Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы. Современные взгляды на принципы прогнозирования эффективности таргетной терапии и механизмы развития резистентности у больных хроническим миелолейкозом 12
1.1 Определение, этиология, распространенность, патогенез и стадии хронического миелолейкоза 12
1.2 Современные подходы к терапии хронического миелолейкоза 13
1.3 Определение групп риска и критерии оценки ответа на проводимую терапию 15
1.4 Клиническая значимость мутаций киназного домена гена BCR-ABL 19
1.5 Клиническое значение дополнительных хромосомных аберраций 26
1.6 Влияние сочетанного обнаружения дополнительных хромосомных аномалий и мутаций гена BCR-ABL 29
1.7 Индивидуализация терапии ингибиторами тирозинкиназ у больных хроническим миелолейкозом 31
Глава 2. Методы исследования и характеристика пациентов 34
2.1 Дизайн исследования 34
2.2 Характеристика исследуемой группы пациентов 35
2.3 Методы исследования
2.3.1 Клинические и инструментальные методы 41
2.3.2 Метод цитогенетического анализа 43
2.3.3 Метод флуоресцентной на стекле гибридизации (FISH) 45
2.3.4 Метод качественного определения химерного гена BCR-ABL 46
2.3.5 Метод количественного определения экспрессии гена BCR-ABL...50
2.3.6 Метод анализа мутационного статуса гена BCR-ABL 51
2.4 Статистическая обработка данных 54
Глава 3. Результаты исследований 55
3.1 Оценка влияния динамики уровня экспрессии гена BCR-ABL на результаты терапии 55
3.1.1 Определение прогностической способности динамики уровня экспрессии гена BCR-ABL 55
3.1.2 Оценка влияния динамики уровня экспрессии гена BCR-ABL в течение первых трех месяцев терапии для достижения большого молекулярного ответа на 12 месяцев терапии в обучающей выборке 56
3.1.3 Оценка влияния динамики уровня экспрессии гена BCR-ABL и частота достижения оптимального ответа в контрольной группе...59
3.2 Исследование значения дополнительных хромосомных аберраций и мутаций киназного домена гена BCR-ABL для выживаемости больных хроническим миелолейкозом 63
3.2.1 Анализ влияния дополнительных хромосомных аномалий на выживаемость 63
3.2.2 Исследование значения точечных мутаций гена BCR-ABL 72
3.2.3 Сочетание дополнительных хромосомных аберраций в Ph-положительных клетках и мутаций гена BCR-ABL 78
3.3 Программа прогнозирования эффективности таргетной терапии больных хроническим миелолейозом 81
Обсуждение 82
Выводы 91
Практические рекомендации 92
Список сокращений и условных обозначений 94
Список литературы
- Определение групп риска и критерии оценки ответа на проводимую терапию
- Характеристика исследуемой группы пациентов
- Оценка влияния динамики уровня экспрессии гена BCR-ABL в течение первых трех месяцев терапии для достижения большого молекулярного ответа на 12 месяцев терапии в обучающей выборке
- Исследование значения точечных мутаций гена BCR-ABL
Введение к работе
Актуальность исследования
Достижения в понимании молекулярно-биологических особенностей развития хронического миелоидного лейкоза (ХМЛ), внедрение терапии ингибиторами тирозинкиназ (ИТК), системы контроля эффективности терапии, молекулярный анализ механизмов резистентности явились основой для разработки современных принципов лечения онкогематологических заболеваний.
Применение первого ингибитора тирозинкиназ – иматиниба в клинической практике в течение последнего десятилетия позволило кардинально повысить выживаемость больных ХМЛ. Общая 8-летняя выживаемость у больных хронической фазой (ХФ) ХМЛ составляет 85%, выживаемость без прогрессирования до фазы акселерации (ФА) и бластного криза (БК) – 92%, что было недоступно при использовании предшествующих методов лечения [Deininger M. et al., 2009]. Частота прогрессирования болезни при длительной 5-8 летней терапии иматинибом не превышает 0,5%. О бщая 5-летняя выживаемость больных, достигших раннего молекулярного ответа (BCR-ABLIS10% ) к 3 месяцам терапии, составляет 95% [Hanfstein B. et al., 2012].
Однако, только около половины больных ХМЛ при терапии иматинибом достигают оптимальных ответов на лечение и подвержены минимальному риску развития рецидива и смерти, связанной с прогрессированием заболевания. Резистентность к проводимой терапии ИТК развивается на различных этапах лечения. Основой развития резистентности могут быть как несоблюдение протокола терапии и необоснованные перерывы в лечении, так и биологически обусловленные механизмы (BCR-ABL-зависимые или независимые), требующие дополнительного пристального внимания [Туркина А.Г. и соавт., 2012]. Вклад некоторых из них до сих пор является не до конца изученным, а полученные данные, в ряде случаев, – противоречивыми. Больные с резистентностью к иматинибу требуют своевременного переключения на терапию ИТК второго поколения (ИТК2), а в некоторых случаях проведения аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых кроветворных клеток (аллоТГСК), сопряженной с ограничениями по возрасту, значимыми рисками летальности и инвалидизации [Saussele S. et al., 2010].
