Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 10
1.1. Клиническая и молекулярно-биологическая характеристика хронического лимфолейкоза 10
1.2. Процессы апоптоза в опухолевых клетках при ХЛЛ 16
1.3. Влияние химиотерапии на экспрессию генов внешнего и внутреннего путей апоптоза при ХЛЛ 23
Глава 2. Материалы и методы исследования 29
2.1. Диагностика ХЛЛ 29
2.2. Клиническая характеристика больных ХЛЛ 29
2.3. Исследование экспрессии генов внешнего пути апоптоза методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) с применением специфических праймеров к генам 38
Глава 3. Экспрессия генов апоптоза у больных с впервые выявленным хроническим лимфолейкозом в сравнении с клиническими проявлениями болезни и ответом на RFC-терапию 41
3.1. Уровень экспрессии генов внешнего пути апоптоза и клинические проявления впервые выявленном хроническом лимфолейкозе 42
3.2. Оценка влияния ритуксимаб+флударабин+циклофосфан (RFC ) программы на уровень экспрессии генов внешнего пути апоптоза 47
3.3. Анализ взаимосвязи уровня экспрессии генов внешнего пути апоптоза после проведенного курса RFC терапии в сравнении с клиническими данными 51
Глава 4. Экспрессия генов внешнего пути апоптоза у больных резистентным/рецидивирующим хроническим лимфолейкозом в сравнении с клиническими проявлениями болезни и ответом на терапию ритуксимабом и бендамустином (RB) 56
4.1 Общая характеристика больных с резистентным/рецидивирующим ХЛЛ 61
4.2 Интенсивность уровня экспрессии генов внешнего пути апоптоза и клиническая характеристика больных резистентным/рецидивирующим хроническим лимфолейкозом 61
4.3. Эффективность противорецидивной программы RB в подгруппах больных с различной интенсивностью уровня экспрессии генов внешнего пути апоптоза 62
4.4 Анализ уровня экспрессии генов внешнего пути апоптоза до и после проведения курса ПХТ у больных с резистентным/рецидивирующим хроническим лимфолейкозом 63
Заключение 78
Выводы: 84
Практические рекомендации 84
Список сокращений 87
Список литератруры 90
- Клиническая и молекулярно-биологическая характеристика хронического лимфолейкоза
- Уровень экспрессии генов внешнего пути апоптоза и клинические проявления впервые выявленном хроническом лимфолейкозе
- Анализ взаимосвязи уровня экспрессии генов внешнего пути апоптоза после проведенного курса RFC терапии в сравнении с клиническими данными
- Анализ уровня экспрессии генов внешнего пути апоптоза до и после проведения курса ПХТ у больных с резистентным/рецидивирующим хроническим лимфолейкозом
Клиническая и молекулярно-биологическая характеристика хронического лимфолейкоза
Хронический лимфолейкоз относится к группе лимфопролиферативных процессов, в основе которого лежит клональная пролиферация и аккумуляция морфологически зрелых лимфоцитов. Их иммунологический фенотип представлен CD5+, CD19+, CD20+dim, CD23+ и поверхностным иммуноглобулина dim, что указывает на клоновый характер происхождения [5] [6][7][8] Кумулятивный принцип опухолевого роста при ХЛЛ впервые сформулировал Dameshek [9], что наиболее точно отражает патогенез заболевания. Это подтверждается работами других авторов [10] [11] [12] установивших нарушения процессов апоптоза. В тоже время имеются работы, указывающие на пролиферацию в небольшом количестве опухолевых клеток [13][14]. Развитие заболевания сопровождается распространением опухолевых В-лимфоцитов, которые обнаруживаются не только в крови, но также в костном мозге, лимфатических узлах, печени, селезенке [15]. Это может приводить к выраженному гиперлейкоцитозу, массивной лимфоаденопатии, гепато- и спленомегалии, что значительно ухудшает качество жизни больных и требует проведения противоопухолевой химиотерапии [16].
