Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 13
1.1. Современные аспекты классификации ОЛЛ 13
1.2. Прогностические факторы у взрослых больных Ph-негативным ОЛЛ 16
1.3. Структура цитогенетических нарушений при ОЛЛ 22
1.3.1. В-клеточный лимфобластный лейкоз/лимфома с t(9;22)/BCR-ABL1 22
1.3.2. В-клеточный лимфобластный лейкоз/лимфома BCR-ABL1-подобный 24
1.3.3. В-клеточный лимфобластный лейкоз/лимфома с t(12;21)/ETV6-RUNX125
1.3.4. В-клеточный лимфобластный лейкоз/лимфома с iAMP21 26
1.3.5. В-клеточный лимфобластный лейкоз/лимфома с t(11q23)/MLL 28
1.3.6. В-клеточный лимфобластный лейкоз/лимфома с t(1;19)/E2A-PBX1 30
1.4. Вторичные хромосомные аномалии при ОЛЛ 32
1.4.1. Перестройки гена c-MYC/t(8q24) при ОЛЛ 32
1.4.2. Инактивация гена ТР53 при ОЛЛ 34
1.4.3. Делеция 9p21/СDKN2A/p16INK4A при ОЛЛ 36
1.5. ОЛЛ с аномалиями числа хромосом 38
1.6. Комплексные нарушения кариотипа при ОЛЛ 40
1.7. Принципы терапии Ph-негативного ОЛЛ 40
1.8. Российский протокол ОЛЛ-2009 43
1.9. Заключение 45
Глава 2. Материалы и методы исследования 46
2.1. Дизайн исследования 46
2.2. Характеристика больных 47
2.3. Лабораторные исследования 50
2.3.1. Стандартное цитогенетическое исследование 50
2.3.2. Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) 51
2.3.3. Статистическая обработка полученных данных 52
Глава 3. Результаты 55
3.1. Результаты стандартного цитогенетического исследования 55
3.2. Результаты FISH исследования 60
3.3. Конкордантность СЦИ и FISH исследований 65
3.4. Анализ клинико-лабораторных показателей в группах с различными цитогенетическими нарушениями 66
3.5. Эффективность терапии по протоколу ОЛЛ-2009 в группах с различными цитогенетическими нарушениями 69
3.6. Долгосрочные результаты терапии по протоколу ОЛЛ-2009 в зависимости от цитогенетических нарушений 71
Глава 4. Обсуждение 79
Глава 5. Заключение 85
Выводы 87
Практические рекомендации 88
Список литературы 89
Приложение 1. Схема протокола ОЛЛ-2009 111
Приложение 2. Таргетные препараты 112
Приложение 3. Характеристика зондов 115
Приложение 4. Характеристика терминов и определений 118
- Прогностические факторы у взрослых больных Ph-негативным ОЛЛ
- Результаты стандартного цитогенетического исследования
- Анализ клинико-лабораторных показателей в группах с различными цитогенетическими нарушениями
- Долгосрочные результаты терапии по протоколу ОЛЛ-2009 в зависимости от цитогенетических нарушений
Прогностические факторы у взрослых больных Ph-негативным ОЛЛ
Анализ исходных клинических и лабораторных показателей в соотношении с отдаленными результатами терапии позволил сформулировать представление о факторах риска. На основании совокупности факторов риска построена концепция риск-адаптированной терапии, согласно которой интенсивность и, следовательно, токсичность терапии должны соответствовать группе риска [13].
К критериям оценки факторов риска относят такие параметры, как возраст, инициальный лейкоцитоз, иммунофенотип, специфические генотипические характеристики бластных клеток, ранний ответ на терапию, кинетика минимальной остаточной болезни (МОБ).
В зависимости от прогностических факторов выделяют стандартную, промежуточную и высокую группу риска. К группе высокого риска при В-ОЛЛ относят возраст 30 лет и старше, инициальный лейкоцитоз (более 30х109/л.), ранний фенотип (B-I по классификации EGIL), увеличение показателя ЛДГ в два раза и позднее (более, чем на 35 день терапии) достижение полной ремиссии (ПР), обнаружение t(4;11). При Т-ОЛЛ – ранние и зрелый иммунофенотипы (T-I/II и T-IV по классификации EGIL), инициальный лейкоцитоз (более 100х109/л.), позднее достижение ПР [10].