Основными причинами резистентности ХМЛ к терапии таргетными препаратами являются:
– точечные мутации киназного домена гена BCR-ABL, которые приводят к конформационным изменениям BCR-ABL-тирозинкиназы и неэффективности ИТК;
– обнаружение дополнительных хромосомных аберраций (ДХА).
О роли мутаций и ДХА в развитии резистентности за последние годы накоплено довольно много данных, но частота, спектр и их прогностическое значение остаются малоизученными. Известно, что развитие точечных мутаций гена BCR-ABL ассоциировано с высокой вероятностью прогрессии заболевания и меньшей выживаемостью больных [Абдулкадыров К.М. и соавт., 2013]. Обнаружение ДХА также связано с прогрессией ХМЛ в фазу акселерации и бластного криза [Виноградова О.Ю. и соавт., 2012; Cortes J.E. et al., 2003; Cortes J.E. et al., 2004]. В большинстве имеющихся рекомендаций наличие ДХА на момент диагностики расценивается как предупреждение, в то время как появление ДХА в ходе лечения рассматривается как неудача терапии. Вместе с этим, частота и клиническое значение сочетания Д ХА и точечных мутаций BCR-ABL в настоящее время изучены недостаточно [Kim T.D. et al., 2010; Schnittger S. et al., 2010; Meggyesi N. et al., 2011].
Существующие прогностические шкалы определения групп риска учитывают фазу заболевания на момент диагностики и не оценивают скорость элиминации опухолевого клона и переносимость проводимой терапии [Sokal J.E. et al., 1984; Hasford J. et al., 1998; Hasford J. et al., 2011]. У части больных низкой группы риска оптимальный ответ не достигается по разным причинам: неудовлетворительная переносимость лечения (токсичность), резистентность, низкая приверженность к терапии. Гематологическая и негематологическая токсичность, которая развивается в ходе терапии, очень часто приводит к временной отмене ИТК, что в свою очередь снижает эффективность лечения.
Именно поэтому большое количество исследований в последние годы направлены на разработку персонализированной терапии ХМЛ, основанной на индивидуальных характеристиках опухоли [Branford S. et al., 2014; Hanfstein B. et al., 2014]. Таким образом, исследование биологических причин резистентности, динамики индивидуального ответа на терапию, для раннего предотвращения прогрессирования заболевания в продвинутые фазы и достижения оптимального результата лечения у пациентов с ХМЛ остается актуальной проблемой.
Степень разработанности темы
Накоплено большое количество данных, свидетельствующих о негативном влиянии ДХА и мутаций киназного домена гена BCR-ABL на частоту прогрессирования и выживаемость у больных с ХМЛ. Тем не менее, существующая классификация ДХА основана только на частоте их встречаемости. Имеющиеся результаты влияния «значимых» и комплексных ДХА в Ph-положительных клетках противоречивы. Значение обнаруженных мутаций киназного домена гена BCR-ABL хорошо изучено у больных Х МЛ с резистентностью к терапии иматинибом. Данные по значимости мутаций у больных ХМЛ, получающих терапию ИТК2, ограничены достижением цитогенетических или молекулярных ответов. Также, в литературе отсутствуют сведения о прогностическом значении сочетанного обнаружения ДХА и точечных мутаций гена BCR-ABL. Общепринятые прогностические шкалы и суррогатные маркеры раннего ответа на лечение для определения эффективности терапии не учитывают индивидуальную скорость элиминации опухолевого клона и переносимость проводимой терапии.
Цель исследования
Разработать программу прогнозирования эффективности таргетной терапии больных хроническим миелолейкозом на основе анализа динамики уровня экспрессии гена BCR-ABL, дополнительных хромосомных аберрации и точечных мутаций гена BCR-ABL.
Задачи исследования
-
Оценить возможность прогнозирования эффективности таргетной терапии больных хроническим миелолейкозом на основании динамики уровня экспрессии гена BCR-ABL в течение первых трех месяцев лечения.
-
Определить частоту обнаружения дополнительных хромосомных аберраций в Ph-положительных клетках и их влияние на общую выживаемость и летальность, связанную с прогрессией хронического миелолейкоза.
-
Выявить взаимосвязь мутаций киназного домена гена BCR-ABL с общей выживаемостью и частотой летальных исходов, обусловленных прогрессированием у больных хроническим миелолейкозом.
-
Проанализировать общую выживаемость и летальность, связанную с прогрессированием хронического миелолейкоза при сочетанном выявлении дополнительных хромосомных аберраций и мутаций гена BCR-ABL.
