Содержание к диссертации
Введение
2. Основная часть .10
2.1. Обзор литературы 10
2.1.1. Липидный обмен птиц 10
2.1.2. Картирование QTL, влияющих на жирность бройлеров 13
2.1.3. Характеристика генов-кандидатов: FABP1, FABP2, FABP3, HMGA1, PPARG, MC4R, PPARGС1А, POMC и PTPN .16
2.1.3.1. Ген FABP1 16
2.1.3.2. Ген FABP2 20
2.1.3.3. Ген FABP3 22
2.1.3.4. Ген HMGA1 24
2.1.3.5. Ген PPARG 27
2.1.3.6. Ген MC4R .32
2.1.3.7. Ген PPARGС1А 34
2.1.3.8. Ген POMC 35
2.1.3.9. Ген PTPN1 36
2.1.4. Автоматическое секвенирование ДНК 37
2.2. Материалы и методы исследований 47
2.2.1. Материалы .48
2.2.2. Методы исследований .49
2.3. Результаты собственных исследований 52
2.3.1. Определение уровня экспрессии девяти генов-кандидатов 53
2.3.2. Секвенирование гена PPARG и подбор праймеров для генотипирования генов PPARG и FABP2 56
2.3.3. Генотипирование бройлеров кросса «Иза Хаббард Ф-15» по трем полиморфным сайтам гена PPARG 58
2.3.4. Тест-система анализа полиморфизма гена FABP2 на основе ПЦР-ПДРФ 68
3. Заключение 71
3.1. Выводы 73
3.2. Практические предложения .74
3.3. Перспективы дальнейшей разработки темы 74
Список сокращений и условных обозначений 75
Список литературы 76
Приложения 95
- Ген FABP1
- Ген PPARG
- Автоматическое секвенирование ДНК
- Генотипирование бройлеров кросса «Иза Хаббард Ф-15» по трем полиморфным сайтам гена PPARG
Введение к работе
Актуальность темы исследования. Более половины производимого на сегодняшний день мяса птицы составляют бройлерные кроссы домашней курицы. Селекция бройлеров по признаку высокой скорости роста параллельно привела к увеличению жирности тушки, что значительно снижает эффективность кормления, не несет коммерческой целесообразности, и снижает потребительскую ценность. Примерно 15-20% массы тушки у современных бройлерных пород приходится на жир. Основным местом отложения жира у животных является жировая ткань (подкожная, внутримышечная, абдоминальная). Остальной жир присутствует в крови и других тканях и является физиологически необходимым. Различные жировые депо взаимосвязаны между собой и изменения в одном сопровождаются и изменениями в других. Однако, абдоминальный жир более изменчив, чем общий жир или внутримышечная жировая ткань (Архипов А.В., 2012). Таким образом, возможны значительные изменения в абдоминальном жире без серьёзных изменений межмышечных и внутримышечных жировых депо. Для борьбы с излишней жирностью тушки птиц требуется пристальное изучение факторов, участвующих в депонировании жира и разработка методик, ослабляющих этот процесс.
ДНК-маркеры локусов количественных признаков, ассоциированные с хозяйственно-полезными признаками, позволяют оценить генетический потенциал животного (Костюнина О.В., 2016).
Поиск полиморфизмов в генах, участвующих в липидном обмене, важная задача на сегодняшний день для многих ученых передовых стран. Найдены точечные мутации в гене A-FABP, которые являются маркерами для отбора линий бройлеров с высоким содержанием внутримышечного жира (Wang Y. et al., 2016). К тому же, недавно выяснили, что совместная работа гамма-рецептора, активируемого пролифератором пероксисом (PPARG) с метилированным энхансер-связывающим белком альфа (CEBPA), повышает скорость адипогенеза и играет решающую роль в дифференциации адипоцитов (Gao Y. et al., 2015).
Спектр ДНК-маркеров, связанных с воспроизводительными, мясными и откормочными качествами постоянно расширяется. Таким образом, поиск мутаций, обуславливающих экономически значимые признаки, устойчивость к заболеваниям и наличие генетических дефектов, а также разработка тест-систем диагностики таких мутаций для использования в селекционно-племенном процессе представляет интерес, как для исследователей, так и для практических специалистов (Костюнина О.В., 2016).
Степень разработанности темы исследования. Исследование механизмов отложения абдоминального жира во всем мире важны как для повышения продуктивности сельскохозяйственных птиц и животных, так и для профилактики и лечения ожирения у человека. Изучение этого процесса, предполагает проведение исследований как на белковом, транскрипционном так и геномном уровнях. Поэтому, имеется необходимость в поиске
молекулярных маркеров для селекции родительских линий бройлеров на снижение содержания абдоминального жира, что позволит увеличить пищевую ценность тушки и уменьшить расходы на кормление.
