ингибирование процессов внутрисосудистого свёртывания проводят путём применения гепарина. Оптимальным вариантом пополнения количества прокоагулянтов и факторов свёртывания является применение свежезамороженной плазмы крови. При этом одновременно больному переливается в соответствующем объёме эритроцитная масса, свежезамороженная плазма и необходимые кровезаменители.
Статистическая обработка результатов исследований
Анализ приведенных литературных данных показывает, что, несмотря на большое число исследований, посвященных патогенетической роли оксида азота, пока не удалось определить все "точки приложения" NО. Многие свойства оксида азота продолжают изучаться фармакологами, медиками различных специальностей. Говоря о значении NO при ГШ, трудно найти ту грань, которая определяет цитозащитную и цитотоксическую роль NO. Снижение активности эндотелиальной конститутивной синтазы приводит к нарастанию эндогенной недостаточности NO, ухудшению коронарной гемодинамики и кровотока в венозном русле [35, 211], а избыточное количество может привести к ишемии органов и ткани. С другой стороны, не надо забывать, что NO улучшает микроциркуляцию и тканевую перфузию и поэтому полностью подавлять продукцию оксида азота нельзя. Кроме того, на сегодняшний день практически нет сведений о влиянии регуляторов синтеза оксида азота, применяемых вместе с инфузионными средами, восполняющими кровопотерю при геморрагическом шоке. Таким образом, проблема повышения эффективности инфузионной терапии геморрагического шока актуальна и по сей день. Представляется перспективным исследование роли оксида азота как одного из потенциальных регуляторов cосудистого тонуса при инфузионной терапии ГШ. Есть основание полагать, что направленное воздействие на метаболизм оксида азота с помощью доноров NO и ингибиторов NO-синтаз позволит расширить возможности инфузионной терапии ГШ и явится новым подходом в лечении нарушений кровообращения при шоке.
Исследования выполнены на 123 белых крысах обоего пола массой 170-230 г. Эксперименты согласованы с этическим комитетом ФГБУ РосНИИГТ ФМБА России и проведены в соответствии с требованиями Женевской Конвенции ІInternational Guiding Principles for Biomedical Research Involving AnimalsІ (Geneva, 1990). Во время опыта животные находились под тиопенталовым наркозом. Прежде всего, необходимо было выбрать модель шока, при котором происходят наиболее выраженные изменения содержания NO в тканях крыс. Далее, именно на этой модели, планировалось изучить возможность повышения эффективности инфузионной терапии шока с помощью веществ, влияющих на эндотелийзависимую регуляцию сосудистого тонуса. Ожоговый шок моделировали нанесением на область спины и боковых поверхностей туловища нагретой до 200-240 С латунной пластинкой. На момент нанесения травмы животных фиксировали на станке. Крысам внутрибрюшинно вводили 1% раствор тиопентала натрия из расчета 0,08 мл/100 г массы тела (35-40 мг/кг). Площадь ожога с поражением всей толщи кожи составляла 20-25 % от общей поверхности тела. По истечении сроков наблюдения – через 4 и 24 ч животных декапитировали. Органы (печень, почки, селезенка) для определения содержания NO извлекали через 4 и 24 ч после термической травмы. Ткани органов измельчали, замораживали в пресс-форме и помещали в сосуд Дюара с жидким азотом (-196С), где они хранились до момента определения содержания NO .
Травматический шок моделировали сдавливанием обоих бедер крыс с помощью миниатюрных тисков с винтовым зажимом в течение 4-х часов. Пробы тканей органов для исследований забирали через 3-6 и 18 ч после окончания четырехчасового сдавливания.
При моделировании геморрагического шока препарировали левую сонную артерию, которую брали на лигатуры. Для регистрации физиологических параметров и взятия проб крови ее катетеризировали полиэтиленовым катетером. Через катетер сонной артерии вводили раствор гепарина из расчета 0,07 мл/100 г массы тела. Измеряли исходное артериальное давление в артерии, после чего начинали эксфузию крови. АД измеряли дискретно через каждые 2,5-5 мин в течение всего периода наблюдения за животным. Кровопотерю проводили, снижая АД до 4,7-5,3 кПа (35-40 мм рт.ст.), которое поддерживали на этом уровне в течение 20-25 минут и заканчивали при стойком снижении АД до 40 мм рт.ст. Для дальнейшего анализа брали ткани, печени, селезенки и почки. Контролем служили здоровые животные, в печени, почках, селезенке которых также определяли содержание NO. Для прямого количественного определения содержания NO вводили “ловушку”. Компоненты “ловушки” были введены за 30 мин до декапитации – внутрибрюшинно раствор Na-ДЭТК (диэтилдитиокарбамат) (С5Н10NS2Na, 500 мг/2,5 мл H2O/кг) и в бедро подкожно раствор FeSO4 + цитрат Na (20 мг + 95 мг/2,5 мл H2O/кг).
