Электронная библиотека диссертаций и авторефератов России
dslib.net
Библиотека диссертаций
Навигация
Каталог диссертаций России
Англоязычные диссертации
Диссертации бесплатно
Предстоящие защиты
Рецензии на автореферат
Отчисления авторам
Мой кабинет
Заказы: забрать, оплатить
Мой личный счет
Мой профиль
Мой авторский профиль
Подписки на рассылки



расширенный поиск

АНАЛИЗ ВАРИАБЕЛЬНОСТИ ГЕНОМА И ПРИОРИТИЗАЦИЯ ПАТОГЕННЫХ ПРОЦЕССОВ-КАНДИДАТОВ ПРИ НАРУШЕНИЯХ ПСИХИКИ У ДЕТЕЙ Зеленова Мария Александровна

Диссертация - 480 руб., доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Автореферат - бесплатно, доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Зеленова Мария Александровна. АНАЛИЗ ВАРИАБЕЛЬНОСТИ ГЕНОМА И ПРИОРИТИЗАЦИЯ ПАТОГЕННЫХ ПРОЦЕССОВ-КАНДИДАТОВ ПРИ НАРУШЕНИЯХ ПСИХИКИ У ДЕТЕЙ: диссертация ... кандидата Биологических наук: 03.02.07 / Зеленова Мария Александровна;[Место защиты: ФГАОУ ВО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет»], 2017.- 157 с.

Содержание к диссертации

Введение

II. Обзор литературы

11.1 Генетические особенности умственной отсталости .

11.1.1 Хромосомные синдромы

11.1.1.1 Аутосомные синдромы

11.1.1.2 Гоносомные синдромы

11.1.2 Микроделеционные и микродупликационные синдромы

11.1.3 Вариации числа копий последовательности ДНК (CNV)

11.1.4 Моногенные синдромы

11.1.5 Эпигенетические нарушения

11.2 Генетические особенности аутизма

II.2.1 Генетические синдромы и хромосомные аномалии, ассоциированные с РАС

II.2.3 Гены – кандидаты и моногенные формы аутизма

11.3 Определение молекулярных механизмов нарушения психики

11.3.2.1 Нарушение геномных и протеомных сетей, связанных с формированием, созреванием и пластичностью синапсов .

11.3.2.2 Нарушение цикла пресинаптических везикул

11.3.2.3 Нарушения организации постсинаптической плотности

11.3.2.4 Нарушения межклеточного взаимодействия

II.3.3 Практическое применение результатов исследований молекулярных механизмов нарушений психики .

II.4 Методы, используемые для выявления генетических причин нарушений психики

11.4.1 Цитогенетический метод

11.4.2 FISH

11.4.3 Молекулярное кариотипирование

11.4.4 Биоинформатический метод

II. 5 Заключение .

III. Объекты и методы исследования

III.1 Объект исследования

III. 2 Методы исследования .

III. 2 .1 Цитогенетический метод

III. 2.3 SNP-array

III. 2.4 Биоинформатический метод

III. 2.5 Статистический метод

III.2.2.7 Молекулярное кариотипирование - метод SNP array

IV. Результаты и обсуждение

V. Заключение .

VI. Выводы .

VII. Список литературы

VIII. Приложения

Список сокращений .

