Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1 Обеспечение инфекционной безопасности плазмы для фракционирования в отношении парвовируса в19 на современном этапе (обзор литературы) 10
1.1 Современное представление о возбудителе 10
1.2. Эпидемиологическое значение возбудителя для службы крови 16
1.3. Инфекционная безопасность плазмы для фракционирования 19
1.4. Методы диагностики B19V
1.4.1. Методы выявления возбудителя 23
1.4.2. Методы выявления генома возбудителя 23
1.4.3. Методы выявления антител и антигена возбудителя 24
1.4.4. Методы диагностики, используемые в службе крови 26
ГЛАВА 2. Материалы и методы 29
2.1. Исследуемый материал 29
2.2. Молекулярно-биологический метод 29
2.3. Верификация методики выявления и количественного определения ДНК B19V в образцах плазмы для фракционирования 30
2.4. Выявление антител к В19V 33
2.5. Статистическая обработка результатов 33
ГЛАВА 3. Определение инфекционной значимости ДНК В19V 34
3.1. Верификация методики выявления и количественного определения ДНК В19V методом ПЦР в плазме для фракционирования с помощью тест-системы cobas TaqScreen DPX Test 34
3.2. Выявление ДНК В19V у доноров плазмы для фракционирования 39
3.3. Определение процента образцов плазмы для фракционирования с высокой концентрацией ДНК
3.3.1. Связь высокой вирусной нагрузки в плазме для фракционирования с выработкой антител к B19V 44
3.3.2. Связь выявления высокой вирусной нагрузки B19V в плазме для фракционирования с возрастом, полом доноров, регионом их проживания, а также фактором сезонности
ГЛАВА 4. Определение эффективности тестирования плазмы для фракционирования на наличие ДНК В19V 50
4.1. Оценка риска контаминации производственных пулов 50
4.2. Клинико-экономическое обоснование внедрения в практику тестирования плазмы для фракционирования на наличие ДНК В19V 53
Заключение 61
Выводы 68
Практические рекомендации 70
Список сокращений 71
Список литературы
- Методы диагностики B19V
- Верификация методики выявления и количественного определения ДНК B19V в образцах плазмы для фракционирования
- Определение процента образцов плазмы для фракционирования с высокой концентрацией ДНК
- Клинико-экономическое обоснование внедрения в практику тестирования плазмы для фракционирования на наличие ДНК В19V
Введение к работе
Актуальность проблемы. В настоящее время при совершенствовании оказания специализированной медицинской помощи лечебно-профилактическими учреждениями Российской Федерации наблюдается повышенная потребность в препаратах крови, которая сопровождается недостатком качественного и безопасного сырья для их производства - плазмы для фракционирования (Оприщенко С.А., 2008; Селиванов Е.А., 2009; Русанов В.М. и соавт., 2012).
На современном этапе развития службы крови представляет научный интерес определение эпидемиологической значимости парвовируса В19 (B19V) при донорстве плазмы для фракционирования на территории Российской Федерации. В зависимости от состояния организма человека B19V способен вызывать различные по тяжести заболевания, начиная от инфекционной эритемы у детей и заканчивая тяжелыми формами апластической анемии, фульминантным гепатитом у лиц с иммунодефицитами. Отмечается повсеместная распространенность вируса, а также высокая восприимчивость всех возрастных групп к данному возбудителю. Установлено, что к 70-летнему возрасту до 60-70 % населения имеют антитела к B19V (Servant-Delmas A. et al., 2010) и, следовательно, перенесли парвовирусную инфекцию. Для возбудителя характерен гемотрансмиссивный путь передачи инфекции. При этом наиболее значимым фактором передачи являются препараты крови, в особенности препараты плазменных факторов свертывания крови VIII и IX. Показано, что 56 – 100 % партий препаратов фактора VIII, произведенных в Европе и США в период с 1993 по 1998 гг., были контаминированы ДНК B19V (Geng Y. et al., 2007). Это обусловлено высокой устойчивостью возбудителя к процедурам вирусинактивации. Кроме того, при острой фазе инфицирования, которая в 25 % случаев протекает бессимптомно, B19V может присутствовать в крови в очень высокой концентрации – до
1013 МЕ/мл (Young N.S., 2004). В результате, в процессе производства препаратов крови будет достаточно включения одной дозы плазмы для фракционирования, содержащей ДНК возбудителя в такой высокой концентрации, чтобы контаминировать весь производственный пул, который может содержать до нескольких тысяч контейнеров с плазмой. Поэтому практический интерес представляет определение процента выявления образцов плазмы для фракционирования с высокой вирусной нагрузкой B19V - ведущего фактора контаминации сырья для производства препаратов крови.