Помимо клинических и цитогенетических параметров, общепризнанным значимым прогностическим фактором, позволяющим определять прогноз заболевания (низкая или высокая вероятность рецидива), является статус МОБ. Под МОБ понимают популяцию опухолевых клеток, которая персистирует в организме после достижения клинико-гематологической ремиссии заболевания [10]. Для обнаружения МОБ используют методы проточной цитометрии и ПЦР, чувствительность которых достигает 1:104 [10]. По данным последних исследований при обнаружении МОБ в течение 6 месяцев лечения прогноз определяется как негативный [161].
Таким образом, целью определения групп риска на основании исходных клинико-лабораторных факторов является стратификация лечения, подразумевающая дифференцированный подход к выбору оптимального режима химиотерапии. Так, согласно данной концепции, пациентам из благоприятной группы риска проводят менее токсичные режимы лечения, вследствие чего снижается риск развития тяжелых осложнений. Пациентам из неблагоприятной группы проводится более интенсивное лечение с последующим обязательным выполнением трансплантации аллогенного костного мозга, что увеличивает шансы на излечение [18, 19].
У больных ОЛЛ при цитогенетическом исследовании клеток костного мозга клональные хромосомные перестройки выявляются в 60-85 % случаев, а с применением методов флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) в 80-90 % [8]. Согласно современным представлениям, модель лейкемогенеза представляет собой злокачественную трансформацию клетки, которая на молекулярном уровне проявляется нарушениями в системе передачи сигналов в клетке за счет изменения структуры или уровня продукции специфического белка – компонента определенной сигнальной цепи [3]. Повреждение онкогенных генетических детерминант (протоонкогенов, генов-супрессоров) приводит к блоку нормальной дифференцировки клетки, нарушению сопряжения процессов пролиферации и апоптоза, обретению аномальной способности к миграции и тканевой инвазии [3, 13].
Хромосомные нарушения при ОЛЛ представлены структурными и численными аберрациями [71]. При численных аберрациях происходят количественные аномалии (уменьшается или увеличивается количество хромосомного материала), что проявляется как полная или частичная трисомия, моносомия, делеции, внутри - или экстрахромосомные амплификации. Структурные хромосомные перестройки не изменяют количество хромосомного материала. Многие из аномалий являются следствием транслокаций (переноса участка хромосомы), которые могут приводить к изменению экспрессии и/или к образованию слитых (химерных) генов, продуктом которых являются химерные белки с онкогенным потенциалом [138].
В 1978 году для систематизации цитогенетических аномалий была разработана Международная цитогенетическая номенклатура ISCN (International System for Human Cytogenetic Nomenclature) [28], которая постоянно обновляется и дополняется.
«Золотым стандартом» диагностики цитогенетических нарушений при ОЛЛ являются методы стандартного цитогенетического исследования (СЦИ) и флуоресцентной гибридизации in situ (FISH). С помощью СЦИ анализируют хромосомы метафазных пластинок. Возможность анализировать весь кариотип при помощи СЦИ является важным преимуществом этого метода. Однако есть генетические нарушения, которые можно обнаружить только с помощью молекулярно-биологических методов. Одним из этих методов является – FISH. Метод позволяет идентифицировать конкретные специфические нарушения хромосом с помощью меченной флуоресцентным красителем ДНК-зонда. Он обладает рядом преимуществ перед СЦИ: при его выполнении достаточно наличие интерфазных ядер, а, следовательно, нет зависимости от успехов культивирования клеток. Кроме того, метод позволяет выявлять субмикроскопические нарушения и, соответственно, обладает более высокой чувствительностью [16].