-
Разработать программу прогнозирования эффективности таргетной терапии больных хроническим миелолейкозом, основанную на оценке индивидуальных биологических характеристик опухоли.
Научная новизна исследования
По результатам исследования впервые продемонстрирована целесообразность использования динамики уровня экспрессии гена BCR-ABL в течение первых трех месяцев лечения для прогнозирования эффективности терапии больных хроническим миелолейкозом.
Получены новые данные о взаимосвязи комплексных дополнительных хромосомных аномалий в Ph-положительном клоне, а также сочетания дополнительных хромосомных аберраций и мутаций в киназном домене гена BCR-ABL с уменьшением общей выживаемости и увеличением частоты летальных исходов, связанных с прогрессией заболевания у пациентов с хроническим миелолейкозом.
Установлена ассоциация между обнаружением точечных мутаций гена BCR-ABL и увеличением рисков прогрессирования заболевания и летальных исходов по причине прогрессии хронического миелолейкоза.
Впервые разработана программа прогнозирования эффективности таргетной терапии у больных хроническим миелолейкозом на основании биологических характеристик опухоли.
Практическая значимость работы
Разработан способ прогнозирования эффективности терапии у больных хроническим миелолейкозом с использованием методики определения динамики уровня экспрессии гена BCR-ABL. Установлена необходимость сочетанного цитогенетического и молекулярно-генетического мониторинга терапии хронического миелолейкоза для выявления комплексных дополнительных хромосомных аберраций в Ph-положительных клетках и мутаций гена BCR-ABL. Доказано негативное влияние сочетания дополнительных хромосомных аномалий в Ph-положительных клетках и мутаций киназного домена гена BCR-ABL на общую выживаемость и летальность, связанную с прогрессированием хронического миелолейкоза. Предложена и обоснована программа прогнозирования эффективности таргетной терапии больных хроническим миелолейкозом, основанная на оценке индивидуальных биологических характеристик опухоли.
Основные положения, выносимые на защиту
1. Динамика уровня экспрессии гена BCR-ABL в течение первых 3 месяцев лечения
может использоваться для прогнозирования эффективности дальнейшей терапии больных
хроническим миелолейкозом.
-
Комплексные дополнительные хромосомные аберрации в Ph-положительных клетках являются фактором, оказывающим влияние на выживаемость и летальность, связанную с прогрессированием хронического миелолейкоза.
-
Мутации гена BCR-ABL увеличивают частоту летальных исходов у больных вследствие прогрессирования хронического миелолейкоза и уменьшают общую выживаемость при терапии ингибиторами тирозинкиназ.
4. Сочетание дополнительных хромосомных аберраций и мутаций в киназном домене
гена BCR-ABL негативно влияет на общую выживаемость и летальность от прогрессии
хронического миелолейкоза.
5. Оценку вероятности достижения оптимального ответа у больных хроническим
миелолейкозом целесообразно проводить с использованием программы прогнозирования
эффективности таргетной терапии.
Степень достоверности, публикации и апробация диссертации
Степень достоверности обусловлена проведением исследований у большой группы больных (359 пациентов), использованием достоверных методов исследования, качеством проведения лабораторных анализов и статистической обработкой полученных результатов.
Всего по теме диссертации опубликована 21 научная работа, включая тезисы в сборниках конференций, из которых – 7 статей в журналах, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ для опубликования основных научных результатов диссертации на соискание ученой степени кандидата и доктора медицинских наук.
Материалы диссертации представлены на Научном совещании исследовательской группы ХМЛ (Russian Investigators Group – RING, Москва, 2014), Научном совещании Европейского общества по борьбе с лейкозами (ELN Frontiers, Берлин, Германия, 2014), 56-ом Ежегодном собрании Американского общества гематологов (56th American Society of Hematology Annual Meeting, Сан-Франциско, США, 2014), 57-ом Ежегодном Собрании Американского Общества Гематологов (57th American Society of Hematology Annual Meeting, Орландо, США, 2015), 20-ом Конгрессе Европейской Гематологической Ассоциации (20th Congress of European Hematology Association, Вена, Австрия, 2015), 3-ей Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Генетика опухолей кроветворной системы» (Санкт-Петербург, 2015), III Конгрессе Гематологов России (Москва,
2016), 21-ом Конгрессе Европейской Гематологической Ассоциации (21st Congress of European Hematology Association, Копенгаген, Дания, 2016).
Личный вклад автора
Автором лично проведены: анализ источников литературы, планирование диссертационного исследования, сбор анамнеза, обследование, установление диагноза, назначение терапии и последующий мониторинг лечения пациентов. Также выполнялся сбор биологических образцов путем взятия крови, выполнение стернальных пункций, участие в проведении и интерпретации результатов цитогенетических и молекулярно-генетических исследований. Диссертантом лично проведены создание базы данных, последующий статистический анализ, обобщение и интерпретация полученных результатов исследования, подготовка к публикации тезисов и статей по теме работы. Самостоятельно представлял результаты исследования в печатных публикациях, выступлениях на научных конференциях.