Степень разработанности темы. Многоцентровые исследования, проведенные в ряде стран, показали, что частота выявления ДНК B19V в популяции доноров крови составляет 0,55 – 1,9 % (Филатова Е.В. и соавт., 2010; Элижбаева М.А. и соавт., 2011; Juhl D. et al., 2014; Ke L. et al., 2011; Kleimann S.H. et al., 2007; Levican J. et al., 2011; Schmidt M., et al. 2007; Slavov S.N. et al. 2012). При этом процент выявления образцов плазмы для фракционирования с высокой концентрацией ДНК B19V среди общего числа исследованных находится на уровне 0,006 (Kooistra, K. et. al., 2011). Вопрос выявления возбудителя в Российской Федерации практически не изучен. На сегодняшний день полностью отсутствуют данные по частоте выявления ДНК B19V среди доноров плазмы для фракционирования, неизвестен процент обнаружения ДНК B19V клинически значимой концентрации в образцах плазмы для фракционирования. Вместе с тем, создание отечественных современных предприятий по производству препаратов крови определяет важность установления данных показателей и вызывает практический интерес к разработке и обоснованию алгоритма рутинного исследования на наличие ДНК B19V больших объемов донорской плазмы, направляемой на фракционирование.
Цель исследования - установить значимость тестирования плазмы для фракционирования на наличие и количественное определение ДНК B19V для
повышения инфекционной безопасности сырья, используемого в производстве препаратов крови.
Задачи исследования:
-
Определить частоту выявления ДНК B19V среди доноров плазмы для фракционирования.
-
Определить процент образцов c высокой концентрацией ДНК B19V (106 МЕ/мл и более) среди общего числа исследованных образцов плазмы для фракционирования.
-
Оценить взаимосвязь выявления высокой вирусной нагрузки B19V у доноров плазмы для фракционирования с полом, возрастом, местом проживания, а также фактором сезонности.
-
Разработать алгоритм исследования плазмы для фракционирования на наличие ДНК B19V и определить его экономическую эффективность.
Научная новизна. Впервые в Российской Федерации определена частота выявления ДНК B19V среди доноров плазмы для фракционирования и установлен процент образцов c высокой концентрацией ДНК B19V (106 МЕ/мл и более) среди общего числа исследованных образцов плазмы для фракционирования, как ведущего фактора возможной контаминации производственных пулов при выпуске препаратов крови. Проведена оценка выявляемости высокой вирусной нагрузки B19V у доноров плазмы для фракционирования с полом, возрастом, местом проживания, а также фактором сезонности. Впервые определен риск возможной контаминации производственных пулов плазмой для фракционирования с высокой концентрацией ДНК B19V.
Теоретическое и практическое значение исследования. Предложена математическая модель расчета риска возможной контаминации производственных пулов образцами плазмы для фракционирования с высокой вирусной нагрузкой B19V. Разработан алгоритм исследования плазмы для фракционирования на наличие и количественное определение ДНК B19V с
помощью тест-системы cobas TaqScreen DPX Test в пулах из 96 образцов. Определены критерий выбраковки и тактика в отношении доноров плазмы для фракционирования. Показана лабораторно-экономическая эффективность алгоритма исследования больших объемов плазмы для фракционирования.
Методология и методы исследования. В работе использованы общенаучные методы: анализ (проспективный и ретроспективный), синтез (сравнительно-сопоставительный), частно-научные методы (лабораторные методы исследования), методы вариационной статистики.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Выявляемость высокой концентрации ДНК B19V (106 МЕ/мл и более) в плазме для фракционирования, заготовленной от российских доноров, составляет 0,003 %, что представляет угрозу контаминации от 0,8 до 25 % производственных пулов.
-
Тестирование плазмы для фракционирования на наличие ДНК В19V в пулах из 96 образцов тест-системой cobas TaqScreen DPX Test с целью отбора проб с высокой концентрацией ДНК возбудителя исключает риск критической контаминации производственных пулов (концентрация ДНК В19V более 104 МЕ/мл).
Внедрение в практику. Разработанный алгоритм тестирования плазмы для фракционирования внедрен в практику работы лаборатории контроля качества (ЛКК) ФГБУ РМНПЦ «Росплазма» ФМБА России, а также включен в пусковой регламент на производство субстанции «Плазма для фракционирования» ПУР 13691313-01-12 (согласован в установленном порядке ФГУ «ГИКиМП» 18.02.2013; утвержден и введен в действие генеральным директором ФГБУ РМНПЦ «Росплазма» ФМБА России 19.02.2013).
Степень достоверности и апробация работы. Достоверность результатов подтверждается объемом фактического материала, использованием современных средств и лабораторных методов исследования. Материалы по теме диссертации были доложены и обсуждены: на VIII
Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика 2014» (г. Москва, март 2014); на III Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Инфекции и инфекционная безопасность в гематологии и службе крови» (г. С-Петербург, ноябрь 2014).