Распределение опухолевых клеток в организме больного ХЛЛ происходит неравномерно, что создает топографическую асимметрию системного опухолевого процесса. В связи с этим была затруднена оценка эффективности противоопухолевой химиотерапии, так как лизис опухоли под влиянием лечения не происходит синхронно по всем топографическим зонам. Внедрение в клиническую практику стадирования ХЛЛ (Rai) позволило дать интегральную оценку распространенности болезни на основе топографической и функциональной характеристики. Кроме того, данная система стадирования ХЛЛ имеет прогностическое значение. Установлено, что Ме выживаемости при 0-стадии составляет 150 при 1-101, 2- 71, при 3- 19 и 4- 19 месяцев.
Согласно другой классификации (Binet) выделяются 3 стадии АВС на основе вовлечения зон лимфатических узлов и наличия цитопении.
Следует учитывать, что стадии являются обобщенными показателями активности болезни и не всегда отражают индивидуальные характеристики заболевания у каждого больного. Поэтому была введена дополнительная прогностическая информация [17] [18].
К ней относится степень вовлечения костного мозга, возраст, пол, время удвоения лимфоцитов крови, концентрация В2 микроглобулина.
Указанные критерии в сочетании со стадиями значительно улучшают прогнозирование течения болезни. В дополнение к клиническим факторам прогноза течение ХЛЛ используются молекулярно-биологические и иммунофенотипические и цитогенетические маркеры. К ним относятся мутационный статус вариабельного региона IgVH тяжелой цепи иммуноглобулинов, интерфазная in situ флуоресцентная гибридизация (FISH), экспрессия на опухолевых клетках CD38 и ZAP-70, хромосомные аномалии такие как del 13q, del 11q, del 17q, и приводящие к амплификации генов NOTCH1, SF3B1, BLRC3, TP53, ATM, Myd38.
Опухолевая трансформация «накладывается» на процессы нормального иммуногенеза лимфоцитов, происходящие в зародышевых центрах фолликулов лимфатических узлов. В результате фактически образуется два типа ХЛЛ: мутационный и немутационный.
Мутационный вариант ХЛЛ подразумевает, что опухолевая трансформация произошла в лимфоците, который прошел стимуляцию антигеном и в котором возникшие мутации IgVH были инициированы для расширения спектра распознаваемых антигенов и повышения авидности синтезируемых антител. Эти формы ХЛЛ отличаются более благоприятным течением. В отличие от тех форм ХЛЛ, где опухолевая трансформация произошла В-лимфоците, не прошедшем через зародышевый центр. При этом значительно различается показатель общей выживаемости, который составляет 9 лет в случаях ХЛЛ с NIgVH против 20 лет при МIgVH генах. [19] [20].
Важное прогностическое значение IgVH мутационного статуса трудно определять для каждого больного в реальной клинической практики из-за достаточно сложной технологии. В связи с этим проводились исследования, направленные на изучение корреляции между IgVH мутационным статусом и фенотипической характеристикой опухолевых клеток. Было показано [21], что CD38+ коррелирует с отсутствием IgVH мутаций, однако в других работах его способность идентифицировать мутационный статус остается недоказанной [22].
В работах, направленных, на изучение связи экспрессии генов и IgVH мутационного статуса опухолевых клеток при ХЛЛ установлено корреляция только с белком ZAP-70. Из этого следует, что экспрессия ZAP-70 является важным фактором прогноза ХЛЛ. [23] [24] [25]
Введение в клиническую практику хромосомного анализа методом FISH, позволило визуализировать многие хромосомные нарушения при ХЛЛ, так как стандартная цитогенетика не обладала такими возможностями из-за низкой пролиферативной активности опухолевых клеток и ограниченного количества метафаз. Клинический анализ этого метода позволил выявить прогностическое значение основных хромосомных нарушений [26]. При этом установлено, что del 13q прогнозирует выживаемость 133 месяца, del 11q-79; трисомия 12-114; del 17p-32; при нормальном геноме - 111 месяцев. Ключевой клинической проблемой являются вопросы, связанные с назначением противоопухолевого лечения. При этом следует отметить два положения: время, когда нужно начинать терапию и какое лечение следует предпринять. Начало терапии традиционно определяется 3 и 4 стадиями по Rai [27] и временем удвоения лимфоцитов 6 месяцев. Однако в настоящее время этих предпосылок недостаточно, так как новые генетические и фенотипические маркеры меняют взгляды на начало терапии. Кроме того, внедрение в клиническую практику новых лекарственных препаратов с различными точками приложения химиотерапевтического воздействия на опухолевую клетку вновь делают проблему начала терапии дискутабельной, открывая перед клиницистом возможность выбора тактики лечения из нескольких доступных, каждая из которых имеет различные преимущества перед другими.