Структура и объем работы
Диссертационная работа изложена на 114 страницах машинописного текста и состоит из введения, глав обзора литературы, описания методов и характеристики пациентов, результатов исследования, обсуждения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Библиография содержит 163 источника ли тературы. Работа включает 27 рисунков и 19 таблиц.
Определение групп риска и критерии оценки ответа на проводимую терапию
Целью современной терапии ХМЛ является максимальное подавление Ph-положительного опухолевого клона. Стандартом лечения в настоящее время является терапия ингибиторами BCR-ABL-тирозинкиназы (ИТК), которые обладают таргетным механизмом воздействия на BCR-ABL-положительные опухолевые клетки.
Применение ИТК в течение последних 15 лет позволило значительно повысить выживаемость больных ХМЛ. Первым препаратом из этой группы стал иматиниб, его открытие совершило настоящий переворот в лечении ХМЛ. В 2000 году было начато многоцентровое рандомизированное исследование 3-й фазы IRIS по сравнению иматиниба с интерфероном-альфа в комбинации с малыми дозами цитозара у больных ХМЛ в ХФ, после чего иматиниб был одобрен в качестве терапии первой линии [117]. По результатам этого исследования 8-летняя общая выживаемость (ОВ) при лечении иматинибом составляет 85%, выживаемость без прогрессирования до ФА и БК – 92% [45]. Частота прогрессирования в продвинутые фазы при терапии иматинибом более 5 лет – не превышает 0,5% в год. Иматиниб относится к ингибиторам тирозинкиназ первого поколения (ИТК1), и назначается в качестве терапии первой линии большинству впервые выявленных больных ХМЛ.
Вместе с тем, при терапии иматинибом, у части пациентов с ХМЛ оптимальный ответ не достигается, либо бывает утерян вследствие резистентности или непереносимости [19]. Это в свою очередь приводит к увеличению риска прогрессирования заболевания.
С учетом успеха иматиниба были продолжены поиски новых препаратов для терапии ХМЛ и , начиная с 2006 г., зарегистрированы к применению препараты ИТК2: нилотиниб, дазатиниб и бозутиниб [53, 83, 110]. По результатам международных клинических исследований данные препараты были первоночально одобрены у пациентов с ХМЛ при резистентности и непереносимости иматиниба, а нилотиниб и дазатиниб также и в качестве терапии первой линии, когда была доказана их более высокая эффективность в сравнении с иматинибом [17, 19, 57, 67, 83, 110].
По существующим рекомендациям терапия ИТК должна проводиться в постоянном и непрерывном режиме, в течение всей жизни пациента, незамедлительно после подтверждения диагноза. Зачастую именно от этих факторов зависит успех терапии и увеличение продолжительности жизни пациентов с ХМЛ.
Несмотря на высокую эффективность ИТК, у некоторых больных наблюдается первичная или вторичная резистентность к проводимой терапии. Возможными причинами развития резистентности могут быть как несоблюдение протокола терапии и необоснованные перерывы в лечении, так и биологически обусловленные механизмы (BCR-ABL-зависимые или независимые) [12]. К сожалению, далеко не все механизмы резистентности при ХМЛ могут быть оценены в реальной клинической практике [125]. Резистентные больные ХМЛ требуют своевременного переключения на терапию ИТК2, а в некоторых случаях проведения аллоТГСК [140].
Показаниями к проведению аллоТГСК у больных в ХФ ХМЛ являю тся неудача терапии ИТК2, выявление мутации T315I [3, 19]. Тактика ведения больных в случаях резистентности или непереносимости терапии ИТК 1-3 линии должна проводиться с учетом факторов риска прогрессирования ХМЛ, переносимости ИТК и факторов риска аллоТГСК. У больных в ХФ ХМЛ до терапии ИТК обсуждение HLA-типирования целесообразно у больных из группы предупреждения с высокой группой риска прогрессии ХМЛ (выявление «клинически значимых» ДХА в Ph-положительных клетках) при условии низкого риска трансплантационных осложнений и наличии родственного донора [60]. Пациентам в БК ХМЛ рекомендовано проведение аллоТГСК от родственного или неродственного донора сразу после достижения второй ХФ на фоне ИТК и/или сочетания ИТК с химиотерапией [140].