Количественное измерение содержания NO в тканях проводили в лаборатории физико-химических полимеров Института химической физики ФАНО (Москва) методом электронно-парамагнитного резонанса (ЭПР). Спектры ЭПР регистрировали при 77К на модифицированном радиоспектрометре ЭПР – Радиопан (Польша) в Х-диапазоне. Гамма-резонансные спектры снимали на ГР- спектрометре ИХФ РАН электродинамического типа с равноускоренным движением g-квантов. Количественную оценку выработанного в тканях крыс NO проводили по включению его в парамагнитные мононитрозильные комплексы ДЭТК-Fe2+. “Ловушка” способна накапливаться в тканях и связывать как свободный NO, так и перехватывать его с эндогенных нитрозильных комплексов. В отличие от эндогенных комплексов NO, комплекс «ловушка-NO» стабилен в биологической среде при действии кислорода и других окислителей. Поэтому интенсивность соответствующего сигнала ЭПР отражает интенсивность синтеза NO в тканях. Эти комплексы характеризуются сигналами электронного парамагнитного резонанса с положением g1=2,035; gII=2,012 и сверхтонкой триплетной структурой при g1=2,035. Содержание NO в тканях выражали в условных единицах. Одна условная единица соответствует 3,3-м нанограммам окиси азота на 1 г влажной ткани. Для оценки состояния кровообращения [37] в исходном периоде, через 30 минут гипотензии (перед инфузией), через 10 мин, 1ч после инфузии кровезаменителя регистрировали показатели и производили забор проб крови.
Оксид азота в тканях крыс при травматическом шоке
В этом разделе изучалась возможности повышения эффективности инфузионной терапии геморрагического шока с помощью донора NO – L-аргинина, который вводили в 7-й серии опытов за 20 минут до начала кровопотери (n = 10) и после окончания кровопотери осуществляли инфузию ФР. В 8-й серии (n= 7) L-аргинин в той же дозе вводили в составе инфузионной среды после окончания кровопотери. Как видно из данных представленных в таблице 16, в результате кровопотери АД во всех группах животных снижалось почти в 3 раза по сравнению с исходным состоянием. Показатели минутного объёма кровообращения и ударного объёма сердца снижались в 3,0-3,5 раза, значительно уменьшался рабочий индекс левого желудочка и общее периферическое сопротивление кровотоку.
В серозной оболочки стенки тонкой кишки крыс наблюдались выраженные нарушения МЦ (таблица 17): уменьшение на 50% количества функционирующих капилляров, замедление скорости кровотока, агрегация эритроцитов. В артериальной крови снижался рН, отмечался выраженный дефицит буферных оснований, увеличивалось напряжение углекислоты (рСО2) (таблица 18).
Необходимо отметить, что к окончанию кровопотери как в контроле, так в 7-й и 8-й сериях опытов наблюдаемые изменения практически не отличались друг от друга. Инфузионную терапию проводили на фоне выраженных нарушений системной гемодинамики, МЦ и метаболического ацидоза.
Через 10 мин после окончания инфузии во всех сериях опытов АД статистически значимо повышалось, но не достигало исходных величин (таблица 16). МОК и УО также увеличивались, хотя и в разной степени. Введение L-аргинина как до начала, так и после кровопотери способствовало значительному росту вышеуказанных параметров (таблица 16). Однако в контрольной серии этого не отмечалось. В большей степени оказывал положительное воздействие донора NО, вводимый после кровопотери в составе инфузионной среды. РИЛЖ, резко сниженный в результате кровопотери, возрастал после инфузии, но меньше всего в контроле. L-аргинин способствовал статистически значимо большему увеличению РИЛЖ по сравнению с введением только солевого раствора. ОПС уменьшалось после проведения инфузионной терапии. Самые низкие показатели ОПС были в результате введения L-аргинина в составе инфузионной среды (8-я серия).