C целью обнаружения новых генов-кандидатов, связанных с отложением брюшного жира, Морейра с соавторами секвенировал QTL, локализованный на 3 хромосоме между микросателлитными маркерами LEI0161 и ADL0371 (33,595,706-42,632,651 п.н.). В общей сложности было найдено 136054 полиморфизмов с 15496 вставками в этом регионе. Из этих вариантов, 386 SNP c 15 вставкам оказались расположены в кодирующих областях генов, связанных с липидным метаболизмом. А именно шесть генов: LOC771163, EGLN1, GNPAT, FAM120B, THBS2 и GGP, показали положительную связь с отложением абдоминального жира ( et al., 2015). Исследователем Ли с соавторами, удалось вскрыть связь роста жировой ткани в брюшной полости с полиморфизмами в локусах количественных признаков. Они обнаружили 22 локуса количественных признаков и 97 генов (в том числе 9 некодирующих), а прорывом стало обнаружение SNP Gga_rs14303341 и Gga_rs14988623. Эти результаты дают представление об огромном генетическом влиянии мутаций на продуктивные характеристики кур мясного направления (Li F. et al., 2013).
Цель и задачи исследований. Целью данной работы является изучение экспрессии генов-кандидатов, участвующих в метаболизме липидов в организме, выявление полиморфных сайтов в этих генах и изучение их связи с содержанием абдоминального жира у кур мясного направления.
В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи:
-
Создать банк матричной РНК из образцов различных органов и тканей домашней курицы с высоким и низким содержанием абдоминального жира.
-
Выполнить теоретическое моделирование условий эксперимента по анализу экспрессии генов FABP1, FABP2, FABP3, HMGA1, PPARG, MC4R, PPARGC1A, POMC, PTPN1 на основе ПЦР в режиме реального времени.
3. Определить профиль экспрессии генов-кандидатов в разных тканях с
помощью количественной полимеразной цепной реакции.
-
Провести секвенирование регуляторной и кодирующей областей гена PPARG и выявить мутации в их пределах.
-
Проанализировать распространение мутаций в генах PPARG и FABP2 в группах кур с разным содержанием абдоминального жира.
-
Изучить влияние генотипов по генам PPARG и FABP2 на хозяйственно-полезные признаки кур мясного направления.
Научная новизна работы. Впервые создан банк мРНК и разработана тест-система, позволяющая определять уровень экспрессии генов FABP1, FABP2, FABP3, HMGA1, PPARG, MC4R, PPARGC1A, POMC, PTPN1 в разных тканях бройлеров кросса «Иза Хаббард Ф-15». Методом секвенирования выявлено три сайта мононуклеотидного полиморфизма (SNP) гена PPARG в пределах регуляторной последовательности. С помощью аллелеспецифической полимеразной цепной реакции выявлена связь ряда SNP (4855561А>С, 4856011T>С, 4857001Т>G) с содержанием абдоминального жира у кур.
Установлены статистически значимые различия в группах кур с высоким, средним и низким содержанием абдоминального жира с учетом их генотипов по исследуемым ДНК-маркерам.
Теоретическая и практическая значимость работы. Выявлены мононуклеотидные полиморфные сайты (SNP) в пределах регуляторной последовательности генов PPARG и FABP2. Обнаружена связь SNPs (4855561А>С, 4856011T>С, 4857001Т>G) гена PPARG с содержанием абдоминального жира у кур. Полученные результаты могут быть использованы для разработки системы молекулярных маркеров, которые смогут выступать в качестве инструментов для селекции кур мясного направления на птицеводческих предприятиях. Выявленные закономерности и предложения представляют материал для лекций, методических пособий, информативных стендов в учебных заведениях сельскохозяйственного, биологического и ветеринарного профиля.
Методология и методы исследования. При проведении исследований методологической основой стали работы зарубежных и отечественных ученых в области изучения структуры и функции генов, а также методология геномной оценки и геномной селекции. Для поставленной цели и задач были использованы современные методы молекулярной генетики с биологическими и статистическими основами анализа.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Оценка экспрессии девяти генов-кандидатов для количественных признаков в различных органах и тканях кур мясного направления (бройлеров) кросса «Иза Хаббард Ф-15».
-
Последовательность кодирующей и регуляторной области гена PPARG, определенная на основе секвенирования.
