Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 15
1.1 Клиническое использование концентратов тромбоцитов в гематологии 15
1.2 Факторы риска вероятного заражения гемотрансмиссивными инфекциями при трансфузии КТ: причины, пути решения проблемы 17
1.2.1 Обследование и отбор доноров 17
1.2.2 Заготовка и обработка КТ 21
1.2.2.1 Лейкодеплеция 21
1.2.2.2 Скрининг патогенов в КТ 22
1.2.2.3 Процессинг КТ с пониженным содержанием плазмы 24
1.2.2.4 Инактивация патогенов в КТ 26
1.3. Характеристика технологий инактивации патогенов и основной принцип действия 28
1.3.1 Фотохимические методы инактивации 29
1.3.2 Мировая практика инактивации патогенов амотосаленом и УФА 30
1.3.3 Использование технологии инактивации патогенов в России 32
1.3.4 Технология обработки тромбоцитов амотосаленом и УФА 33
1.3.4.1 Механизм действия амотосалена и УФА 34
1.3.4.3 Клиническое использование КТ после инактиваци патогенов амотосаленом и УФА 39
1.4 Методы заготовки КТ 40
1.5 Факторы, влияющие на эффективность трансфузий КТ 41
Глава 2. Материалы и методы 44
2.1 Объем и дизайн исследования качества КТ и клинической эффективности трансфузий КТ 44
2.2 Характеристика реципиентов трансфузий КТ 47
2.3 Характеристика доноров КТ 47
2.4 Критерии включения в исследование и основные понятия 48
2.5 Сбор и обработка тромбоцитов для лабораторной оценки качества и эффективности трансфузий 49
2.6 Сбор тромбоцитов для оценки эффективности трансфузий 53
2.7.1 Исследование биохимических показателей КТ 53
2.7.2 Исследование маркеров активации тромбоцитов методом проточной цитофлюориметрии 54
2.8 Методы исследования клинической эффективности трансфузий КТ 55
2.8.1 Подсчет количества тромбоцитов в периферической крови у реципиентов 55
2.8.2 Оценка лабораторных показателей эффективности трансфузий КТ 56
2.8.3 Оценка эффективности трансфузий КТ методом ТЭГ 57
2.8.4 Оценка геморрагического синдрома, анализ интервала между трансфузиями и неблагоприятных реакций после трансфузий КТ 58
2.9 Лабораторная база исследования 61
2. 10 Статистический анализ 63
Глава 3. Результаты собственных исследований 64
3.1. Исследование качества КТ 64
3.1.1 Исследование биохимических параметров КТ при хранении до 7 дней 64
3.1.2 Исследование маркеров активации тромбоцитов при хранении до 7 дней 70
3.1.3 Влияние среды суспендирования на функции тромбоцитов в процессе хранения 74
3.1.4 Влияние инактивации патогенов на функции тромбоцитов в процессе хранения 75
3.2 Исследование клинической эффективности трансфузий КТ 75
3.2.1. Оценка эффективности трансфузий КТ по количественному приросту тромбоцитов крови 75
3.2.2 Оценка эффективности трансфузий КТ в зависимости от сроков хранения и синдрома ППТ 77
3. 2. 3 Оценка эффективности трансфузий КТ методом ТЭГ 83
3.2.3.1 Оценка эффективности трансфузий ПРКТПЛАЗМА и РОКТПЛАЗМА методом ТЭГ 83
3.2.3.2 Сравнение эффективности трансфузий ПРКТSSP+ и РОКТSSP+ методом ТЭГ 85
3.2.3.3 Изменение МА в тесте «Функциональный фибриноген» после трансфузии различных типов КТ 87
3.2.3.4 Оценка эффективности трансфузий КТ, по количественному приросту тромбоцитов крови и параметрам ТЭГ 89
3.2.4 Клиническая оценка эффективности трансфузий КТ различных типов при лечении геморрагического синдрома 91
3.2.5 Оценка эффективности трансфузий КТ по интервалу между трансфузиями 94
3. 2. 6 Нежелательные посттрансфузионные реакции 96
Глава 4. Обсуждение 97
Заключение 113
Выводы 116
Практические рекомендации 117
Список сокращений и условных обозначений 120
Список литературы 122
- Обследование и отбор доноров
- Факторы, влияющие на эффективность трансфузий КТ
- Исследование маркеров активации тромбоцитов при хранении до 7 дней