Исследование состояния МЦ в стенке тонкого кишечника крыс показало, что количество функционирующих капилляров, резко сниженное в результате кровопотери, восстанавливалось после инфузионной терапии. Это восстановление было одинаковым при применении продуцента (таблица 17). Увеличивалась и скорость кровотока в капиллярах. Причем, L-аргинин, введенный до начала кровопотери, практически не влиял на скорость кровотока, о чем свидетельствуют значения этого показателя, близкие к контролю. В то же время L-аргинин, вводимый в составе инфузионной среды, способствовал, как видно из таблицы 17, полному восстановлению скорости кровотока, до нормы снижалось количество агрегатов эритроцитов.
При анализе газового состава крови животных (рО2 – напряжение кислорода, рСО2 – напряжение углекислоты) выявлено, что рО2 после кровопотери незначительно увеличивалось, а рСО2 снижалось. В ходе эксперимента рО2 практически не изменялось (таблица 18).
Таблица 18 – Газовый состав и кислотно-основное состояние в артериальной крови крыс при инфузионной терапии геморрагического шока: 6 серия – инфузия изотонического раствора натрия хлорида (контроль, n=16); 7 серия – введение L-аргинина до кровопотери с последующей инфузионной терапией (n=10); 8 серия – введение L-аргинина после кровопотери в составе инфузионной среды (n=7), М±m
Как видно из таблицы 18, в результате проведения инфузионной терапии наибольшая коррекция ацидоза отмечалась в 8-й серии экспериментов – после введения L-аргинина в составе ФР. К окончанию инфузии дефицит буферных оснований уменьшился и в серии с предварительным введением продуцента NО. Применение L-аргинина позволило увеличить сроки жизни животных. Выживаемость крыс составляла в 6-й серии лишь 50%, в то время как в 7-й серии – 80% ,а в 8-й – 86%.
Таким образом, L-аргинин улучшает работу сердечной мышцы, снижает ОПС, восстанавливает нарушенную микроциркуляцию. Можно полагать, что введение L-аргинина для увеличения генерации NO [90, 116], способствует сохранению его “базального” уровня, что необходимо для поддержания вазодилятаторного тонуса как в артериальных, так и в емкостных сосудах. Подтверждением этого являются результаты 8-й серии экспериментов (введение L-аргинина после окончания кровопотери в составе солевого раствора), в которых при низком ОПС отмечалось выраженное восстановление микроциркуляции.
Механизм защитного действия L-аргинина на сердце, возможно, связан и с тем, что аргинин защищает кардиомиоциты от действия свободных радикалов [43], поскольку аргинин через орнитин может превращаться в глютаминовую кислоту, обладающую антиоксидантным действием.
Таким образом, предварительное (до начала кровопотери) введение донора NО – L-аргинина повышает устойчивость животных к геморрагическому шоку. L-аргинин, введенный после кровопотери в составе инфузионной среды, облегчает течение тяжелой кровопотери и способствует большей выживаемости животных по сравнению с контролем.
Инфузия N5-(1- иминоэтил)-L-орнитин дигидрохлорида
Под влиянием L-NІL в составе инфузии АД восстанавливалось в той же мере, что и в контроле, но показатели сердечной деятельности улучшались значительно. Особенно выражено участие сердечного компонента в экспериментах с L-NІО и аминогуанидином, где зарегистрировано повышение АД и высокие УО и МОК. Расчет РИЛЖ в этих экспериментах свидетельствует о том, что он значительно возрастал и даже превышал исходные значения. Следовательно, увеличение ударного объема было вызвано, скорее всего, усилением сократительной активности миокарда. Известно, что избыток оксида азота неблагоприятно влияет на коронарный кровоток и сократительную активность миокарда [151]. Согласно литературным данным, значительным источником NO во время циркуляторного шока в сердечной мышце может являться митохондриальная изоформа синтаз [89, 112]. Известно, что NO угнетает функцию митохондрий [112, 114]. Возможно, усиление работы сердца, выявленное в наших экспериментах под влиянием селективных ингибиторов, связано с улучшением функции митохондриального аппарата клеток миокарда (активацией процессов тканевого дыхания в кардиомиоцитах). Показатели КОС и содержания газов в артериальной крови животных во всех сериях опытов не отличались. Можно лишь отметить, что дефицит буферных оснований уменьшался более заметно после использования L-NО.