Иллюстрируя утверждение о возможности выбора терапии приведём примеры основных препаратов, применяемых при терапии B-ХЛЛ в настоящее время: хлорамбуцил, флударабин, пентастатин, кладрибин, алентузумаб, бендамустин, офатумумаб, ритуксимаб.
К новому поколению препаратов относятся ибрутиниб (обинтузумаб) [28] [29] [30] венетоклакс (иделалисиб). Иделалисиб является селективным ингибитором PI3kb, который активирует апоптоз в опухолевых клетках ХЛЛ, не влияет на Т-лимфоциты и сопровождается хорошим клиническим ответом. [31]
Проведенные исследования [32] показали, что у больных с ХЛЛ и делецией 17q или мутацией гена TP53 наблюдается недостаточный противоопухолевый ответ на пуриновые аналоги и терапию алкилирующими препаратами. Однако при таких факторах риска применение алентузумаба сопровождается клиническим эффектом, при этом считается, что данный препарат действует по TP53 -независимому пути [33]
В тоже время делеция 17р в случаях ХЛЛ, рефрактерных к флударабину и алентузумабу не является фактором плохого прогноза при лечении офатумумабом [34]
У больных с аномалиями функций белка р53 целесообразно применять препараты на основе моноклональных антител вместо мало эффективных при этом алкилирующих средств и пуриновых аналогов. [35] [36]
Особо следует отметить, что приобретенные дефекты в р53 - пути, мутации NOTCH-1 и SF3Bl и BIRC3, выявляемые у пациентов, свидетельствуют о высоком риске течения болезни, плохом ответе на стандартную химиотерпию и короткую выживаемость. Данные маркеры могут выделить больных с агрессивным течением болезни или с ответом на ХТ вплоть до прогрессии заболевания. Пациентам с нарушенными механизмами восстановления поврежденной ДНК такими как р53 дисфункция показана терапия, включающая ингибиторы тирозинкиназы, BCL2- ингибиторы, моноклональные антитела, аллогенная трансплантация и TCAR-терапия.
Напротив, пациенты с невысоким риском появления новых мутаций могут обычно наблюдаться долгое время и имеют длительный ответ на ХТ вплоть до прогрессии болезни.
Уровень экспрессии генов внешнего пути апоптоза и клинические проявления впервые выявленном хроническом лимфолейкозе
Поскольку у больных наблюдался большой разброс уровня экспрессии гена FAS, для дальнейшего исследования выборка была разделена на группы. В группу 1 были включены больные, имеющие уровень экспрессии гена FAS, близкий к уровню, наблюдаемому у здоровых доноров, обозначенный нами как нормальный уровень экспрессии. В группу 2 были включены все остальные больные. В качестве нижней границы нормального уровня экспрессии FAS использовался 25й процентиль, наблюдаемый у здоровых доноров.
При анализе показателей экспрессии генов в двух группах больных в зависимости от значений гена FAS по некоторым результатам были выявлены достоверные различия (табл. 2).
Экспрессия генов DR3, p21, Hsp27, XIAP была статистически значимо выше в группе с низким уровнем экспрессии FAS. Экспрессия генов TNFR2 и TRAIL в этой же группе была статистически значимо ниже, чем в группе с нормальным уровнем экспрессии гена FAS. Таким образом, во 2 группе была противоположная динамика значений генов DR3, p21, Hsp27 и XIAP относительно гена FAS и совпадающая динамика значений генов TNFR2 и TRAIL. Следующим этапом исследования было изучение экспрессии генов, модулирующих апоптоз в сравнении с клиническими данными (табл. 3).