С целью раннего выявления больных ХМЛ с высоким риском прогрессирования заболевания и ра звития резистентности к терапии введено понятие групп риска, применяемое к больным только с ХФ ХМЛ. В настоящее время в клинической практике широко используют следующие прогностические шкалы: Sokal, Hasford/EURO, EUTOS [65, 66, 143]. В 2015 г. были опубликованы данные по применению новой шкалы (ELTS – The EUTOS longerm survival score) для прогнозирования ответа на терапию у больных ХМЛ при длительном применении иматиниба, которая основана на таких характеристиках как: возраст, размеры селезенки (в см из -под края реберной дуги), количество бластов и тромбоцитов в крови [120]. Отличительной и главной особенностью этой шкалы является то , что она учитывает летальность, связанную только с прогрессией ХМЛ. Группы риска по всем вышеупомянутым шкалам рассчитываются в момент диагностики заболевания и не имеют возможности динамической оценки или рестадирования риска в ходе терапии ИТК.
В дополнение к перечисленным выше шкалам согласно рекомендациям по диагностике и лечению ХМЛ ELN и Российского Национального гематологического общества (РНГО) в качестве прогностических маркеров используют результаты оценки гематологического, цитогенетического и молекулярно-генетического ответа на определенных сроках терапии (3, 6 и 12 месяцев лечения) [3, 17, 19]. Подробные характеристики видов ответов представлены в таблице 1.1 [18, 19].
Характеристика исследуемой группы пациентов
При невозможности проведения стандартного цитогенетического исследования (плохое качество материала, недостаточное количество, наличие атипичного транскрипта) выполняли исследование костного мозга методом флуоресцентной гибридизации на стекле.
Для исследования применялась суспензия клеток костного мозга, разведенная в метанольно-уксусном фиксаторе и полученная для стандартного цитогенетического исследования или специально приготовленная (прямая культура).
Предметное стекло с нанесенной суспензией исследуемых клеток высушивалось в горизонтальном положении. ДНК-зонд (LSI BCR-ABL (Dual Color, Dual Fusion, «Vysis») раскапывали на высушенные клетки и смесь покрывалась сверху покровным стеклом. Поверх покровного стекла обильно наносился резиновый клей, и предметное стекло помещалось в термобрайт «Abbot laboratories», где в автоматическом режиме последовательно осуществлялись процессы денатурации (при температуре 73C в течение 3 мин.) и гибридзации (при температуре 37C до 24 часов). При этом камера термобрайта была увлажнена.
Через 24 часа, в предварительно разогретую водяную баню до 73C, помещался стакан Коплина с раствором 0,4%ХSSC/0,3%NP-40. Предметное стекло извлекалось из термобрайта, с помощью пинцета поверхность его освобождалась от резинового клея и покровного стекла. Предметное стекло погружалось в горячий раствор 0,4%ХSSC/0,3%NP-40 на 2 минуты, после чего переносилось в стакан Коплина с раствором 2ХSSC/0,1%NP-40 комнатной температуры на 2 минуты. Далее, на высушенное при комнатной температуре в темном месте стекло, наносили 8-10 мкл разведенного DAPI и сверху прижимали содержимое покровным стеклом. Анализ и подсчет ядер производился при помощи люминесцентного микроскопа «Leica» DM1000. Интерпретация полученных результатов осуществлялась в соответствии с Международной номенклатурой [ISCN, 2013]. Результат считался положительным в случае обнаружения двухцветного свечения nuc ish(ABL1x3)(BCRx3)(ABL1conBCRх2) и выражался в процентном соотношении проанализированных интерфазных ядер (рисунок 2.2). Анализу подвергалось не менее 200 клеток.
Исследование наличия транслокаций t(9;22)(q34;q11) с образованием химерного гена BCR-ABL, у больных ХМЛ проводили методом обратно-транскриптазной полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) на РНК из клеток периферической крови или костного мозга, забранных в вакуумные пробирки с ЭДТА и стабилизированных РНК средой. Выделение РНК из клеток крови или костного мозга проводили согласно инструкции к набору (АмплиСенс Лейкоз Квант M-bcr-FRT; ИнтерЛабСервис, Россия). Высушенный осадок РНК растворяли в 40мкл ddH2O. Раствор РНК подлежит хранению при –80С.
Для проведения обратной транскрипции к 10 мкл раствора РНК добавляли 1 мкл oligodT и 0,8 мкл гексамеров Н6 (Beagle, Россия). Пробирки со смесью помещали в амплификатор (CFX, BIORAD, США) и инкубировали при температуре 65С 5 мин. Затем в подготовленные таким образом пробы добавляли реакционную смесь, состоящую из буфера для ревертазы, смеси dNTP, ревертазы и ингибитора обратной транскриптазы в соответствии с инструкцией к набору для проведения обратной транскрипции (ОТ) (Fermentas, США). ОТ проводили по схеме: 25С- 10 мин., 43С- 60 мин., 70С-10 мин (CFX, BIORAD, США). Полученная кДНК подлежит хранению при -80С.