- Клиническая оценка эффективности трансфузий КТ различных типов при лечении геморрагического синдрома
Обследование и отбор доноров
До настоящего времени компоненты крови остаются вероятными источниками инфекций, вызываемых вирусами гепатитов В (ВГВ), C (ВГС), цитомегаловирусом (ЦМВ), вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ), T– лимфотропным вирусом человека, а также вновь возникающих инфекций вызванными вирусами лихорадки Западного Нила, Эбола, Зика [53]. На базе ФГБУ НМИЦ гематологии с 2009 по 2012 гг. выполнена работа по изучению распространенности вирусных гепатитов В и С у больных с заболеваниями системы крови [16]. Частота обнаружения специфических маркеров ВГВ и ВГС у пациентов с заболеваниями системы крови за время стационарного лечения увеличилась, в среднем, для ВГВ в 7 раз, а ВГС –– в 4 раза. Остаточный риск трансфузионного инфицирования (ОРТИ) ВГС составил, в среднем, 1 случай на 1057 единиц перелитых компонентов крови. [4]. ОРТИ обусловлен допуском для клинического использования инфицированных компонентов крови, заготовленных от доноров в период «серонегативного окна» или, реже, в следствии ложноотрицательных результатов лабораторного анализа, полученных, в том числе, из-за наличия в крови донора генетических вариантов вируса, не выявляемых отдельными тест–системами [4]. Поскольку риск инфицирования каждой единицы кроводачи равен аналогичному риску каждой перелитой единицы компонента крови, то остаточный риск заражения реципиента пропорционален количеству перелитых единиц компонентов крови [16]. По данным Т.Ц. Гармаевой с соавт. [4], трансфузионный фактор вероятного инфицирования ВГВ и ВГС больных заболеваниями системы крови на момент проведения исследования являлся ведущим. Выявлена взаимосвязь между инфицированием ВГВ и увеличением риска летального исхода среди больных АА (ОР (отношение рисков) = 4,26; р = 0,022) и больных ОЛ (ОР = 1,83; р = 0,034) [64].
Согласно результатам исследования, проведенного Российской ассоциацией трансфузиологов [5], распространенность гемотрансмиссивных инфекций среди доноров крови в России в 2010–2012 гг. составили: для ВИЧ –162 на 1 млн. донаций, для ВГВ – 337 на 1 млн. донаций, для ВГС – 971 на 1 млн. донаций, в то время как в США параметры ОРТИ составили: для ВИЧ – 2,03; для ВГВ – 15,83; для ВГС – 9,70 на 1 млн. донаций. Таким образом, ОРТИ в России для ВИЧ, ВГВ и ВГС – соответственно, в 80, 61 и 35 раз выше, чем в США [5]. Обеспечение безопасности трансфузий компонентов крови зависит от качества тестирования доноров. Патогены могут содержаться в крови донора изначально, либо контаминировать КТ через кожу при венепункции, а также из окружающей среды при их заготовке или хранении [77]. Совершенствование методов тестирования образцов донорской крови значительно снизило вероятность передачи вирусов при трансфузиях, однако не исключило их присутствия из–за «серонегативного окна», предшествующего сероконверсии у инфицированного донора. Период «серонегативного окна» – это период между инфицированием и возможностью обнаружения маркеров вируса с помощью иммунологических лабораторных тестов [80]. Для сокращения периода «серонегативного окна», в ряде стран внедрена методика тестирования гемотрансмиссивных инфекций с помощью амплификации нуклеиновой кислоты (Nucleic acid Amplification Testing – NAT) [113]. Если от момента заражения донора ВГС прошло менее 70 дней (период «серонегативного окна»), то при тестировании иммуноферментным методом (ИФА) анти–ВГС могут быть не выявлены, а применение метода NAT, значительно сокращает период «серонегативного окна» (Таблица 1) [28, 41, 80].