Практическая ценность цитогенетической диагностики при ОЛЛ стала общепризнанной. Это обусловлено специфическими диагностическими и прогностическими характеристиками ряда хромосомных аномалий [3]. Детекция аномалий хромосом является обязательным условием для установления диагноза, выделения групп риска с хорошим, относительно благоприятным и неблагоприятным прогнозом. Установлено, что факторами неблагоприятного прогноза при ОЛЛ являются такие цитогенетические нарушения как t(9;22)/BCR-ABL1, перестройки гена MLL/t(11q23) и c-MYC/t(8q24), моносомия 7, гипоплоидия и комплексный кариотип (5 и более хромосомных аберраций). К факторам благоприятного прогноза относят – гиперплоидный кариотип, t(12;21)/ETV6-RUNX1 [125]. Однако необходимо подчеркнуть, что некоторые хромосомные нарушения теряют свою прогностическую значимость в зависимости от использования конкретного терапевтического подхода.
В настоящее время идентифицированы хромосомные аберрации при ОЛЛ (носящие неслучайный характер), которые определяют особенности клинического течения и прогноза заболевания. Данные о наиболее распространенных хромосомных нарушениях при ОЛЛ систематизированы и отражены в классификации ВОЗ [32].
В табл. 3 представлена информация о частоте встречаемости и прогнозе наиболее часто встречающихся цитогенетических нарушений при ОЛЛ.
Результаты стандартного цитогенетического исследования
Всем 115 пациентам, включенным в исследование, выполнено кариотипирование клеток костного мозга/лимфоузла/опухоли. У 14 % (n=16) больных по причине отсутствия митозов кариотип не был установлен. У 48 (48,5 %) из 99-и больных выявлен нормальный кариотип, у 51 (51,5 %) пациента выявлены цитогенетические аберрации (у 28 больных В-ОЛЛ, у 21 – Т-ОЛЛ и у 2-х бифенотипическим ОЛЛ) (табл. 6).
Самую многочисленную группу с аберрантным кариотипом составили больные с численными нарушениями – 32,3 % (n=32). В зависимости от численных нарушений гиперплоидный набор хромосом был выявлен у 27,2 % (n=27) больных, гипоплоидный у 5,1 % (n=5). У 19,2 % (n=19) больных были определены структурные перестройки. На основании выявления 5 и более аберраций у 17,6 % (n=9) был установлен комплексный кариотип (табл.7).
В структуре гиперплоидного кариотипа самыми частыми аномалиями были: трисомия/тетрасомия хромосомы 21 (n=9), трисомия хромосомы 8 (n=5) , дополнительная хромосома Х (n=6). Примечательно, что все случаи с трисомией/тетрасомией хромосомы 21 наблюдались у пациентов В-ОЛЛ. Массивная гиперплоидия ( 50 хромосом) была выявлена у 9 из 27 больных.
Из структурных аберраций чаще других определялась t(4;11)/MLL – у 6 (6,1 %) больных. Делеция 9p21/ CDKN2A была выявлена у 5 (5,1 %) больных. Случаи с t(8;14),t(2;8),t(8;22)/c-MYC были обнаружены у 2-х больных (2 %). T(1;19)/E2A-PBX1 и делеция 17p13/TP53 обнаружены в 1 (1 %) случае каждая. Другие неповторяющиеся хромосомные аберрации – у 10 (10,1 %) у 99 больных.
При использовании вышеописанных зондов у 61 (53 %) из 115 больных были обнаружены хромосомные аберрации. Самую большую группу составили пациенты, у которых была выявлена делеция 9p21/CDKN2A – 24,3 % (n=28). Среди них у 19 (67,8 %) больных была обнаружена биаллельная (гомозиготная) делеция 9p21/CDKN2A, у 9 (32,2 %) – моноаллельная (гетерозиготная). Отсутствие статистически значимой корреляционной связи между клинико-лабораторными показателями, эффективностью терапии, а также выживаемостью больных в группах с гетерозиготной и гомозиготной делециями 9p21/CDKN2A позволило нам объединить их в общую группу.
Перестройки гена MLL/t(11q23) были обнаружены у 7,8 % (n=9) пациентов (у 7 больных В-ОЛЛ, у 2-х больных Т-ОЛЛ). У 5,2 % (n=6) больных была выявлена делеция 17p13/TP53. У 1,7 % (n=2) – выявлены перестройки гена c-MYC /t(8q24) . У 1 (0,8 %) пациента – t(1;19)/E2A-PBX1. Ни у одного больного из 115 мы не выявили t(12;21)/ETV6-RUNX1, однако при использовании данного локус-специфического зонда, у 1 (0,8 %) пациентки выявили внутрихромосомную амплификацию хромосомы 21.