Апробация диссертации состоялась 22.05.2015 г. на заседании Ученого Совета Федерального государственного бюджетного учреждения науки «Кировский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови Федерального медико-биологического агентства».
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 87 страницах машинописного текста на русском языке, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка цитируемой литературы, содержащего 131 литературный источник, из них 31 отечественный и 100 иностранных. Работа иллюстрирована 7 рисунками и 18 таблицами.
Методы диагностики B19V
В зависимости от состояния иммунной системы человека B19V вызывает различные по тяжести заболевания. Бессимптомная форма наблюдается в 25% случаев инфицирования взрослых и до 50 % случаев - детей [114, 120]. При заражении здоровых людей самыми частыми нозологическими формами парвовирусной инфекции являются инфекционная эритема у детей [6, 12, 62, 130] и артропатии у взрослых [62, 130]. Заражение B19V беременных может привести, особенно в первом и втором триместрах, к водянке плода, спонтанным абортам или внутриутробной гибели плода [2, 13]. При имеющейся сопутствующей патологии вирус, в значительной мере, утяжеляет состояние больных. B19V может стать причиной хронической анемии у пациентов с ослабленным иммунитетом, не способных вырабатывать нейтрализующие антитела [130]. У больных гемолитической анемией, инфицированных возбудителем, приводит к развитию транзиторного апластического криза [6, 56]. Также имеются данные, указывающие на то, что B19V может приводить к фульминантному гепатиту у лиц с иммунодефицитами [1, 32]. Редкими формами парвовирусной инфекции являются васкулит, гломерулонефрит и миокардит [62].
Распространенность B19V в популяции доноров соответствует уровню распространенности возбудителя в популяции населения в целом. Распространенность вируса по странам Европы несколько различается. В скандинавских странах (преимущественно в Финляндии) распространенность B19V выше, чем в других европейских странах [92]. Уровень обнаружения вируса генотипов 2 и 3 в популяции доноров в настоящее время представляется весьма низким. При исследовании образцов, взятых с 2005 по 2007 год, генотип 2 был обнаружен только в одной из 232 исследованных единиц плазмы с высокой концентрацией ДНК B19V [76]. Распространенность генотипа 3 в настоящее время в европейской популяции также невелика. Учитывая, что частота выявления антител к B19V в популяции 18 – 30-летних доноров составляет около 60 %, то всегда имеется риск возможного забора крови или ее компонентов у первично инфицированных лиц. На основании документированной доли инфицирования женщин B19V, можно оценить, что до 0,5 – 1 % доноров в год будут вновь инфицированы данным возбудителем [43, 123].
В настоящее время для учреждений службы крови и производителей плазмы для фракционирования в эпидемиологическом плане более важным является наблюдение за показателем выявления ДНК B19V в популяциях доноров. Объясняется это особенностями инфицирования вирусом (см. более подробно п.1.1 настоящей главы). Частота выявления ДНК B19V среди доноров крови разных стран варьирует в пределах от 0,55 до 1,90 % (таблица 1).
Прямое сравнение результатов данных эпидемиологических исследований затруднительно, потому что чувствительность методов исследования различается. Кроме того, на конечный результат могут повлиять сезонные и локальные вспышки парвовирусной инфекции. Принимая во внимание частоту выявления ДНК B19V среди доноров [26, 31, 47, 67, 69, 72, 80, 111, 117], а также уровень еще неинфицированных лиц в популяции населения, заражение через компоненты или препараты крови встречается относительно часто [37, 65]. Однако сообщения о данных случаях публикуются крайне редко. Вероятно, что заражение B19V через продукты крови почти никогда не обнаруживается, так как сопровождается неспецифическими клиническими симптомами по типу гриппоподобной инфекции. Анемия, или тромбоцитопения, или лейкопения, так или иначе, исчезают после переливания продуктов крови. Косвенным подтверждением инфицирования B19V является то, что встречаемость антител к возбудителю выше среди пациентов, получавших факторы свертывания крови, чем в контрольной группе [101]. Аналогичные данные были получены и при сравнении групп, получавших и не получавших препараты крови: IgG к B19V выявлялись в 1,7 раза чаще в группе получавших препараты крови [118].