Для проведения ПЦР готовили смесь состава: ddH20 - 12,2 мкл, 10-кратный ПЦР-буфер (Beagle, Россия) - 2 мкл, dNTP 2,5 мМ (Синтол, Россия) - 2 мкл, Taq-полимераза (ИнтерЛабСервис, Россия) - 0,4 мкл, смесь прямого и обратного праймеров для специфичной амплификации химерного гена (10 пмоль/мкл) (Beagle, Россия) - 0,6 мкл. Также для каждого образца готовили контрольную пробу с праймерами к фрагменту гена ABL. Количество кДНК на реакцию - 3 мкл. Амплификацию проводили по схеме: 95С - 5 мин., 35 циклов: 95С - 30 сек., 69С - 30 сек., 72С - 30 сек. (Терцик, ДНК-технология, Россия) (таблица 2.6).
Полученные ПЦР-продукты анализировали в 6% полиакриламидном геле. Для этого в лунки геля помещали по 10 мкл амплификата, в одну из лунок наносили маркер молекулярного веса (ДНК фага ферментно-гидролизованная). Электрофорез вели в 0,5-кратном растворе трис-фосфатного буфера при 170В первые 10 мин., затем при 200В до выхода бромфенолового синего из геля. Далее гель окрашивали в течение 2-3 минут в растворе бромистого этидия (20 мкл на 400 мл) (Хеликон, Россия), промывали в дистиллированной воде и анализировали на трансиллюминаторе с помощью видеосистемы DocPrint (VilberLourmat, Франция).
Результат анализа для данного химерного гена считался отрицательным (транслокации нет), если на соответствующей дорожке геля отсутствовали бенды, характерные для данной транслокации, а на дорожке с контрольным фрагментом гена ABL был виден ПЦР-продукт. Если бенд для гена ABL отсутствовал, результаты признавали недействительными (рисунки 2.3, 2.4, 2.5).
Оценка влияния динамики уровня экспрессии гена BCR-ABL в течение первых трех месяцев терапии для достижения большого молекулярного ответа на 12 месяцев терапии в обучающей выборке
Малое количество наблюдений в статистически значимых признаках, влияющих на выживаемость не позволило провести сравнительный анализ в этих группах. Поэтому дальше проводился анализ кумулятивной частоты летальности от прогрессии ХМЛ.
Исследование показало, что обнаружение комплексных ДХА в Ph-положительных клетках у больных ХМЛ достоверно увеличивает 10-летнюю частоту летальных исходов , связанных с прогрессией заболевания от даты диагноза по сравнению с пациентами у которых выявлены 1ДХА и пациентами со стандартной Ph-хромосомой, 69% против 16% (p = 0,03), и против 11% (p = 0,003), соответственно (рисунок 3.9, 3.10).
В группе со стандартной Ph-хромосомой на вторую линию терапии были переведены 50 (45%) пациентов, из них с иматиниба на нилотиниб – 35, дазатиниб – 13; с нилотиниба на дазатиниб – 2. Третья линия терапии проводилась дазатинибом проводилась у 9 больных, нилотиниб получал 1 пациент. Летальность в этой группе составила 11% (12 из 110), от прогрессии заболевания умерло 4 (4%) пациента. хГ 0,9
Сравнительный анализ кумулятивной частоты летальных исходов, связанных с прогрессией ХМЛ в зависимости от количества дополнительных хромосомных аномалий в сравнении с группой без ДХА от даты диагноза (п=117) Анализ данных в этой выборке пациентов не подтвердил достоверного влияния на общую выживаемость и частоту летальных исходов в результате прогрессии ХМЛ такого фактора, как распределение больных по критериям прогностических шкал (Sokal, Hasford, EUTOS, ELTS).
Для определения влияния мутаций киназного домена гена BCR-ABL проанализированы данные 102 пациентов, которым был выполнен анализ мутационного статуса. Медиана времени от даты диагноза до даты исследования в группе с мутациями составила 51 месяц (4-115 месяцев), в группе без мутаций 19 месяцев (0-121 месяцев). Мутации выявлены у 53 пациентов, у 3 (6%) больных выявлено две мутации одновременно (всего 55 различных мутаций), таблица 3.7.
Из выявленных нами 55 мутаций к наиболее часто встречающимся мутациям относились 73% (40/55). В 66% (36/55) случаев обнаружены мутации влияющие на выбор терапии ИТК2.
В группе больных с обнаруженными мутациями гена BCR-ABL вторую линию терапии получали 32 из 53 (60%) пациентов, из них с иматиниба на нилотиниб переведено 15 пациентов, на дазатиниб – 16, пациент, получавший в первой линии нилотиниб переведен на дазатиниб. Третья линия терапии проводилась у 14 пациентов, при этом дазатиниб полу чали 10 пациентов , нилотиниб – 4.