В результате установлено, что в группе больных с низким уровнем экспрессии гена FAS, было статистически значимо большее поражение печени, большее количество лимфоцитов крови (p=0,001), близкое к статистически значиммому снижение Hb и количества эритроцитов. Количество больных I и II стадии болезни было статистически значимо ниже в группе с низкой экспрессией гена FAS.
Проведенное исследование было посвящено изучению экспрессии генов внешних путей апоптоза, а также генов, блокирующих апоптоз при впервые выявленном B-ХЛЛ. Была изучена экспрессия генов, обеспечивающих чувствительность к внешнему пути апоптоза DR3, DR4/5, FAS, TNFR2, TRAIL, а также генов-модуляторов апоптоза TP53, P21, Hsp27 и XIAP, и раково-тестикулярного гена PRAME, клиническое значение которых при B-ХЛЛ в настоящее время недостаточно хорошо изучено. Следует подчеркнуть, что предпринятый подход в изучении процессов апоптоза при B-ХЛЛ с позиции функциональной характеристики основных генов внешнего пути представляется достаточно новым и важным.
Построение регрессионной модели позволило установить наиболее значимые факторы, влияющие на клинические параметры первичных больных. Это были гены FAS и XIAP.
На основании активности гена FAS были выделены 2 группы больных с нормальной (1 группа) и низкой (2 группа) его активностью. При сравнительном анализе отмечается статистически значимое снижение активности проапоптотических генов во 2-группе больных. Это относится к генам FAS, TNFR2 и TRAIL с одновременным повышением экспрессии антиапоптотического гена XIAP. Установленное сочетание активности, свидетельствует о повышенном генетическом потенциале, направленном на блокирование апоптоза в этой группе больных. В рамках этой концепции следует рассматривать повышение экспрессии гена p21, блокирующего пролиферацию (p=0,03) и повышение экспрессии Hsp27, снижающего активность апоптоза (p=0,03). При этом, затруднена оценка статистически значимого повышения экспрессии гена DR3 во второй группе больных в связи с его вариабельным влиянием на процессы апоптоза. Экспрессия гена PRAME в исследуемой группе больных ХЛЛ была диагностически не значима.
Таким образом сравнительный анализ экспрессии генов, модулирующих апоптоз, в двух группах больных разделенных по уровню экспрессии гена FAS показал более выраженный антиапоптотический потенциал в группе с низкой активностью этого гена. Проведенный сравнительный клинико-генетический анализ позволил выявить более выраженные проявления болезни во второй группе больных с большим антиапоптотическим потенциалом опухолевых лимфоцитов. Это касается большей инфильтрацией печени (p=0,03), лимфоцитозом (p=0,001), сниженным уровнем гемоглобина (p=0,08) и количеством эритроцитов (p=0,08) и продвинутой стадией болезни (p=0,03). В целом, проведенное исследование показало, что повышенный антиапоптотический потенциал опухолевых лимфоцитов при впервые выявленном ХЛЛ, сопровождается большей массой опухоли и большим клинико-гематологическими проявлениями болезни.
Анализ взаимосвязи уровня экспрессии генов внешнего пути апоптоза после проведенного курса RFC терапии в сравнении с клиническими данными
В дальнейшем был проведен анализ клинических данных у двух групп больных с нормальным и низким уровнем экспрессии гена FAS после завершения 1-го цикла RFC- терапии. А также анализ количества ремиссий после 6 курсов RFC и общая выживаемости. Наибольшие различия были установлены по динамике снижения количества лимфоцитов крови (табл. 5).
У больных с низким уровнем экспрессии гена FAS количество лимфоцитов снижалось быстрее чем в группе сравнения 90% и 80% соответственно (р = 0,0019). Прирост эритроцитов был выше у больных с низким уровнем экспрессии гена FAS (р=0,05). У больных с нормальным уровнем экспрессии гена FAS установлено большее количество полных ремиссий после 6 курсов RFC-терапии (р=0,026).
Результат анализа общей выживаемости (рис. 1) не выявил различий между группами больных с нормальной и низкой исходной экспрессией гена FAS.
Таким образом, результаты собственных исследований, изложенных в данной главе, позволили установить связь между экспрессией генов апоптоза и клиническими проявлениями ХЛЛ, а также получить данные фармакодинамического влияния RFC программы на регуляцию экспрессии генов опухолевой клетки, контролирующей апоптоз.