-
Мононуклеотидные полиморфные сайты - SNPs в пределах экспрессирующейся и регуляторной последовательности генов PPARG и FABP2.
-
Частоты генотипов мононуклеотидных полиморфных сайтов в генах PPARG и FABP2 групп кур с высоким, средним и низким содержанием абдоминального жира.
-
Статистически значимые ассоциации генотипов гена PPARG с содержанием абдоминального жира в разных группах кур.
Степень достоверности и апробация результатов. Результаты исследований обработаны с помощью современных информационных статистических программ Excel 2003 (Microsoft Corp., Сиэтл, США), а также программы для статистического анализа данных AtteStat12.0.5. () и Instat+v3.37( t).
Материалы работы были представлены на международной научной конференции «Экологическое равновесие и устойчивое развитие территории» (Россия, Санкт-Петербург-Пушкин, 2010); научно-практической конференции «Генетика и селекция в животноводстве: вчера, сегодня, завтра» (Россия,
Санкт-Петербург, 2010); на международной научно-практической
конференции «Современные биотехнологии для науки и практики» (Россия, Санкт-Петербург, 2015) и на VI международной научной конференции «Актуальные проблемы биологии в животноводстве» (Россия, Боровск, 2015). Проект «Поиск молекулярных маркеров по признаку масса абдоминального жира у кур» (Санкт-Петербург 2015) прошел в финал конкурса «Молодые, дерзкие, перспективные». Результаты исследований заслушаны на семинарах отдела молекулярной генетики и биотехнологии ФБГНУ ВНИИГРЖ.
Личное участие. Автор оценил и проанализировал современные научные достижения, определил цели и задачи своего исследования. С помощью современных методов собрал материал и выполнил лабораторные исследования на современном оборудовании. Обработал полученные результаты, обобщил и публично представил труды своих научных исследований в виде печатных работ в самостоятельном виде и в соавторстве.
Публикации. По теме диссертационной работы опубликовано 8 статей: 3 - опубликованы в научных журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ: «Генетика», «Научный журнал КубГАУ», «Известия Оренбургского государственного аграрного университета»; 1- в международном журнале «Journal of Applied Genetics» (Scopus), 4 – в материалах научно-практических конференций.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 103 страницах машинописного текста, содержит 11 таблиц, 27 рисунков и состоит из следующих разделов: введение; основная часть, включая обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты собственных исследований и обсуждение; заключение, включая выводы, практические предложения и перспективы дальнейшей разработки темы; список литературы, который включает 159 цитируемых источников, из них 150 – на иностранных языках; 3 приложения.
Ген FABP1
Ген FABP1 находится на 4 хромосоме генома курицы, активно экспрессируется в клетках печени и кодирует белок, связывающий жирные кислоты. Белки FABP — это семейство небольших консервативных цитоплазматических белков, связывающих жирные кислоты, имеющие длинные цепочки, и другие гидрофобные лиганды. В 2009 г. была описана пространственная структура белка FABP и механизм его действия в клетке. Оказалось, что он представляет собой два толстых лепестка прямоугольной формы, соединенные как две створки раковины. В месте, их соединения находится структура в виде короткого бруска, служащая буксиром для всей молекулы внутри клетки. Внутренняя полость, образуемая раковинами, имеет гидрофобную поверхность, отталкивающую воду и удерживающую цепи жирных кислот. В эту полость поступает молекула жирной кислоты вместе с холестерином и происходит ее транспортировка по клетке (рис. 2). Как только аминокислотный состав белка FABP был расшифрован, в 2011 году был запатентован ген, кодирующий его структуру. Если сказать точнее, запатентованы были антипоследовательности олигонуклеотидов РНК, кодирующих аминокислотный состав этого белка, которые могут блокировать считывание гена белка FABP (экспрессию). Именно такое соединение будет в дальнейшем использоваться для создания целевого лекарства против атеросклеротических изменений сосудов.
В описании патента указано, что запатентованные соединения могут использоваться для лечения таких болезней, как метаболический синдром, диабет I и II типов, атеросклероз и воспалительные процессы, такие как артрит. Содержание патента включает 69 пунктов, в которых указано, что патентуется цепь РНК (олигомер), точнее все цепи размером от 10 до 50 нуклеотидов, которые несут заявленную последовательность. Заявку на патент подали британец Кейт Маккулаг и датчане Еллен Страаруп и Нильс Нильсен (Тарасова Г.А., 2012).
Хотя, эти белки были открыты более 30 лет назад, физиологические функции этого семейства не были хорошо изучены. Семейство насчитывает 15 различных белков, которые экспрессируются в разных тканях (рис. 3).