В таблице 1 приведены периоды сокращения «серонегативного окна» при применении NAT в сравнении с серологическими тестами. Применение NAT сокращает период «серонегативного окна» для ВИЧ до 5 дней, ВГС – до 3–х дней, ВГВ – до 15 дней, но только при условии проведения индивидуального тестирования. В большинстве стран, использующих современные методы NAT, исследования проводятся не индивидуально, а в пулах от 6 до 16 образцов, что уменьшает чувствительность теста из - за разведения небольшого количества вируса приводит к удлинению периода «негативного окна». В Германии был зарегистрирован первый случай трансфузионного инфицирования ВИЧ после внедрения обязательного скрининга крови доноров на наличие ВИЧ–1 методом NAT в минипулах. При расследовании причин выявлено, что концентрация ВИЧ из - за разведения NAT–системы в минипулы из 6 была ниже уровня чувствительности тест–системы. Другая причина – аномальная структура нуклеиновой кислоты ВИЧ [131]. Дополнительное тестирование образцов крови доноров на наличие ВИЧ, ВГВ и ВГС методом NAT в развитых странах привело к снижению уровней рисков трансфузионного инфицирования этими вирусами. В Азиатско–Тихоокеанском регионе введение NAT–тестирования на наличие ВГВ значительно сократило «негативное окно». Тем не менее, ОРТИ сохраняется в случае мутации вируса или при латентной форме инфекции, когда уровень репликации может быть ниже предела чувствительности NAT тестирования [144]. В этих регионах существует также проблема таких инфекций, как малярия, вирус Денге и Чикунгунья, диагностика которых еще не разработана. Последние сообщения [143] свидетельствуют о потенциальной угрозе новых патогенов, таких как переносимые москитами Aedes в Швеции, вирус лихорадки Западного Нила, ставший причиной смерти 34 человек в Греции. Распространению вирусов, в том числе и новых, способствует увеличение миграционных демографических процессов [143].
Факторы, влияющие на эффективность трансфузий КТ
Hanson S.R. c соавт. [72] в 1985 г. показали, что ежедневно у здорового человека потребляется до 7х109 /л тромбоцитов. Увеличение данного потребления до 14х109/л у здоровых лиц не приводит к геморрагическим осложнениям, но у пациентов с заболеваниями системы крови даже незначительное потребление тромбоцитов до 7х109/л исчерпывает резервы и может вызывать фатальные кровотечения. Тромбоцитопения приводит к нарушению полноценности эндотелия сосудов, их ломкости и повышению проницаемости сосудистой стенки для эритроцитов и тромбоцитов, что проявляется петехиями на коже [4]. Переливание КТ пациентам с заболеваниями системы крови проводят c целью профилактики спонтанных геморрагических осложнений при тромбоцитопении, обусловленной химиотерапией, или с лечебной целью при геморрагическом синдроме[12, 96]. По мнению S.J. Slichter и соавт. [137], на эффективность трансфузий КТ влияют такие факторы, как наличие геморрагического синдрома и синдрома повышенного потребления тромбоцитов (ППТ), а также беременности в анамнезе, спленомегалия и прием амфотерицина В. Факторами, способствующими развитию синдрома ППТ, по данным S.J. Slichter и соавт. [136], являются сепсис, лихорадка, пневмония, прием антибиотиков, токсичность химиотерапии. Лихорадку как фактор, приводящий к повышенной активации эндотелиальных клеток, адгезии тромбоцитов и активации их и прокоагулянтной функции, рассматривали J.S. Flier c соавт. [59]. По их данным [59], действие при лихорадке таких цитокинов, как интерлейкин–1 и фактор некроза опухоли, усиливает секрецию простагландина Е2, что приводит к активации эндотелиальных клеток, повышенному потреблению тромбоцитов. Циторедуктивная химиотерапия, с одной стороны, приводит к эндотелиальному повреждению сосудов и в последующем повышенному потреблению тромбоцитов [34], а с другой стороны, период миелотоксической нейтропении нередко осложняется инфекцией.