Больные без выявленных мутаций переключены на вторую линию терапии в 29 из 49 (59%) случаев, с иматиниба на нилотиниб – 18, на дазатиниб – 11. Нилотиниб в качестве терапии третьей линии получал 1 пациент, дазатиниб 6 больных. Необходимо отметить, что мутации выявлены у 36 (68%) из 53 пациентов во время терапии иматинибом, а у остальных 17 (32%) пациентов мутации гена BCR-ABL выявлены за время терапии ИТК2.
Проведен регрессионный анализ для анализа влияния мутаций гена BCR-ABL на общую выживаемость и кумулятивную частоту летальных исходов, связанных с прогрессией ХМЛ от даты исследования мутационного статуса (таблица 3.8 и 3.9).
При многопараметрическом анализе статистическая значимость влияния на общую выживаемость и кумулятивную частоту летальных исходов, связанной с прогрессией ХМЛ от даты исследования мутационного статуса обнаружена только у группы больных с мутациями (p=0,01 и 0,05, соответственно). Такие признаки как локализация и количество мутаций, а также факт наличия мутации T315I не продемонстрировали значимого различия, за исключением влияния мутаций расположенных в области АТФ-связывающего участка и SH2-домена, при объединении этих больных (n=26) – p=0,03.
Разделение по признаку Параметр Однопараметрический анализ, p Многопараметрический анализ, p Наличие мутаций Есть мутации (n=53) 0,009 0,01 Локализация мутации Субстрат (n=6) 0,36 Р-петля (n=16) 0,73 А-петля (n=3) 1,0 АТФ (n=20) 0,006 0,15 SH-2 (n=6) 0,06 С-спираль (n=3) 0,55 SH-3 (n=2) 1,0 Количество мутаций 1 мутация (n=50) 0,04 0,18 мутации (n=3) 0,02 0,18 Мутация T315I T315I (n=15) 0,04 0,50 Другие мутации (n=38) 0,13 Таблица 3.9 – Регрессионный анализ влияния признаков на кумулятивную частоту летальных исходов, связанных с прогрессией ХМЛ от даты исследования мутационного статуса Разделение по признаку Параметр Однопараметрический анализ, p Многопараметрический анализ, p Наличие мутаций Есть мутации (n=53) 0,02 0,05 Локализация мутации Субстрат (n=6) 0,16 Р-петля (n=16) 0,54 А-петля (n=3) 1,0 АТФ (n=20) 0,003 0,06 SH-2 (n=6) 0,007 0,07 С-спираль (n=3) 0,35 SH-3 (n=2) 1,0 Количество мутаций 1 мутация (n=50) 0,05 0,76 мутации (n=3) 0,007 0,09 Мутация T315I T315I (n=15) 0,04 0,53 Другие мутации (n=38) 0,1 75 После этого мы провели сравнительный анализ общей выживаемости и кумулятивной частоты летальных исходов, связанной с прогрессией ХМЛ больных с обнаруженными мутациями гена BCR-ABL и без мутаций.
Общая 3-летняя выживаемость больных ХМЛ с обнаруженными мутациями гена BCR-ABL равна 63%. Умерло 26% (14 из 53) пациентов. В группе больных ХМЛ без мутаций общая 3-летняя выживаемость составила 92%. Умерло 6% (3 из 49) больных. Различия между группами статистически значимы, /?=0,006 (рисунок 3.11).
Исследование значения точечных мутаций гена BCR-ABL
По нашим данным частота выявляемых ДХА в Ph-положительном клоне как до начала терапии, так и в ходе ее проведения составила 12%, что согласуется с данными других исследователей [5, 10, 47, 96]. Частота выявленных аномалий в Ph-отрицательных клетках (2%) и вариантных транслокаций (4%) также не отличается от литературных данных [4, 10, 47, 96, 104]. По результатам регрессионого анализа ДХА в Phотр-клетках и вариантные вариантные транслокации t(9;22) не оказали негативного влияния на течение ХМЛ, поэтому сравнительный анализ для этой категории пациентов в дальнейшем не проводился. Наши результаты созвучны с данными исследования итальянской группы, в котором не было показано значимости выявления вариантных транслокаций для выживаемости и эффективности терапии ИТК [104]. ДХА в Phотр-клетках также не оказывают негативного влияния на выживаемость, если при этом не обнаруживается дисплазия в костномозговом кроветворении и не затронута 7 хромосома, при выявлении моносомии или делеции которой имеются сообщения о трансформации в острый лейкоз [44]. В нашем исследовании моносомия 7 хромосомы выявлена у двух пациентов (29%), летальность в группе больных с ДХА в Phотр-клетках составила 14%. В группе пациентов с вариантными транслокациями – все больные живы и продолжают терапию ИТК при медиане наблюдения 94 месяца.