В опытах, которые проводил Атшавес на мышах, показано, что FABP1 играет огромную роль в утилизации жирных кислот, транспортирует их по клетке, направляя на окисление в митохондрии и пероксисомы, соединяет жирные кислоты с коэнзимом А, FABP1 перетаскивает жирные кислоты в аппарат Гольджи для этерификации, секретирует липиды очень низкой плотности в межклеточное пространство, и участвует в хранении жирных кислот в виде липидных капель (Atshaves B. et al., 2010).
Лопес и соавторы с помощью биочипов изучали экспрессию большого числа генов и показали, что на высококалорийной, богатой жирами диете, у крыс, страдающих ожирением, экспрессия генов семейства FABP достоверно превышает таковую у крыс с нормальным весом. Эти авторы также сообщили, что по сравнению с контрольной группой у животных, страдающих ожирением, уровень экспрессии генов гамма – рецептора, активируемого пролифераторами пероксисом (PPARG) и белков, связывающих жирные кислоты FABP, увеличен в 50 и в 16 раз соответственно (Lopez I. et al., 2003). Ньюберри и сотрудники в результате изучения экспрессии гена L-FABP у мышей также с использованием биочипов, пришли к выводу, что нокаутированные по данному гену мыши были резистентны к ожирению и стеатозу печени, вызываемому определенной диетой (Westerndiet) (Newberry E. et al., 2006). Показано наличие высокого уровня экспрессии в адипоцитах бройлеров генов семейства FABP (Wang D. et al., 2009). Эти данные говорят о связи экспрессии гена FABP1 с отложением жира, что повлияло на выбор нами данного гена в качестве гена-кандидата для депонирования абдоминального жира у кур, локализация гена FABP1 изображена на рисунке 4.
Ген PPARG
Ген PPARG находится на 12 хромосоме Gallus gallus (Домашняя курица), экспрессируется в клетках печени и кодирует гамма-рецептор, активируемый пролифератором пероксисом (рис. 6). Этот белок принимает участие в регуляции процесса дифференцировки адипоцитов. Таким образом, понимание молекулярных механизмов липидного обмена у кур может привести к более высокой производительности в птицеводстве. У птиц, липиды, в виде триглицеридов хранятся в адипоцитах, гепатоцитах, и растущих ооцитах. Чрезмерное накопление липидов в жировой ткани кур является серьезной проблемой для производителей, так как жировые отложения приводят к снижению ценности мяса.
Ванг и соавторы показали, что трансфекция синтезированной in vitro мРНК PPARgamma (siPPARgamma) в культивируемые преадипоциты 12- дневных цыплят достоверно ингибирует процессы дифференцировки и усиливает пролиферацию преадипоцитов у кур (Wang Y. et al., 2008).
Линолевая кислота (CLA) является важным лигандом для ядерных рецепторов в процессе адипогенеза и отложения жира у млекопитающих и пернатых. Исследование учных в Индии направлено на определение влияния линолевой кислоты на размер адипоцитов в абдоминальном жире, а также на липогенный уровень транскрипции. CLA была добавлена в кормление бройлерам в разных вариантах, а именно, (I – CON) основной рацион - (0 % CLA и 5% пальмового масла), (II - LCLA) основной рацион - (2,5% CLA и 2,5% пальмового масла) и (III-HCLA) основной рацион - (5% CLA). Содержание цис-9 и транс-11 линолевой кислоты в контрольной группе (не получающей дополнительное кормление CLA) было в 1.69 и 2.3 раза больше (Р0,05) соответственно, чем транс-10, цис-12 CLA в брюшном жире LCLA и HCLA групп (получающих дополнительно CLA). В группах LCLA и HCLA произошло заметное уменьшение доли жировых клеток и мононенасыщенных жирных кислот. Уровень экспрессии белка PPARG снизился за счет дополнения в корм линолевой кислоты. Можно сделать вывод, что при добавлении в корм цыплят-бройлеров CLA уменьшается размер адипоцитов и заметно ниже содержание белка PPARG. Высокое содержание изомеров линолевой кислоты в жировой ткани бройлеров делает мясо кур богатым источником линолевой кислоты, которое может потреблять человек (Ramiah S.K. et al., 2014).