Кроме того, следует учитывать уровень вирусной нагрузки в единице трансфузии (компоненте или препарате крови). В ретроспективном исследовании, проведенном в США [71], были определены 24 случая из 12529 протестированных донаций, когда компоненты крови, позитивные по ДНК B19V, переливались восприимчивым реципиентам. Все донации были с низкой вирусной нагрузкой (ДНК B19V 106 МЕ/мл) и содержали вирус - специфичный IgG. Во всех случаях не было заражения (сероконверсии) реципиента. Аналогичные данные были получены в исследовании, проведенном в Германии [101]. Описана передача B19V посредством объединенной (пулированной) плазмы, обработанной сольвент/детергентом (SD – плазма) [42]. Хотя пулированная плазма содержит сравнительно постоянный уровень специфичных антител к B19V (около 40 МЕ/мл) [110], тем не менее, он не является достаточным, чтобы нейтрализовать полностью высокую вирусную нагрузку парвовируса. Показано, что высокая концентрация ДНК B19V (106 МЕ/мл и более), независимо от имеющегося уровня нейтрализующих антител (IgG-антитела к B19V) в плазме, делает процесс нейтрализации возбудителя, как правило, не эффективным, а образующиеся иммунные комплексы нестабильными, что приводит к инфекционности таких доз плазмы [39]. В исследовании, проведенном в США, было показано, что передача парвовирусной инфекции посредством SD – плазмы возможна при концентрации ДНК B19V более 107 геном-эквивалента/мл. Концентрация в 103,5 геном-эквивалента/мл не приводила к передаче возбудителя [42]. В связи с этим FDA и Европейский директорат по качеству лекарственных средств (ЕДКЛС) установили предельную концентрацию ДНК B19V в отношении производственных пулов плазмы для фракционирования на уровне не более чем 104 МЕ/мл [59, 89].
Таким образом, определение уровня выявления высокой вирусной нагрузки B19V в продуктах крови, в частности, в плазме для фракционирования, имеет практический интерес для производственной трансфузиологии. В недавно опубликованных работах зарубежных авторов [73, 74, 110] высокая концентрация ДНК B19V выявлена в образцах плазмы на уровне 0,001 – 0,006 % от всего числа исследованных. Аналогичный показатель в Российской Федерации до настоящего времени не определен.
Инфекционная безопасность плазмы для фракционирования Основным сырьем для производства препаратов крови является плазма для фракционирования. Она представляет собой жидкую часть крови, отделенную от форменных элементов центрифугированием или методом афереза в присутствии антикоагулянта, полученную от здоровых доноров и предназначенную для объединения в производственный пул [29, 90]. Важным критерием качества плазмы для фракционирования является ее безопасность. В настоящее время выделяют несколько уровней инфекционной безопасности [55, 57, 58, 104, 128]. В каждой стране должна быть разработана национальная политика и стратегия обеспечения качества гемотрансфузий, а также созданы законодательные структуры, регулирующие процессы заготовки, тестирования, переработки, хранения и транспортировки плазмы, полученной от доноров, в том числе, в отношении плазмы для фракционирования [127].
Верификация методики выявления и количественного определения ДНК B19V в образцах плазмы для фракционирования
Установленное нижнее значение доверительного интервала (ДИ) показателя аналитической чувствительности примерно в 2 раза ниже уровня, заявленного Roche и приведенного в инструкции к тест-системе. Это объясняется особенностями дизайна настоящего исследования: меньшей выборкой (по 24 образца) и большим шагом разведения ДНК B19V (около 3,16 раза). Для сравнения, в исследовании Roche используется по 189 образцов каждого уровня ДНК B19V, а шаг разведения в 2 раза меньше [105]. Данное объяснение подтверждается сравнениями показателей LOD, полученными в разных лабораториях, при соблюдении аналогичного дизайна исследования. Установленный в ходе настоящего исследования показатель соотносится с ранее полученными данными и входит в диапазон от 11,48 до 22,85 МЕ/мл [75, 105].
Roche, США 178 3,87 0,182 1,22 [105] При исследовании 24 образцов, содержащих ДНК В19V в концентрации log10 4,0 МЕ/мл (104 МЕ/мл), среднее значение составило log10 4,09 МЕ/мл (95 % ДИ log10 4,07 - log10 4,12 МЕ/мл) со стандартным отклонением (СО) log10 0,05 МЕ/мл (коэффициент вариации (СV) 1,22 %), что показывает высокую воспроизводимость теста. Полученные показатели с учетом размера выборки соответствуют результатам ранее проведенных исследований [75, 105].
При исследовании 40 образцов, содержащих ДНК В19V в концентрации log10 4,00 МЕ/мл, среднее значение составило log10 4,07 (СО = 0,071) МЕ/мл (таблица 6).
Таким образом, 95 % ДИ составил диапазон от log10 4,00 до log10 4,14 МЕ/мл, включающий заданную концентрацию (log10 4,00 МЕ/мл) с незначимым отклонением log10 0,07 МЕ/мл, что доказывает высокую точность при выполнении исследований образцов плазмы для фракционирования с целью выявления и количественного определения ДНК B19V.