Эффективность трансфузий КТ зависит от времени хранения тромбоцитов, поэтому актуален вопрос сохранности и целостности тромбоцитов при рекомендуемых производителем сроках их хранения до 7 суток, после проведения инактивации патогенов и применения добавочного раствора [127]. Одной из причин снижения эффективности тромбоцитов и сокращения срока их хранения является окислительный стресс [62]. В результате окислительного стресса образуется оксид азота, который увеличивает активацию тромбоцитов и клеточную продукцию реактивных видов кислорода [62, 103]. Показателями метаболических изменений служат такие параметры, как потребление глюкозы в КТ, приводящее к накоплению лактата, которое в свою очередь, приводит к ацидозу.
Функциональная активность тромбоцитов снижается в процессе хранения в связи с изменением формы, дегрануляцией и апоптозом [29]. На изменение качественных и количественных характеристик тромбоцитов может влиять технология инактивации патогенов в КТ [118, 133]. Антиген CD62P относится к семейству селектинов (Р–селектин). Другое название антигена CD62P – PADGEM (platelet activation dependent granule–external membrane protein), т.е. интегральный мембранный белок –гранул тромбоцитов, а также телец Вейбеля—Паладе эндотелиальных клеток и мегакариоцитов [118]. Он опосредует адгезию активированных тромбоцитов к нейтрофилам и моноцитам в процессе гемостаза. CD62P – это интегральный мембранный белок, ассоциированный с –гранулами тромбоцитов, причем в неактивированных тромбоцитах CD62P находится на внутренней стороне мембраны гранул, при активации тромбоцитов, происходит секреция их содержимого, и антиген CD62P обнаруживается на поверхности активированных тромбоцитов, что свидетельствует о спонтанной активации тромбоцитов.
Помимо спонтанной активации, маркером, определяющим функцию тромбоцитов, служит исследование доли тромбоцитов, связавшихся с антителом РАС–1 под действием агониста аденозиндифосфат (АДФ). Антитело РАС–1 взаимодействуют только со специфически активированными тромбоцитами. Агрегация тромбоцитов возможна при наличии рецепторов к фибриногену, представляющих собой гликопротеин GPIIb–IIIa, которые находятся на поверхности тромбоцитов. Моноклональные антитела РАС–1 специфичны именно к конформационно–измененному комплексу GPIIb–IIIa и распознают эпитоп, расположенный поблизости от фибриноген–связывающего рецептора [134]. Данный параметр показывает резидуальную активность тромбоцитов, способных ответить на стимуляцию АДФ. В литературе данные вопросы освещены мало.
Таким образом, необходимо изучить качество и клиническую эффективность КТ, обработанных амотосаленом и УФА, суспендированных в добавочном растворе и в плазме, в зависимости от сроков хранения КТ и с учетом факторов, влияющих на эффективность трансфузий.
Исследование маркеров активации тромбоцитов при хранении до 7 дней
В день заготовки КТПЛАЗМА доля спонтанно активированных тромбоцитов составила 16,9 (11,6 – 33,7) %. В процессе хранения КТ, суспендированных в плазме, значимо (р 0,05) увеличивалась доля спонтанно активированных тромбоцитов, достигнув максимального значения к 7 суткам хранения 61,8 (2,3 – 69,4) %, т.е. через неделю хранения более половины тромбоцитов в КТПЛАЗМА были спонтанно активированы (Рисунок 12, Таблица 11). В ПРКТПЛАЗМА с первой точки исследования (3 день) и на протяжении всего периода хранения (5 и 7 дни) доля спонтанно активированных тромбоцитов статистически значимо увеличивалась и к 7–му дню хранения достигала 66,6 (54,4–77,8) %.