Хромосомные аномалии в Ph-положительных клетках в момент диагноза обнаружены у 16 (53%) из 30 пациентов. Регрессионный анализ не показал значимого влияния времени выявления хромосомных аберраций, поэтому дальнейший сравнительный анализ влияния проводился и от даты выявления ДХА и от момента диагноза ХМЛ.
Наиболее часто встречаемые ДХА в Ph-положительном клоне (+8, -Y, +Ph, i(17)(q10)) обнаруживались у 16 пациентов (53%), при этом у некоторой части пациентов эти аберрации выявлялись в комплексе с другими. Несмотря на это, при многопараметрическом регрессионном анализе «значимые» аномалии не продемонстрировали значимого негативного влияния на выживаемость и кумулятивную частоту летальных исходов от прогрессии ХМЛ.
При разделении больных по количеству выявленных ДХА – комплексные аберрации (2 ДХА и более) выявлены в 23% (7/30) случаев. В результате проведенного многопараметрического регрессионного анализа получена статистическая значимость по их влиянию и на ОВ и на кумулятивную частоту летальных исходов, связанных с прогрессией ХМЛ при расчете от момента обнаружения ДХА (p=0,04 и p=0,02, соответственно). По данным сравнительного анализа 10-летняя выживаемость составила 31%, 10-летняя кумулятивная частота летальных исходов, связанных с прогрессией ХМЛ – 54% при медиане наблюдения 51 месяц. В группе пациентов с изолированными ДХА ОВ оказалась на уровне 77%, p = 0,05.
При определении влияния комплексных аномалий в Ph-положительных клетках на ОВ и частоту летальности по причине прогрессии заболевания от даты диагноза та кже получены достоверные различия при регрессионном анализе, и 10-летняя частота летальных исходов от прогресии ХМЛ была на уровне 69%. Ожидаемая 10-летняя кумулятивная частота летальных исходов, связанных с прогрессией ХМЛ в группе пациентов с изолированными ДХА составила 10% от даты выявления ДХА и 16% от момента диагноза (p = 0,05 и 0,03, соответственно, в сравнении с группой больных 2 ДХА и более). Кумулятивная частота летальности, связанной с прогрессией ХМЛ в группе больных со стандартной Ph-хромосомой от даты диагноза оказалась на уровне 11%, p = 0,003.
Эти данные согласуются с последним опубликованным ретроспективным исследованием влияния ДХА в Phполож-клетках на выживаемость, где больные с комплексными нарушениями кариотипа отнесены в группу «плохого прогноза» [159]. В ходе нашего исследования, несмотря на малое количество наблюдений (n=2), также статистически значимым оказалось влияние аномалий 7 и 17 хромосомы (p = 0,01), но здесь следует отметить, что эти пациенты имели комплексный кариотип, и определяющее значение, вероятно, оказал именно этот факт. Как следует из анализа литературных данных, наибольшее негативное влияние на течение ХМЛ оказывают комплексные аномалии в Phполож-клетках, как на момент диагноза, так и при их обнаружении в ходе лечения [47, 159]. Значение клональной эволюции с повреждением 8, Y и Ph-хромосомы требует дальнейших исследований.
Определенно, обнаружение в момент диагноза комплексных нарушений в Ph-положительном клоне (2 ДХА и более), изолированных аномалий в виде i(17)(q10), -7 и нарушений в 3 хромосоме позволяет отнести пациентов с критериями хронической фазы ХМЛ к группе высокого риска или «плохого прогноза». Клональная эволюция в ходе терапии ИТК также требует незамедлительных действий со стороны врача, так как это свидетельствует о прогрессии заболевания в продвинутые фазы заболевания.
При анализе больных в исследуемой нами группе во всех фазах ХМЛ и на всех линиях терапии ИТК к наиболее часто встречаемым мутациям (T315I, V299L, T315A, F317L/V/I/C, E255K/V, Y253H, F359V/C/I) относились 73% выявленных случаев [29, 40, 71, 89, 111, 147, 148, 149]. При этом у 66% пациентов были выявлены мутации, которые влияли на выбор терапии ИТК2. До начала терапии 2-й линии цитогенетическая резистентность определялась у 97% пациентов с выявленными мутациями, а в группе без мутаций – 70%, при этом молекулярная резистентность была констатирована у 97% и 90%, соответственно.
В результате многопараметрического регрессионного анализа статистически значимое негативное влияние на ОВ и кумулятивную частоту летальных исходов по причине прогрессии ХМЛ оказывал факт наличия мутаций и расположение мутаций гена BCR-ABL в области АТФ-связывающего участка и SH2-домена. В настоящее время в литературе имеется небольшое количество сообщений о влиянии мутаций на выживаемость в отдаленные сроки при терапии ИТК2, в основном проводится оценка достижения тех или иных ответов (ПЦО, ЧЦО, БМО).