Результаты тестирования Международной референсной панели с помощью теста DPX показали правильность выявления и количественного определения всех трех генотипов В19V, а также оценки контрольного образца (отрицательной плазмы), входящих в состав панели, в условиях ЛКК ФГБУ РМНПЦ «Росплазма» ФМБА России (таблица 7). Таблица 7 - Результаты исследования Международной референсной панели
При исследовании 30 образцов плазмы, содержащих ДНК В19V и имеющих уровень гемолиза до 20 % (об/об), были получены положительные результаты, а при исследовании 30 гемолизированных образцов, не содержащих ДНК В19V, -отрицательные результаты. Аналогичные данные получены при исследовании двух групп по 10 образцов, имеющих признаки хилеза. В совокупности, это показывает достаточную робастность теста DPX, заявленную производителем [105], что доказывает возможность на практике проводить исследование образцов плазмы для фракционирования, в том числе имеющих признаки гемолиза до 20 % (об/об) и/или хилеза, без влияния на конечный результат исследования.
По результатам проведенной верификации случаи перекрестного заражения отсутствовали, что доказывает надежность методики, исключающую возможность контаминации образцов плазмы для фракционирования в процессе проведения исследования и, как следствие, снижает риск получения ложноположительных результатов. Результаты оценки рутинного применения теста DPX в методике выявления и количественного определения ДНК B19V в плазме для фракционирования представлены в таблице 8.
Все невалидные результаты (10,9 % от общего числа полученных результатов) связаны с ошибками в работе оборудования. Отсутствие невалидных результатов, связанных с реагентами, подтверждают результаты ранее проведенного исследования [93]. Высокий процент невалидных результатов, полученный в нашем исследовании, объясняется, прежде всего, большим объемом выборки и более продолжительным периодом наблюдения.
Итак, полученные результаты соответствуют критериям приемлемости [105] и соотносятся с данными, полученными ранее в ведущих лабораториях мира [75], что свидетельствует об успешном проведении верификации методики исследования образцов плазмы для фракционирования для выявления и количественного определения ДНК В19V методом ПЦР. Таким образом, доказали возможность использования данной методики в алгоритме лабораторного исследования больших объемов плазмы, направляемой на фракционирование.
Выявление ДНК В19V у доноров плазмы для фракционирования Исследовали 16841 образец плазмы, заготовленной в период с января 2012 по апрель 2012 года от 6154 доноров плазмы для фракционирования, проживающих на территории ряда субъектов Российской Федерации. В 42 образцах плазмы, заготовленной от 34 доноров, была выявлена ДНК В19V на уровне от 7,82 х 101 до 6,56 х 105 МЕ/мл (медиана 3,97 х 102 МЕ/мл). Для оценки количественных результатов область значений концентрации ДНК В19V, выявленной среди доноров плазмы для фракционирования, разбили на три диапазона:
ДНК В19V в целом выявили у 0,55 % (34/6154) доноров плазмы для фракционирования от числа всех обследованных. Из них, у 79 % (27/34) доноров выявлена низкая вирусная нагрузка возбудителя (ДНК В19V менее 104 МЕ/мл). И только у 21 % (7/34) доноров ДНК В19V обнаруживалась на уровне 104 – 106 МЕ/мл. Доноров плазмы для фракционирования с концентрацией ДНК В19V равной или более 106 МЕ/мл выявлено не было, что объясняется, прежде всего, малым периодом наблюдения. Во-вторых, по-видимому, оказали влияние на конечный результат сезонные колебания выявления ДНК В19V [62, 73, 130].
Провели анализ данных по выявлению ДНК В19V среди доноров плазмы для фракционирования в зависимости от региона проживания (таблица 10). Таблица 10 – Частота выявления ДНК В19V среди доноров плазмы для фракционирования в зависимости от региона проживания
Из представленных в таблице 10 данных видно, что частота выявления ДНК В19V среди доноров плазмы для фракционирования в зависимости от региона проживания составила от 0,27 до 3,92 %. Разница в полученных результатах может объясняться, прежде всего, вариацией количества обследованных доноров, проживающих на определенных территориях. Так, в случае сравнения числа обследованных доноров по Кировской области и республике Чувашия отличие доходит до 53,5 раз. Тем самым каждый новый случай выявления ДНК В19V у донора плазмы для фракционирования на малом объеме выборки в значительной мере влияет на конечный результат, приводя к различию уровня выявляемости ДНК В19V до 14,5 раз. Вместе с тем, в случае оценки сопоставимых по размеру выборок отмечается различие данного показателя в зависимости от региона проживания доноров плазмы для фракционирования. Например, частота выявления ДНК В19V среди доноров плазмы для фракционирования, проживающих в Нижегородской области, выше в 1,9 раза, чем среди доноров Костромской области.
Определенная в настоящем исследовании частота выявления ДНК В19V среди доноров плазмы для фракционирования сопоставима с аналогичным показателем (0,55 – 1,90 %) для популяций доноров крови разных стран мира (таблица 11).