В КТПЛАЗМА по мере хранения значимо уменьшалась доля тромбоцитов, способных отвечать на стимуляцию АДФ через 3, 5 и 7 дней (р 0,05) (Рисунок 13, Таблица 11). В ПРКТПЛАЗМА доля тромбоцитов, отвечающих на стимуляцию АДФ, c 3 по 7 дни хранения также значимо снижалась (Таблица 11).
В день заготовки КТSSP+ доля спонтанно активированных тромбоцитов составила 26,9 (21,6 – 36,9) % и при хранении статистически значимо увеличилась (р 0,05). В ПРКТSSP+ значимое увеличение доли спонтанно активированных тромбоцитов выявлено между 3 и 7 днями хранения (р 0,05) (Рисунок 14, Таблица 11).
Доля тромбоцитов, отвечающих на стимуляцию АДФ, уменьшалась значимо на протяжении 7 дней хранения КТSSP+ (р 0,05). При хранении доля стимулированных АДФ тромбоцитов в ПРКТSSP+ значимо не менялась (р 0,05) (Рисунок 15, Таблица 11).
С первого дня заготовки и на всех сроках хранения (за исключением 3–го дня) доля спонтанно активированных тромбоцитов в КТПЛАЗМА была значимо ниже, чем в КТSSP+ (р 0,05). Доля АДФ–активированных тромбоцитов была одинаковой в первые 3 дня, однако на 5–й день их доля была больше в КТПЛАЗМА, чем в КТSSP+, а на 7–ой день доля АДФ–активированных тромбоцитов стала больше в КТSSP+, чем в КТПЛАЗМА (Таблица 11). После проведения редукции патогенов доля спонтанно активированных тромбоцитов в процессе хранения в ПРКТПЛАЗМА и ПРКТSSP+ значимо не различалась. Доля тромбоцитов, отвечающих на стимуляцию АДФ, на 3 и 5 дни также значимо не различалась в ПРКТПЛАЗМА и ПРКТSSP+, однако на 7–ой день их доля в ПРКТПЛАЗМА была значимо меньше, чем в ПРКТSSP+ (Таблица 11).
Не выявлено значимых различий между долями спонтанно активированных тромбоцитов и тромбоцитов, активированных АДФ, между ПРКТ и КТ на протяжении всего срока хранения, за исключением доли спонтанно активированных тромбоцитов в добавочном растворе на 3 день, т.е. в день, когда они были заготовлены. После инактивации патогенов доля спонтанно активированных тромбоцитов в ПРКТSSP+ была значимо больше, чем в КТSSP+ (р 0,05). Однако при дальнейшем хранении этих различий не было (Таблица 10).
Таким образом, не отмечено негативного влияния редукции патогенов на маркеры активации тромбоцитов. На функциональную активность тромбоцитов влияли среда суспендирования и время хранения. С увеличением срока хранения спонтанная активация тромбоцитов увеличивалась во всех исследуемых образцах, а доля АДФ–активированных тромбоцитов уменьшалась лишь в образцах, суспендированных в плазме. При сравнении спонтанной активации в ПРКТSSP+ и КТSSP+ на 3 день хранения она была значимо выше в ПРКТSSP+, чем КТSSP+. К 7–му дню хранения доля АДФ–активированных тромбоцитов была значимо больше в ПРКТSSP+ и КТSSP+, чем в ПРКТПЛАЗМА и КТПЛАЗМА.
