Введение к работе
Актуальность темы. Выделенные из клеток ДНК-содержапгие системы представляют собой модели генетического аппарата, под которым принято по-ігимать ДНК-содержащие структурные формирования клеток.
Исследования генетического аішарата человека на его модельных системах в плане их структурной гетерогешюсти позволяют изучать особенности многоуровневой организации системы управления жизнедеятельностью клеток, структурное обеспечение дифференциальной экспрессии генов и вопросы наследования и изменчивости в проявлении генов клеточных поколений в онтогенезе.
Без уяснения всех особенностей структурной реализации функциональных состояний генетического аішарата едва ли станет возможным понимание закономерностей функционирования клеток человека в норме и при патологии. Проблема структурной гетерогенности ДНК является основополагающей для молекулярной генетики, поскольку именно разнообразие структурной организации наследственного материала клеток обеспечивает все многообразие функционального проявления генома.
Структурная гетерогенность ДНК предполагает не только специфическую оргашгзацию последовательности пуклеотидов, по также специфическую пространственную организацию ДИК в суперсішрализовапньге петли, структурно-функциональный смысл которых еще требует активных исследований. Уровень петельной суперспиралъной оргаїїизации ДНК оказывает эффективное влияние на шггепсивпость всех процессов, вовлекая в свое обеспечение специальные ферменты - топоизомеразы.
Однако, хотя первое сообщение Кука и Брэзил о суперспирализации ДНК эукариот появилось более 20 лет назад (Cook P.R., I.A.Brazell, 1975 ) все еще остается множество вопросов по поводу оргаянзацтга этого уровня структурирования ДНК и продолжается поиск новых подходов к его изучению.
Цель и задачи исследования. Цель работы состояла в изучении структурной гетерогешюсти лизатов клеток человека в их реакции на интеркалирующші в ДІЖ бромид этидия и в
поиске доказательств топологической (суперспиралыгой) гетерогенности ДНК генома человека.
В соответствии с целью исследования в работе решались следующие задачи:
-
Разработать метод получения лизатов клеток человека, способный обеспечить выделение нуклеоидов лейкоцитов и фибробластов в состоянии, где равновесность системы позволяет осуществлять вискозиметрическое титрование нуклеоидов интеркалирующим в ДНК бромидом этидия.
-
Проанализировать природу аномальной зависимости вязкости клеточных лизатов от концентрации бромида этидия.
-
Охарактеризовать нолипептиднъш состав остаточного белка на ДНК нуклеоидов клеток человека.
4. Проанализировать возможности вискозиметрического титрования
бромидом этидия нуклеоидов в лизатах клеток для исследования популяциошюй
гетерогенности генома человека на уровне топологии ДНК.
Научная новизна работы. Проведенные в диссертационной работе исследования являются первым шагом в экспериментальном обосновании идеи о том, что регулируемая сунерешгоализация ДНК на отдельных участках генома является механизмом регуляции активности генов эукарнот. Обнаружение специфических для каждого из обследованных индивидов уровней суперсішршшзаіши петель ДНК предлагает новый тип генетических маркеров, которые как показано сохраняются у конкретного индивида в течение изученного трехлетнего периода и обнаруживают различия в разных дифферешщровашшх клетках. Выявление определенной вариабельности суиерегшрализапии некоторых негель ядерной ДНК лейкоцитов при повторных заборах крови.свидетельствуют о существовании адаптациошюй реакции генома на этом уровне организации ДНК. Научно-практическая значимость. Получешше данные могут быть использованы для дальнейшего углубления современных представлений о механизмах генетических процессов с учетом дифференциальной и регулируемой суиерспирализации ДНК. Представляет интерес проведение анализа уровней сунерсиирализа-ции ДНК в клетках родственных индивидов (семейный анализ).
Основные положеіаія. выносимые на защиту.
I.Метод вискозиметрического титрования бромидом этидия ігуклеоидов в лизнроватшх специально разработаїшьш способом лейкоцитах и фибробластах человека, позволяет получать воспроизводимые кривые титрования при выделении клеток из конкретного объекта (однократный забор крови донора, сбор фнб-робластов с конкретного пассажа культивирования).
-
Интеркаляция бромида этидия в ДНК иуклеоидов исследуемых клеток и сопровождаемые изменения суперспирализации ДНК обусловливают экстремальный характер кривых титрования (наличие макагмумов и мишгмумов).
-
Выявлена частичная вариабельность кривых титрования доноров при повторных заборах крови, отражающая физиологические изменения геномов лейкоцитов периферической крови.
4.Обнаружены специфические для каждого из обследованных индивидов уровни суперспирализации петель ДНК.
5. При сравнении кривых титрования лизатов лейкоцитов и фибробластов допоров выявлено, что в разных диффереішироваїпплх клетках каждого гагдиви-да имеются семейства петель ДНК с достоверно различающейся плотностью су-перегпгрализации.
Объем и структура диссертации. Диссертация содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты и обсуждение, выводы, заключение, список литературы. Работа изложеш на 139 страіпщах машинописного текста и иллюстрирована 11 таблицами и 17 рисунками. Список штгературы содержит 213 ігубликацшї, включая 172 работы зарубежных авторов.