Определение процента образцов плазмы для фракционирования с высокой концентрацией ДНК
Собственные исследования показали, что проблема обеспечения инфекционной безопасности плазмы для фракционирования в отношении В19V актуальна для Российской Федерации. Частота выявления ДНК В19V среди российских доноров плазмы для фракционирования составил 0,55%, что коррелирует с данными ранее проведенных исследований [26, 31, 47, 67, 69, 72, 80, 111, 117]. При этом в эпидемиологическом плане наиболее важным показателем является процент образцов плазмы для фракционирования с высокой вирусной нагрузкой (ДНК В19V 106 МЕ/мл и более), определяющей инфекционную опасность в плане риска контаминации производственных пулов при выпуске препаратов крови [39, 61, 73]. По результатам исследований, данный показатель в 2012 – 2014гг. находился в среднем на уровне 0,003 % (диапазон 0,002 – 0,005 %), что соответсвует данным зарубежных исследователей [73].
При исследовании образцов плазмы для фракционирования с высокой вирузной нагрузкой только в одном из девяти образцов обнаружили IgG – антитела к В19V на уровне 7,5 МЕ/мл, что, вероятно, связано с образованием иммунных комплексов, препятствующих их обнаружению методом ИФА [40]. Ранее показано, что высокая вирусная нагрузка (ДНК B19V 106 МЕ/мл и более), независимо от имеющегося уровня нейтрализующих антител (IgG-антитела к B19V) в плазме, делает процесс нейтрализации возбудителя, как правило, не эффективным, а образующиеся иммунные комплексы нестабильными, что приводит к инфекционности образцов плазмы [39]. С учетом этого, полученные результаты подтверждают важность выявления образцов плазмы для фракционирования с высокой вирусной нагрузкой В19V методом ПЦР.
При оценке взаимосвязи высокой вирусной нагрузки возбудителя с возрастом донора плазмы для фракционирования установили, что ДНК В19V в критическом уровне (106 МЕ/мл и более) выявлялась чаще в возрасте от 18 до 27 лет (66,7 % от всех выявленных образцов). В то же время взаимосвязь с полом донора отсутствует: образцы плазмы для фракционирования с высоким уровнем виремии В19V, заготовленной от доноров-женщин и доноров-мужчин, обнаруживались в равной мере. С учетом фактора сезонности 77,8 % от всех выявленных образцов плазмы с высокой вирусной нагрузкой В19V пришлось на весенний период, с пиком выявления в мае месяце (до 55,6 % от всех обнаруженных образцов). Полученные результаты объясняются эпидемиологическими особенностями возбудителя [62, 113, 130] и соотносятся с данными зарубежных исследователей [73].
В зависимости от региона проживания образцы с высокой концентрацией ДНК В19V выявлялись в 55,6 % случаев у доноров плазмы для фракционирования республики Татарстан, несколько реже - у доноров Кировской области (22,2 %), республики Чувашия и Костромской области (по 11,1 %). Полученные результаты следует принимать во внимание при планировании работы по заготовке плазмы для фракционирования в данных субъектах Российской Федерации.
С целью оценки риска возможной контаминации производственных пулов плазмой для фракционирования с высоким уровнем вирусной нагрузки В19V разработали математическую модель, основанную на классической методике расчета риска [11] и модифицированную путем добавления в формулу поправочного коэффициента. Это позволило математически учесть вероятность попадания контаминированной плазмы для фракционирования в производственный пул: от благоприятного для производства варианта распределения (все контаминированные дозы попадают в один производственный пул) до негативного (по 1 контаминированной дозе в производственный пул). Вычислили максимальный (Rmax), средний (Rср) и минимальный (Rmin) риски контаминации производственного пула плазмой для фракционирования с концентрацией ДНК В19V 106 МЕ/мл и более, учитывая определенные ранее частоты выявления ДНК В19V. В среднем риск составил 0,8 – 25 %, что автоматически может привести к контаминации до 25 % выпускаемых препаратов крови. Это соотносится с ранее проведенными исследованиями [61]. Результаты настоящего исследования указывают на необходимость принятия действенных мер, направленных на предотвращение контаминации В19V производственных пулов. Прежде всего - это разработка и внедрение в практику отечественных производителей тестирования сырья с целью исключения из процесса производства плазмы для фракционирования с высокой концентрацией ДНК В19V.
Для выполнения этой задачи разработали алгоритм тестирования плазмы для фракционирования на выявление и количественное определение ДНК B19V с помощью теста DPX в мини-пулах из 96 образцов. При его разработке исходили из международных отраслевых требований [35], аналитических характеристик используемой тест-системы, размера производственного пула и данных, отражающих частоту встречаемости плазмы с высокой вирусной нагрузкой В19V, при заготовке сырья от определенной популяции доноров. Критерием выбраковки определили обнаружение в исследуемом образце плазмы для фракционирования ДНК В19V на уровне 106 МЕ/мл и более. Это с учетом мини-пула из 96 образцов позволяет исключить возможность попадания плазмы с высокой вирусной нагрузкой в производство и, как следствие, обеспечивает соблюдение международных требований по уровню виремии В19V в производственном пуле не более 104 МЕ/мл [59, 89, 103]. Результаты наблюдения за донорами в динамике показали снижение уровня ДНК В19V при контрольном обследовании ниже порогового значения, что доказывает отсутствие необходимости в отводе доноров, от которых была заготовлена плазма для фракционирования с высоким уровнем вирусной нагрузки.