Фолиевая кислота - это витамин, который является донором метильных групп и принимает важное участие в метаболизме углерода. Метильные группы являются ключевым фактором стимулирования эпигенетических изменений. Китайские ученые поставили цель, определить влияет ли фолиевая кислота на уровень метилирования цитозина и гуанина в промотерах адипогенных районов у кур, и как это может повлиять на экспрессию генов и дифференцировку преадипоцитов в пробирке. В преадипоциты добавляли от 0 до 16 мг/л фолиевой кислоты во время индукции дифференцировки и пролиферации клеток и оценивали накопление липидов. В результате добавления фолиевой кислоты на 6 день дифференциации клеток наблюдалось пониженное содержание липидов в адипоцитах. Эффект фолиевой кислоты приводит и к уменьшению транскрипта PPARG, CCAAT/энхансер-связывающего белка (С/ЕВРа) и фермента синтазы. Но явно активируются на 6 день в молекуле ДНК цитозин-5-метилтрансфераза и метилентетрагидрофолатредуктаза (Р0,05). Метилирование ДНК исследовали с помощью секвенирования методом ПЦР бисульфита. В целом метилирование промоторной области гена С/ЕВРа составила 21,8% (P0,05) и экспрессии гена была в 2,7 раза выше, в отсутствие фолиевой кислоты, по сравнению с клетками, обработанными 16 мг/л фолиевой кислоты. Тогда как метилирование промотера гена PPARG не произошло. В целом, результаты показывают, что фолиевая кислота увеличивает скорость пролиферации адипоцитов, но уменьшается накопление липидов, влияя тем самым на дифференциацию. Также в результате метилирования промотора С/ЕВРа снижается экспрессия этого гена, участвующего в метаболизме углерода (Yu X. et al., 2014).
Внутримышечное содержание жира является главным фактором оценки качества мяса цыплят. С целью изучения молекулярных механизмов, лежащих в основе накопления внутримышечного жирау кур, были определены пять генов-кандидатов, которые являются транскрипционными факторами, участвующими в метаболизме липидов (Fu R.Q. et al., 2014).
Целью следующего интересного исследования китайских ученых стало клонирование гена PPARG козы породы Хухуай (Xuhuai) и получение трансгенных овец с помощью интратестикулярной инъекции, для того, чтобы улучшить качество и вкус мяса, увеличивая внутримышечное содержание жира. Кодирующая последовательность гена PPARG козы 1,428 п.н., аминокислот в белке 475. Сходство гена PPARG с другими видами 81% (курица), 89% (мышь), 92% (свиньи), 98% (корова), и 99% (овцы). Сходство аминокислотных последовательностей, 92.9%, 97.3%, 98.3%, 99.6%, и 99.8%, соответственно. В конце исследования с помощью вестерн-блоттинг метода, было доказано, что белка в цитоплазме клеток в первом поколении трансгенных овец стало выше на 13.7% (Qin Y. et al., 2013).
У курицы существует три гена PPARG (, , ). У кур ген PPARG (PPAR) короче, чем у человека, и не хватает 2 изоформы. Кроме того, в сыворотке крови куриный белок PPARy показывает высокую активность транскрипции без экзогенных лигандов. С помощью фермента люциферазы была исследована высокая транскрипционная деятельность генов PPARG и в сыворотке крови курицы. Эти результаты говорят, о возможности генов PPARG влиять на метаболизм глюкозы. Ген PPARy (ID: 00000004974) имеет 6 экзонов и располагается на протяжении 50 т.п.н. в геномной ДНК курицы (рисунок 7, верхний), в сравнении, на нижнем (рис. 7), представлен человеческий ген PPARy, (ID:00000132170) он состоит из 8 экзонов и 7 из них делятся на два подтипа 1 и 2, ген тянется на протяжении 160 т.п.н. в геномной ДНК человека.
Другие живые организмы, такие как белка (ID:00000012778), еж (ID:0000006334), китайская черепаха (ID:00000011100), и ящерица (ID:00000013360) имеют такой же тип организации PPARG гена как у курицы. Найдена положительная связь одного нуклеотидного полиморфизма (SNP) -75 G C гена PPARG с весом брюшного жира у цыплят-бройлеров, а также корреляция других SNP генов (FSBP4, C/ЕВРа) со скоростью липидного метаболизма. В последние годы прошли исследования с использованием мышей, нокаутировался ген PPARG, и было показано, что ген регулирует вес тела и контролирует водный обмен. Таким образом, PPARy также может регулировать вес тела у кур (Takada I., Kobayashi M., 2013).
Исследования показали наличие ассоциации гиперэкспрессии гена PPARG у человека с болезненным ожирением (Hindle A.K. et al., 2009). По данным Чен и соавторов (Chen H.H. et al., 2009) ожирение у китайцев связано с тремя SNP в генах ESR1 и PPARG (риск развития ожирения увеличивается в 5 раз).