Анализ уровня экспрессии генов внешнего пути апоптоза до и после проведения курса ПХТ у больных с резистентным/рецидивирующим хроническим лимфолейкозом
Анализ клинических данных всей группы больных (табл. 13) в процессе проведения 6 - цикловой индукции показал нарастающее противоопухолевое действие. Следует отметить положительную динамику в ответ на терапию таких показателей: лимфаденопатия, гепатоспленомегалия. В тоже время установлено статистически значимое снижение количества эритроцитов.
Опираясь на проведенный анализ данных литературы по проблеме апоптоза при ХЛЛ было сформулировано дальнейшее направление развития этой проблемы в собственных исследованиях. Одной из задач этих исследований было изучение экспрессии генов внешнего пути апоптоза у больных с ХЛЛ, получающих RFC терапию. Новизна этого подхода заключается в том, что было изучено влияние экспрессии генов внешнего пути апоптоза на клинические проявления болезни и влияние комбинации указанных препаратов на экспрессию этих генов в организме больного. По существу, речь может идти о генетической фармакодинамике RFC комбинации противоопухолевых препаратов.
Нами также отмечено, что у больных активность FAS-опосредованного сигнального пути была статистически значимо снижена, чем у здоровых людей. Это генетическое нарушение, по-видимому лежит в основе накопления опухолевых клеток при ХЛЛ, что определяет клиническую картину болезни. Более высокие значения уровня экспрессии DR4/5 больных могут иметь двоякое толкование, так как контролируют про- и антиапоптотические процессы. Более точная характеристика влияния экспрессии генов внешнего пути апоптоза на клинические проявления болезни следует из сравнительного анализа двух групп больных с низким и нормальным уровнем экспрессии гена FAS.
У больных с низким уровнем экспрессии гена FAS отмечен статистически значимо сниженный уровень экспрессии генов TRAIL и TNFR2. Снижение активности трех генов внешнего пути апоптоза в этой группе имеет соответствующие клинические проявления. Так среди больных с низким уровнем экспрессии генов апоптоза отмечено большее количество лимфоцитов и меньшее количество эритроцитов. В целом можно говорить о закономерности отношений между низкой активностью генов апоптоза и высокой массой опухоли у больных с впервые выявленным ХЛЛ, влияющей на клинические показатели.
Опубликованные фундаментальные исследования по данной проблеме в целом подтверждают это положение [121] [122] [123] [124] [125] [126] [127] [128] [129] [130] [131] [132]. В результате проведенного исследования мы показали, что факторами, потенциально значимыми в патогенезе B-ХЛЛ, могут быть гены Hsp27 и XIAP, экспрессия которых была повышена при в/в ХЛЛ. Белок Hsp27 представляет собой шаперон, защищающий другие белки клетки от тепловой денатурации. Экспрессия Hsp27 позволяет опухолевой клетке проявлять большую устойчивость к стрессу. Вследствие этого прогноз онкологического заболевания ухудшается [133]. Белок XIAP представляет собой ингибитор каспаз 3, 7 и 9. Это один из значимых маркеров неблагоприятного прогноза при онкологических и онкогематологических заболеваниях [134]. Особенности экспрессии XIAP при B-ХЛЛ оставались неустановленными.
Наконец, раково-тестикулярный белок PRAME также может быть значимым неблагоприятным признаком при B-ХЛЛ. Известно только, что активность данного маркера наблюдается чаще при более продвинутых стадиях заболевания [135]. Особое внимание следует уделить тому факту, что ген PRAME находится в локусе гена -цепи иммуноглобулина, что может нарушать его синтез при L клональности В-ХЛЛ, что улучшает прогноз болезни [136]. Важно подчеркнуть, что установленная в наших исследованиях активация генов апоптоза FAS и TRAIL после RFC- терапии находит свое выражение в клинических результатах, зафиксированных после проведения первого цикла лечения. Динамика снижения лимфоцитоза крови и нарастание количества эритроцитов были статистически значимо выше в группе больных с низкой активностью гена FAS. При анализе выживаемости двух групп больных не получено статистически значимых различий.