Экономическую эффективность разработанного алгоритма оценивали с помощью методологического подхода «анализ выгоды стоимости» [10]. Проведенный анализ показал, что прямые затраты внедрения алгоритма в практику предприятия по фракционированию плазмы с плановой мощностью 600 000 л плазмы в год составят 111 млн. рублей в ценах на конец 2014 года или около 2,6 % от общей стоимости сырья – плазмы для фракционирования. Принимая во внимание, что установленный риск возможной контаминации производственных пулов плазмой с концентрацией ДНК В19V 106 МЕ/мл и более составил 0,8 – 25 %, данные затраты представляются экономически оправданными.
Таким образом, полученные нами результаты свидетельствуют о том, что алгоритм исследования на наличие ДНК В19V больших объемов плазмы для фракционирования с использованием теста DPX в режиме мини-пулов, состоящих из 96 образцов, позволяет гарантированно предотвратить критическую контаминацию В19V производственных пулов и является экономически целесообразным. Собственные исследования показали принципиальную возможность использования указанного теста в формате мини-пулов, состоящих из 480 образцов плазмы. Указанный подход может в 2,8 раза снизить прямые затраты на данный вид исследования.
Клинико-экономическое обоснование внедрения в практику тестирования плазмы для фракционирования на наличие ДНК В19V
Тестирование на наличие ДНК В19V согласно выработанному алгоритму проводили на втором этапе лабораторного обследования плазмы для фракционирования, после проведения исследования на наличие нуклеиновых кислот ВГВ, ВГС и ВИЧ-1, ВИЧ-2. В качестве исследуемого материала использовали остаточный объем образца плазмы для фракционирования, отбираемой в одноразовую пластиковую пробирку из заготовленного контейнера непосредственно в плазмоцентре, до этапа заморозки (исходный объем отбираемого материала составляет 4 мл). Критерием выбраковки явилось обнаружение в исследуемом образце плазмы для фракционирования ДНК В19V на уровне 106 МЕ/мл и более. Это с учетом мини-пула из 96 образцов позволяет исключить возможность попадания плазмы с высокой вирусной нагрузкой в производство и, как следствие, обеспечивает соблюдение международного требования по уровню виремии В19V в производственном пуле не более 104 МЕ/мл.
Наблюдение за донорами в динамике показало снижение концентрации ДНК В19V при контрольном обследовании (при следующем обращении донора в плазмоцентр) ниже порогового значения во всех случаях, за исключением одного, когда донор не явился для повторного обследования (таблица 16). нет данных нет данных Полученные результаты подтверждают то, что для острой парвовирусной инфекции характерна короткая фаза активной репликации (в среднем не более 7 – 14 дней), которая сопровождается высокой виремией [130]. Одновременно это свидетельствует и об отсутствии необходимости даже во временном отводе доноров плазмы для фракционирования, в случае выявления у них ДНК В19V в концентрации 106 МЕ/мл и более.
Для оценки экономической эффективности выбрали методологический подход «анализ выгоды стоимости» [10]. Целью данного подхода является определение размера выгоды от внедрения лабораторного исследования. Первоначально определили затраты на проведение исследования на наличие ДНК В19V в плазме для фракционирования, т.е. себестоимость. В нашей стране себестоимость лабораторного исследования рассчитывается в соответствии с нормативной документацией [14] по формуле:
Aм - амортизационные отчисления на оборудование Э – эксплуатационные расходы на содержание оборудования и инвентаря М - материальные затраты (затраты на реактивы, лабораторное стекло, пластмассовые изделия и т.д.) П – прочие расходы. С учетом того, что исследование плазмы для фракционирования на наличие ДНК В19V проводится на одном и том же лабораторном оборудовании (аналитическом комплексе cobas s201), тем же персоналом, что и тестирование на наличие нуклеиновых кислот ВГВ, ВГС, ВИЧ-1 и ВИЧ-2, при расчете себестоимости анализа учитывали только прямые расходы, т.е. стоимость реагентов и расходных материалов, а также официально прогнозируемый уровень инфляции в 5,5 % (индекс - дефлятор 1,055) [21]. В итоге расчет проводили по модифицированной формуле: S = (М1 + М2 +М3 + … + Мi) 1,055 (5), где: S – себестоимость исследования Мi – материальные затраты (суммарные затраты на i-количество реактивов, пластмассовых изделий и т.п.) 1,055 – индекс – дефлятор. Себестоимость исследования одного образца плазмы для фракционирования на наличие ДНК В19V в мини-пулах из 96 образцов в ценах по состоянию на конец 2014 года составила 111,42 руб. (таблица 17).