Совместная работа генов PPARG и FABP4 показала высокую корреляцию с признаком - содержание внутримышечного жира поясничного отдела у корейского крупного рогатого скота (Lim D. et al., 2015).
Бразильские ученые в 2015 году секвенировали участок гена PPARG человека и обнаружили миссенс мутацию (rs1801282,С G), исследователи выявили достоверную связь этого SNP c тучностью и ожирением у подростков и детей. Результаты Квироз с коллегами доказали наличие ассоциации генотипа СС гена PPARG с ожирением у бразильских детей и подростков, которые имеют повышенный риск сердечно - сосудистых заболеваний или диабета 2 типа (Queiroz E.M. et al., 2015).
Автоматическое секвенирование ДНК
Современные достижения в области молекулярной биологии и генетики, развитие методов амплификации и определения нуклеотидной последовательности ДНК позволили создать огромное количество баз данных сиквенсов ДНК. Что делает возможным использовать данные по секвенированию различных организмов в исследованиях по сравнительной геномике. Эти данные могут ответить не только на общебиологические вопросы, но также могут применяться в клинической диагностике рака. А также наследственных заболеваний, в том числе гетерозиготного носительства вредных рецессивных мутаций, а также в сельскохозяйственной биологии для создания систем генной селекции. В настоящее время, под автоматическим секвенированием ДНК понимается, в первую очередь, электрофоретическое разделение амплифицированных фрагментов, полученных в результате полимеразной цепной реакции с использованием меченных различными флуорохромами дидезоксинуклеотид трифосфатов, с помощью специальных приборов - автоматических секвенаторов ДНК. В основе автоматического метода секвенирования ДНК лежит метод, разработанный Сенджером и соавторами, называемый также методом секвенирования путем терминации цепи, с помощью ферментативного построения комплементарной цепи ДНК по существующей одноцепочечной матрице при происходящем в разных местах цепи ДНК остановке ее дальнейшего роста. Необходимыми компонентами этого процесса являются: одноцепочечная матрица ДНК - короткая затравочная молекула, комплементарная определенному участку матрицы; ДНК-полимераза (Кленовский фрагмент ДНК- полимеразы IЕ. coli); 2 -дезоксинуклеотид 5 -трифосфаты (дАТФ, дГТФ, дТТФ, дЦТФ или просто дНТФ); 2 ,3 -дидезоксинуклеотид 5 - трифосфаты (ддАТФ, ддГТФ, ддТТФ, ддЦТФ или просто ддНТФ); реакционный буфер с ионами Mg2+. Важнейшим моментом этого процесса является терминация построения комплементарной цепи ДНК, происходящая при включении дидезоксинуклеотид трифосфатов, являющихся известными ингибиторами ДНК-полимеразы. Рост цепи прерывается из-за отсутствия второго гидроксильного остатка в 3 -положении рибозного кольца у дидезоксипроизводных, что приводит к невозможности присоединения к ним следующего нуклеотида. Терминация происходит следующим образом: в одной отдельной пробирке наряду со всеми четырьмя дНТФ (один из которых был радиоактивно меченный) присутствует только один какой-нибудь конкретный ддНТФ, включение данного ддНМФ в растущую цепь ДНК является произвольным, с учетом принципа комплементарности. То есть происходит некая конкуренция между дНТФ и ддНТФ при их выборе ДНК полимеразой. Но так как в четырех реакционных пробирках (по типу оснований - А, С, G и Т) присутствует огромное количество молекул секвенируемой ДНК, во много раз превосходящее ту длину фрагмента, которую могла построить ДНК-полимераза, то каждое положение этого типа оснований во фрагменте ДНК оказывается представленным соответствующим ддНМФ. Другой важной особенностью является гетерогенный размер полученных фрагментов ДНК, поскольку все 3 - концы фрагментов вновь синтезируемой цепи ДНК во всех четырех реакционных пробирках терминированы соответствующими ддНМФ и, таким образом, представляют собой полный набор всех возможных длин в пределах секвенируемого участка, построенного ДНК-полимеразой. 5 -концы фрагментов ДНК, принадлежащих новой цепи, должны быть для всех фрагментов строго одинаковыми и принадлежать 5 -концу исходной затравочной молекулы. Продукты реакций терминирования подвергаются денатурации и полученные одноцепочечные меченые фрагменты, имеющие гомогенный 5 -конец и гетерогенные 3 -концы, разделяются по длине высоковольтным электрофорезом высокого разрешения в полиакриламидном геле. Таким образом, в четырех соседних дорожках, соответствующих специфическим терминирующим реакциям, разделяются фрагменты ДНК, отличающиеся всего на один нуклеотид. После проведенного электрофореза гель экспонируется на рентгеновскую пленку, и по прошествии некоторого времени (обычно от одних до двух суток) с проявленной пленки можно определить последовательность нуклеотидов секвенируемого участка ДНК, «считывая» с нижней части геля и последовательно поднимаясь вверх по этим четырем дорожкам, соответствующим одному фрагменту ДНК. Производительность автоматического секвенирования зависит от количества и качества одно - или двуцепочечных матриц. При крупномасштабном секвенировании ДНК требуется настолько большое число матриц, что их подготовка стандартными способами, без применения автоматизации, становится лимитирующим фактором всего процесса. Открытие процесса избирательной амплификации фрагментов ДНК при помощи ПЦР и дальнейшее развитие этого метода решило эту проблему (Чемерис А.В. и др., 1999).