В тех случаях, где были выявлены перестройки генов MLL и c-MYC мы не проводили анализ по идентификации вовлеченных генов партнёров.
Все случаи с дополнительными сигналами от локусов генов расценивали предположительно как трисомии хромосом 8 (у 7 больных), 11 (у 2-х больных), 17 (у 5-и больных), 21 (у 7-и больных); тетрасомии хромосом 8 (у 4-х больных), 11 (у 4-х больных), 21 (у 10-и больных). У 2-х больных отсутствие сигналов от локуса хромосомы 12 было расценено как моносомия хромосомы 12.
Сочетания хромосомных аберраций были выявлены по одному случаю: делеция 17p13/TP53 и перестройки гена c-MYC /t(8q24), делеция 17p13/TP53 и перестройки гена MLL/t(11q23), iAMP21 и делеция 9p21/CDKN2A. Обобщенные результаты FISH-исследования приведены в табл. 8. Таблица 8. Результаты FISH-исследования (n=115).
Анализ клинико-лабораторных показателей в группах с различными цитогенетическими нарушениями
В анализ клинико-лабораторных показателей в дебюте заболевания в разных цитогенетических группах были включены такие показатели как возраст, концентрация гемоглобина, количество тромбоцитов и лейкоцитов в крови, процент бластных клеток в периферической крови и в костном мозге, а также биохимические показатели крови (активность ЛДГ, концентрация креатинина, общего билирубина и альбумина). В табл. 9 приведены данные в тех цитогенетических группах, где была выявлена статистически значимая корреляция (p 0,05).
При сопоставлении показателей было установлено следующее: у пациентов с делецией 9p21/CDKN2A отмечается более высокая активность ЛДГ в крови (среднее значение 1533 Ед/л., при p = 0,02). При перестройках гена MLL/t(11q23) отмечается корреляция с более высоким количеством лейкоцитов (среднее значение – 112х109/л., p = 0,0016) и бластных клеток в крови (среднее значение 80 %, p = 0,016). У больных с перестройками гена с-MYC/t(8q24) была выявлена корреляция с высокой концентрацией креатинина в крови (среднее значение – 128 мкмоль/л., p = 0,02) и старшим возрастом больных (средний возраст составил 43 года, p = 0,04). При гиперплоидном кариоипе выявлена корреляция с нормальным количеством лейкоцитов в крови (среднее количество -12х109/л., p = 0,02).
Интересный результат получен в группе больных с комплексными нарушениями кариотипа: клинико-лабораторной особенностью в данной группе явилось отсутствие высокой бластемии (среднее содержание бластных клеток в крови – 17 %, p = 0,01).
Эффективность лечения (процент достижения ПР, летальность, резистентность) проанализирована в общей группе больных (n=115) и отдельно в группах больных с различными цитогенетическими нарушениями. Характеристика терминов и определений приведена в приложении 4.
Процент достижения ПР в общей группе составил – 87,8 % (n=101). Процент ранней летальности – 7,1 %. Основной причиной смерти больных в период индукции ремиссии стали инфекционные осложнения. Доля больных, у которых ремиссия была достигнута после предфазы, составила 13,9 % (n=16), после I фазы индукции – 61,7 % (n=71), после II фазы индукции – 12,2 % (n=14). Резистентность к терапии была диагностирована у 6 (5,2 %) больных. Смерть после развития рецидива – у 8 (6,9 %) больных. Результаты эффективности терапии представлены в таблице 10.
По данным проведенного анализа мы не обнаружили статистически значимых различий между скоростью получения ПР в группах с различными цитогенетическими нарушениями. У большинства больных ПР была получена к концу первого месяца индукционной терапии по протоколу ОЛЛ-2009. Первичная резистентность к терапии была установлена у 2-х больных с делецией 9p21/CDKN2A, у 1 больного с делецией 17p13/TP53, у 1 больного с перестройками гена MLL/t(11q23), у 1 больного с гиперплоидией и у 1 больного с комплексным кариотипом. Процент летальности после развития рецидива заболевания заметно выше у больных с перестройками гена c-MYC/t(8q24) и гена MLL/t(11q23).