При инфузионной терапии геморрагического шока у животных селективные ингибиторы L-NО и аминогуанидин оказались более активными по сравнению с L-NL и S-метилизотиолом, что позволяет говорить об их высокой селективности при использовании на данной модели геморрагического шока. Согласно данным литературы, все селективные ингибиторы практически в той или иной степени неселективны, т.е. могут частично угнетать и конститутивную синтазу оксида азота. Авторы [33] предлагают для определения изоформенной селективности ингибиторов разделить их на неселективные (превышение активности одной изоформы к другой менее чем в 10 раз, например в нашем случае NG-нитро-L-аргинин), частично селективные (превышающие в 10-50 раз, L-NL и аминогуанидин) и селективные (превышающие более чем в 50 раз). Результаты наших экспериментов показали, что селективное ингибирование избыточной продукции NO при геморрагическом шоке L-NL, L-NО и аминогуанидином оказалось благоприятным, вероятно, оно не затрагивало eNOS.
Таким образом, избирательные ингибиторы синтеза NO, снижая его генерацию при инфузионной терапии геморрагического шока, улучшают деятельность сердечно-сосудистой системы, вероятно, за счет увеличения коронарного кровотока и как следствие, сократительной активности миокарда, восстанавливают МЦ несмотря на сниженное ОПС. Ингибиторы с большей степенью селективности способствуют высокой выживаемости. Об этом свидетельствуют данные о продолжительности жизни животных: 100% после введения L-NО и аминогуанидина, 67% после введения L-NL, в то время как в контроле (инфузия только солевого раствора) – 54% . После введения менее селективного ингибитора S-метилизотиола выживаемость животных была даже меньшей, чем в контроле – 44%.
Следовательно, оксид азота, несомненно, играет важную роль в регуляции кровообращения при геморрагическом шоке. Предварительное введение регуляторов синтеза оксида азота существенно изменяет развитие массивной кровопотери. Полученные данные позволяют полагать, что на ранних стадиях геморрагического шока продукция оксида азота носит защитный характер. Подавление генерации оксида азота неселективными ингибиторами его синтеза вызывает чрезмерную централизацию кровообращения, которая может привести к повреждению органов и тканей и ранней гибели животных. Необходимость поддержания “ базального уровня” оксида азота подтверждается нашими исследованиями с предварительным введением донора NO L-аргинина, а также данными с применением относительно селективного ингибитора S-метилизотиола. Результаты проведенных экспериментов позволяют заключить, что при инфузионной терапии геморрагического шока необходимо эндотелийзависимое регулирование сосудистого тонуса. L-аргинин, как донор NO, можно рекомендовать при геморрагическом шоке в клинической практике для улучшения деятельности сердечно-сосудистой системы. При введении L-аргинина с инфузионной средой восстанавливается МОК, и это происходит не в результате изменения частоты сердечных сокращений, а благодаря увеличению ударного объема сердца, т.е. усиливается сократительная активность миокарда. Кроме того, L-аргинин увеличивает скорость кровотока в капиллярах. L-аргинин, с нашей точки зрения, можно рассматривать как перспективное средство для применения как в предоперационном периоде, так и при инфузионной терапии геморрагического шока. Результаты экспериментов позволили выявить высокую эффективность избирательных ингибиторов NO при инфузионной терапии геморрагического шока. Большинство из них, регулируя содержание оксида азота при кровопотере и шоке, селективно уменьшают избыток NO. Полученные результаты согласуются с данными зарубежных исследователей [203], показавших, что применение при геморрагическом шоке селективных ингибиторов iNOS вызывает рост сердечного выброса, увеличение венозного возврата крови, а также сохранение почечного кровотока, скорости фильтрации, защиту от органных повреждений и увеличение выживаемости экспериментальных животных [170, 203]. Таким образом, проведенные нами эксперименты и полученные результаты, позволяют выяснить роль оксида азота при геморрагическом шоке и открывают новые терапевтические возможности повышения эффективности инфузионной терапии шока регуляторами синтеза оксида азота.
![Роль гистамина, рецепторов Н1, Н2, Н3/4-типа и оксида азота в регуляции синтеза IgE в норме и при поллинозе [Электронный ресурс]](/i/i/4282/212410.png "Роль гистамина, рецепторов Н1, Н2, Н3/4-типа и оксида азота в регуляции синтеза IgE в норме и при поллинозе [Электронный ресурс] Лесик Дина Владимировна")