В 1983 году сотрудник фирмы «Cetus» Кари Мелис предложил метод, ставший в дальнейшем известным как полимеразная цепная реакция. Суть метода заключается в многократном копировании (амплификации) in vitro определенных участков ДНК в процессе повторяющихся температурных циклов. На каждом цикле амплификации синтезированные ранее фрагменты вновь копируются ДНК-полимеразой. Благодаря этому происходит многократное увеличение количества специфических фрагментов ДНК, что значительно упрощает дальнейший анализ (Menchen S. et al., 1996; Ruiz-Martinez M. et al., 1993). Оборудование для проведения ПЦР впервые вводит в продажу Applied Biosystems в 1996 г. На сегодня существуют следующие модели приборов для ПЦР в реальном времени: это "iQi Cycler" ("Bio-Rad", США), несколько типов "ABI Prism" ("Applied Biosystems", США), "Light Cycler" ("Roche", Швейцария), "Smart Cycler" ("Cepheid", США) (BioInformatics, 2003). Каждый цикл амплификации состоит из трех этапов. На первом этапе необходимо денатурировать двойную цепь ДНК, находящуюся в исследуемом образце. Для этого реакционную смесь нагревают до 92-95С, в результате чего двухцепочечные молекулы ДНК расплетаются с образованием одноцепочечных молекул. На втором этапе используются два коротких (от 15 до 30 п.н.) олигонуклеотида с определенной последовательностью, которые действуют как праймеры, каждый из которых комплементарен одному из двух 3` – концов участков, ограничивающих амплифицируемый фрагмент. Праймеры присоединяются к одноцепочечной ДНК-мишени, температура на этой стадии варьирует от 50 до 65С в зависимости от нуклеотидного состава праймеров. Этот процесс носит название «отжиг». Если правило комплементарности Чаргаффа не соблюдено, то отжига праймеров не происходит. Правильно подобранные праймеры обеспечивают специфичность и чувствительность реакции. После отжига праймеров температуру в реакционной смеси доводят до оптимальной (72С) для работы ДНК-полимеразы (Taq-полимераза), которая достраивает вторую цепь ДНК с 3 -конца праймера, в присутствии 4-х дезоксинуклеотидтрифосфатов (дНТФ) - дезоксиаденозинтрифосфата (дАТФ), дезоксигуанозинтрифосфата (дГТФ), дезоксицитозинтрифосфата (дЦТФ) и дезокситимидинтрифосфата (дТТФ).
Этафаза называется полимеризацией. Такой цикл (денатурация, отжиг, полимеризацию) может быть повторен примерно 25-30 раз с удвоением в каждом цикле количества дуплексного фрагмента ДНК. За n циклов образуется 2n копий дуплексного фрагмента, ограниченного праймерами. Затем реакционную смесь инкубируют несколько минут при 72С, чтобы полимераза смогла достроить недополимеризованные участки – стадия элонгации. Заключительная стадия – хранение – проходит при 4С. Термостабильная ДНК- полимераза позволяет осуществлять множество ПЦР – циклов при однократном введении фермента. Наиболее часто используемыми ферментами являются Taq ДНК- полимераза (из Thermusaquaticus) и Pfu ДНК-полимераза (Pyrococcusfuriosus) поскольку они имеют максимальную активность в температурном интервале 70-75С, что позволяет автоматизировать процесс. При таких условиях отжиг праймеров (их длина составляет около 20 п.н.) и ДНК происходит более специфично, чем при 37С – оптимальной температуре для ДНК полимеразы E. сoli. В результате ассоциация праймеров происходит более точно, что сводит к минимуму амплификацию нежелательных сегментов ДНК, особенно при присутствии всей геномной ДНК (Powledge T., 2004). В автоматическом секвенировании ДНК применяются различные высокопроцессивные ДНК-полимеразы. Выбор каждой из них во многом зависит от температурных особенностей проводимых терминирующих реакций. Анализ высоты пиков в зависимости от используемых ферментов показал, что Taq ДНК-полимераза, дает равномерные по высоте пики (Parker L. et al., 1995; Parker L. et al., 1996). Основными необходимыми составляющими при проведении реакций секвенирования ферментативным методом служат матрицы ДНК, олигонуклеотидные праймеры, ДНК-полимеразы, смеси дНТФ/ддНТФ, меченые молекулы (Bock J., Slightom J., 1995).