Долгосрочные результаты терапии по протоколу ОЛЛ-2009 в зависимости от цитогенетических нарушений
Пятилетняя общая выживаемость (ОВ) всех больных ОЛЛ (n=115) при проведении терапевтического протокола ОЛЛ-2009 составила 74 %, безрецидивная (БРВ) – 77 % (рис.7, 8).
Проведен однофакторный анализ влияния цитогенетических аберраций на параметры 5-летней общей и безрецидивной выживаемости больных ОЛЛ, а также вероятности развития рецидива.
По данным анализа в группах больных с делецией 9p21/CDKN2A и без делеции для ОВ, БРВ статистически значимые различия не получены (p = 0,2). Для ВРР получены достоверные различия: у больных с делецией 9p21/CDKN2A ВРР ниже, чем у больных без делеции (p = 0,01) (рис. 9).
При анализе ОВ, БРВ и ВРР в группах пациентов с делецией 17p13/TP53 и без делеции статистически значимых различий не выявлено (p = 0,2; p = 0,6 и p = 0,4 соответственно) (рис.10).
При анализе ОВ в группах пациентов с перестройками и без перестроек гена MLL/t(11q23) статистически значимых различий не выявлено (p = 0,3). По данным анализа БРВ и ВРР в этих группах были получены статистически значимые различия: в группе больных с перестройками гена MLL/t(11q23) показатель безрецидивной выживаемости оказался ниже (p = 0,01), а вероятность развития рецидива – выше (p = 0,0007).
Анализ ОВ, БРВ и ВРР между группами пациентов с нормальным кариотипом, гиперплоидным и гипоплоидным кариотипами, структурными перестройками, не выявил статистически значимых различий (рис.12).
Как было отмечено ранее двое пациентов, у которых были выявлены перестройки гена c-MYC/t(8q24) погибли в течение первых 6-месяцев от начала лечения по протоколу ОЛЛ-2009 в рецидиве заболевания. Таким образом, эти данные позволяют в дальнейшем анализировать наличие перестроек гена c-MYC/t(8q24) у больных ОЛЛ, как фактор неблагоприятного прогноза.
В результате проведенного исследования установлено следующее: делеция 9p21/CDKN2A, делеция 17p13/TP53, численные нарушения кариотипа не являются фактором прогноза у больных ОЛЛ при лечении по протоколу ОЛЛ-2009. Факторами неблагоприятного прогноза при данной терапевтической тактике являются наличие перестроек генов MLL/t(11q23) и c-MYC/t(8q24).
Учитывая полученные результаты исследования и ввиду небольшого числа пациентов в каждой из групп, мы объединили больных на три цитогенетические группы:
1) пациенты с наличием перестроек генов MLL/t(11q23) и c-MYC/t(8q24) (n=11),
2) пациенты с нормальным кариотипом (n=38) (отсутствие аберраций по данным СЦИ и FISH),
3) пациенты с остальными цитогенетическими нарушениями (n=66).
При анализе ОВ, БРВ и ВРР в представленных группах выявлены статистически значимые различия (рис. 13). В группе больных с перестройками генов MLL/t(11q23) и c-MYC/t(8q24) БРВ оказалась значительно ниже (p .0001), а вероятность развития рецидива значительно выше (p .0001) по сравнению с данными показателями в других группах.
В табл. 11 представлены обобщенные данные 5-летней ОВ, БРВ, ВРР в группах больных с различными цитогенетическими аберрациями.
В исследовании был проведен многофакторный анализ с включением следующих параметров: возраст (30 лет и старше), пол, повышение активности ЛДГ выше двух норм, лейкоцитоз (более 30х109/л. для В-ОЛЛ и 100х109/л. для Т-ОЛЛ), иммунофенотип (В-I, Т-I-II-IV), позднее достижение ПР, наличие делеции 9p21/CDKN2A и 17p13/TP53, перестроек генов MLL/t(11q23) и c-MYC/t(8q24). Статистически значимое влияние на БРВ (HR – 176,9, p .0001) и ВРР (HR – 6,4, p = 0,02) оказали только два признака – наличие перестроек генов MLL/t(11q23) и c-MYC/t(8q24).