Тест DPX имеет достаточные аналитические характеристики (чувствительность при выявлении ДНК B19V составляет менее 102 МЕ/мл), поэтому теоретически возможно применение этого теста и с большим количеством образцов в мини-пуле (до 480) без увеличения риска пропуска образцов плазмы с высокой концентрацией ДНК В19V [105].
Для оценки экономической целесообразности использования мини-пулов большего объема был сделан сравнительный анализ расхода теста DPX (на него приходится 52 % от себестоимости исследования) при использовании пулов из 96 и 480 индивидуальных доз плазмы. Результаты расчета, выполненные с учетом технологических особенностей применяемого лабораторного оборудования, приведены для анализа 960 образцов, в числе которых содержится один образец с концентрацией ДНК В19V 106 МЕ/мл или более (таблица 18).
Выявление 1 образца с ДНК В19V 106 МЕ/мл или более 8промежуточныхпулов по 12образцов 11 тестов 0,04 10промежуточныхпулов по 48образцов 13 тестов 0,04 образцов(режимединичноготестирования) 15 тестов 8 вторичныхпулов по 6образцов 11 тестов 6 образцов (режимединичноготестирования) 9 тестов ИТОГО 39 тестов 38 тестов Из данных, представленных в таблице 18, видно, что в случае отсутствия в исследуемой группе образцов плазмы с высокой концентрацией парвовируса, при исследовании мини-пулов из 480 образцов расход теста DPX снижается в 2,8 раза по сравнению с мини-пулом из 96 образцов. В случае выявления хотя бы одной контаминированной пробы расход теста DPX одинаков. Кроме этого, при расшифровке первично-реактивного мини-пула из 480 образцов увеличивается расход других материалов, прежде всего, контрольных материалов, на которые приходится 21,5 % от себестоимости исследования.
Полученные данные о частоте выявления образцов плазмы для фракционирования с высокой концентрацией ДНК В19V (в среднем 31,2 образца на 1000000 донаций или 1 : 32051), позволяют сделать заключение о том, что при использовании мини-пулов из 480 образцов первично-реактивные пулы будут встречаться с частотой около 1 : 67. При такой частоте использование мини-пула из 480 образцов представляется перспективным, но требует углубленного анализа и обязательной верификации методики.
Исходя из установленной себестоимости исследования индивидуальной дозы плазмы (контейнера плазмы для фракционирования) на наличие ДНК B19V (таблица 18), можно оценить затраты, необходимые для тестирования производственного пула, состоящего из 5000 л (или 8333 контейнеров плазмы). При себестоимости исследования одного образца плазмы (т.е. контейнера плазмы для фракционирования), равного 111,42 руб., стоимость исследования производственного пула составит 928463 руб. Если плановая мощность предприятия составляет, например, 600 000 л плазмы в год, то обследовать необходимо как минимум 120 производственных пулов. В этом случае общие затраты составят более 111 млн. рублей.
Для оценки доли этих затрат в общей стоимости сырья для фракционирования можно исходить из средней стоимости 1 л плазмы для фракционирования на международном рынке, которая составляет около 100 [46] или 7000 руб. (при курсе 1 = 70 руб). В этом случае производственный пул из 5000 л плазмы будет стоить ориентировочно 35 млн. рублей, а 120 таких пулов – 4200 млн. рублей. Соответственно, дополнительные прямые затраты на выявление возбудителя в этих объемах плазмы составят около 2,6% от общей стоимости сырья. Учитывая то, что риск критической контаминации B19V производственных пулов плазмы для фракционирования в среднем может достигать 25 % (таблица 15), эти затраты представляются экономически оправданными.
Предлагаемый алгоритм исследования плазмы для фракционирования с помощью теста DPX позволяет одновременно проводить лабораторный контроль сырья и в отношении вируса гепатита А. Ранее нами был описан клинически подтвержденный случай выявления РНК вируса гепатита А у донора плазмы для фракционирования. При этом затраты на обследование плазмы для фракционирования в отношении вируса гепатита А равны нулю, что еще раз подчеркивает экономическую эффективность предлагаемого нами алгоритма.
Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что алгоритм исследования на наличие ДНК В19V больших объемов плазмы для фракционирования с использованием теста DPX в режиме мини-пулов, состоящих из 96 образцов, позволяет гарантированно предотвратить критическую контаминацию В19V производственных пулов сырья и является экономически целесообразным. Выполненные исследования показали принципиальную возможность использования указанного теста в формате мини-пулов, состоящих из 480 образцов плазмы. Указанный подход может существенно (в 2,8 раза) снизить прямые затраты на данный вид исследования.