Генотипирование бройлеров кросса «Иза Хаббард Ф-15» по трем полиморфным сайтам гена PPARG
Проведено генотипирование 150 образцов по выявленным в представленной работе аллелям SNP (4855561А С, 4856011T С, 4857001Т G) гена PPARG (с использованием аллелеспецифических праймеров, приведенных в таблице 5). По результатам генотипирования вся выборка бройлеров кросса «Иза Хаббард Ф-15» - 150 особей, была разделена на три группы с высоким, средним и низким содержанием абдоминального жира (см. приложения 1,2,3).
Анализ последовательности PPARG в области мутации показал, что мутация не приводит к образованию сайта ретрикции, в этой связи в качестве метода для теоретического моделирования тест-системы нами был выбран метод аллелеспецифической ПЦР (рис. 12).
Проведена полимеразная цепная реакция по гену PPARG с аллелеспецифическими праймерами - по два альтернативных и одному универсальному праймеру для каждого SNP. Аллельные варианты различаются за счет того, что 3 -концевой нуклеотид одного из праймеров гибридизуется непосредственно с вариабельным нуклеотидом (позиция SNP), обуславливающим наличие или отсутствие продуктов ПЦР, что идентифицируется наличием или отсутствием полос на электрофореграмме (рис. 13). Так наличие полос в двух соседних лунках говорит о гетерозиготности пробы, отсутствие полосы в первой парной лунке говорит о гомозиготности по аллелю А, а отсутствие полосы во второй парной лунке о гомозиготности по аллелю С.
Следующим этапом в нашем анализе стало сравнение выборки на нормальность распределения, а также построение диаграммы (Box plots).
Установили статистически значимую связь генотипов: АА, АС, СС с содержанием абдоминального жира в различных группах кур, результаты можно оценить на рисунках 14 и 15 соответственно.
На рисунке 14 изображен график Q-Q plots. Квантильные графики (Q-Q Plots) строятся следующим образом. Сначала определяются эмпирические значения изучаемого признака, соответствующие 5, 10, ., 95-процентилю. Затем по таблице нормального распределения для каждого из этих процентилей определяются z-значения (теоретические). Два полученных ряда чисел задают координаты точек на графике: эмпирические значения признака откладываются на оси абсцисс, а соответствующие им теоретические значения — на оси ординат. Для нормального распределения все точки будут лежать на одной прямой или рядом с ней. Чем больше расстояние от точек до прямой линии, тем меньше распределение соответствует нормальному.
Оценка результативности разработанной тест-системы определения полиморфизма PPARG показала наличие ПЦР фрагмента ожидаемой длины 190 п.о. (рис.17) во всех образцах вне зависимости от концентрации ДНК, типа исходного биологического материала, и метода выделения ДНК. Так наличие полос в двух соседних лунках говорит о гетерозиготности пробы, отсутствие полосы в первой парной лунке говорит о гомозиготности по аллелю С, а отсутствие полосы во второй парной лунке о гомозиготности по аллелю Т.
Оценка результативности разработанной тест-системы определения полиморфизма PPARG показала наличие ПЦР фрагмента ожидаемой длины 190 п.о. (рис.21) во всех образцах вне зависимости от концентрации ДНК, типа исходного биологического материала, и метода выделения ДНК. Так наличие полос в двух соседних лунках говорит о гетерозиготности пробы, отсутствие полосы в первой парной лунке говорит о гомозиготности по аллелю G, а отсутствие полосы во второй парной лунке о гомозиготности по аллелю T
Использование ПЦР с аллелеспецифическими праймерами позволило установить наличие статистически значимых ассоциаций полиморфных сайтов гена PPARG в группах бройлеров с низким, средним и высоким содержанием абдоминального жира. Это свидетельствует о связи генотипов по этим полиморфным сайтам с изучаемым признаком.