Клиническая оценка эффективности трансфузий КТ различных типов при лечении геморрагического синдрома
Из 180 трансфузий КТ, проведенных с терапевтической целью, 91 трансфузия выполнена ПРКТПЛАЗМА, 61 – РОКТПЛАЗМА, 10 – ПРКТSSP+, 18 – РОКТSSP+. Из 91 трансфузий ПРКТПЛАЗМА, проведенных для лечения геморрагического синдрома, эффективны были 48 (89%) и 13 (11%) неэффективны. Из 61 трансфузии РОКТПЛАЗМА эффективными были 51 (85,2%) и 10 (14,7%) не эффективными. Из всех трансфузий ПРКТSSP+ 1 (10%) трансфузия неэффективная и 9 (90%) – эффективных, а также все 18 трансфузий РОКТSSP+ проведенных, с терапевтической целью были эффективны (Рисунок 25).
Все геморрагические осложнения были отнесены к 1, 2 и 3–й степеням, в соответствии со шкалой ВОЗ [105]. Преобладали трансфузии КТ, после которых геморрагический синдром 1 степени был либо прекращен, либо была уменьшена его выраженность (интенсивность носовых и маточных кровотечений в 140 из 149 случаев) (Таблица 17). При проведении трансфузий КТ с целью лечения геморрагического синдрома 2 степени не удалось его вылечить у 11 (47,8%) из 23 случаев, а геморрагический синдром 3 степени – в 3 (37,5%) из 8 случаев (Таблица 17). При проведении трансфузий КТ с целью терапии геморрагического синдрома 1 степени доля трансфузий КТ больным с синдромом ППТ (19,4%) была меньше, чем при трансфузии КТ, проведенных для лечения геморрагического синдрома 2 (26%) и 3 (50%) степеней (Таблица 17).
Помимо госпитализированных больных в исследование были включены также трансфузии КТ больным, наблюдавшимся амбулаторно. Эти трансфузии составили 40% всех трансфузий КТ, проводившихся при лечении геморрагического синдрома 1 степени, все реципиенты были без синдрома ППТ. Больные, которым проводили терапию геморрагического синдрома 2 и 3 степеней, были госпитализированные, и трансфузии КТ им проводили при наличии синдром ППТ. Эти трансфузии КТ были выполнены 7 больным, у 3 из которых трансфузии КТ в рамках данного исследования повторялись от 3 до 6 раз и составили основную часть количества неэффективных трансфузий. Это были больные ОМЛ. Одному больному 45 лет, проводилась противорецидивная терапия ОМЛ по программе «HAM», которая осложнилась развитием септического шока, двусторонней пневмонией, острой дыхательной недостаточностью, кровоизлиянием в склеры глаз, внутримозговой гематомой в височной области. Другая больная, 25 лет, диагноз «ОМЛ, М4 вариант, состояние после самопроизвольного выкидыша на сроке беременности 21 неделя, миелотоксический агранулоцитоз, множественные внутримозговые субарахноидальные кровоизлияния в головной мозг, отек мозга, септический шок», ей проводилась индукция ремиссии по программе «7+3». У третьей больной, 67 лет, диагноз: ОМЛ вариант М0, первичная резистентность. У больной наблюдался геморрагический синдром и синдром ППТ. Геморрагический синдром проявлялся геморроидальными кровотечениями. В трансфузионном анамнезе обращала на себя внимание ФНГТР несколько случаев при переливании КТ. У больного 26 лет (диагноз: ОМЛ, вариант М0, состояние после трансплантации аллогенных гемопоэтических стволовых клеток) и больного 36 лет (диагноз: ОЛЛ, состояние после трансплантации аллогенных гемопоэтических стволовых клеток) была выявлена реакция «трансплантат против хозяина» с поражением кишечника, кишечное кровотечение. При неэффективных трансфузиях КТ, которые были проведены для лечения геморрагического синдрома всех степеней, помимо отсутствия эффекта по количественному приросту тромбоцитов, также наблюдалось отсутствие прироста МА на ТЭГ, в то время как при достижении целевого увеличения параметра МА, геморрагический синдром удавалось вылечить, несмотря на значимо низкий количественный прирост тромбоцитов.