Генетические особенности аутизма

Термин «аутизм» был впервые использован швейцарским психиатром Э. Блейером в 1913 году. Блейер использовал словосочетание «аутистическое мышление» для определения одного из симптомов шизофрении. Он описал аутистическое мышление как отстранение от логики и реальности. Л. Каннер, однако, использовал этот термин, чтобы определить заболевание, а не симптом. Впервые аутизм был им охарактеризован в качестве отдельного заболевания в 1943 году, в клиническом описании 11 мальчиков с аутистическим расстройством и нарушением эмоционального контакта (Kanner, 1943). В данной работе Каннер признавал аутизм уникальным, отдельным синдромом, а также указывал на некоторые особенности таких детей, например, требовательность ребенка к повторению ежедневного распорядка, способности саванта (неординарные способности в определенной области знаний, не согласующиеся с другими особенностями личности) и нарушение социальных навыков и использования речи. Каннер считал, что фундаментальной проблемой детей с аутизмом была неспособность строить отношения с другими людьми, проявляющаяся с рождения. Дети более охотно находились в одиночестве и часто игнорировали присутствие других людей, они предпочитали взаимодействие с игрушками и неигровыми предметами общению с присутствующими. Каннер дифференцировал социальные нарушения от шизофрении на основании того, что наблюдаемые им дети никогда не формировали значимых отношений с окружающим миром, тогда как для пациентов с шизофренией была характерна утрата ранее значимых взаимодействий. Однако, описывая аутизм, Каннер не упоминал когнитивные нарушения в дополнение к аффективным, и в своих последующих работах поддерживал идею о вине родителей в заболевании детей (холодные матери), и не признавал возможность наличия органической причины состояния вплоть до 1971 года. В 1960-х и 70-х годах аутизм рассматривался как форма психоза, наподобие детской шизофрении, и превалировало мнение, что основной причиной его появления были неправильные методы родительского воспитания. Б. Беттельхайм обвинял родителей в этом состоянии и писал, что «основной фактор детского аутизма — желание родителей, чтобы их ребенок никогда не существовал» (Bettelheim, 1967). Взгляды Беттельхайма формировались под сильным влиянием Фрейда и психоанализа, он категорически отрицал возможность вклада генетических, а не эмоциональных факторов. Обнаружение связи между редкими генетическими болезнями, такими как фенилкетонурия (Friedman, 1969), казалось бы, могло способствовать выводам об ошибочности последней теории, что и было доказано позже. Однако в 60-х и 70-х годах этого не случилось, и эти синдромальные формы аутизма были признаны исключениями (Cantwell et al., 1979). Лишь в 1980-х годах аутизм был признан заболеванием, связанным с нарушением развития и имеющим биомедицинское происхождение. Современное представление об аутизме как о генетическом заболевании было подкреплено демонстрацией его наследственной природы и ассоциацией с различными хромосомными и моногенными синдромами (Gillberg et al., 1985). Несмотря на то, что способы диагностики за три десятилетия динамично развивались, диагноз «аутизм» по-прежнему подразумевает нарушение социального взаимодействия как основу данного заболевания. В 1979 году Л. Винг и Д. Гауд провели исследование 173 детей в Лондоне, позволившее им ввести ключевые концепции – «аутистический спектр» и «триада аутизма». Диагноз «аутистическое расстройство» подразумевает присутствие трех основных пунктов, с манифестацией до трехлетнего возраста: нарушение речи и взаимодействия, нарушение социального взаимодействия, наличие стереотипных движений, поведения или интересов (Wing et al., 1979; Bertoglio et al., 2009). Одно из ключевых нарушений при расстройствах аутистического спектра проявляется во взаимодействии с другими людьми. Трудности в этой сфере могут быть настолько выражены, что многие родители предполагают у детей глухоту. Нарушения социальных навыков могут проявляться в различной форме и варьировать по степени тяжести. Дети с РАС реже инициируют контакт c ровесниками, и, несмотря на то, что попытки инициировать контакт со взрослыми людьми у таких детей примерно равны по частоте наблюдаемым у нормально развивающихся сверстников, отмечается низкое качество таких взаимодействий и их ритуалистичность (Hauck et al., 1995). Дети испытывают трудности с восприятием сложных эмоций других людей (Golan et al., 2007). Также у них отмечается недостаток разделенного внимания (способность сосредотачиваться на объекте или событии вместе с другими людьми) (Naber et al.,2008). Часто обнаруживаемыми трудностями являются также аномальное использование глазного контакта (Ruffman et al., 2001) и нарушение имитации (Smith et al.,1994). Вышеперечисленные особенности социализации приводят к трудностям установления отношений с другими людьми (Travis et al., 1998). Было выявлено, что нарушение коммуникативных навыков является основной причиной обращения родителей к специалисту с предположением о том, что развитие ребенка отклоняется от нормального (DeGiacomo et al., 1998). Около 33-50% детей с РАС не овладевают экспрессивной речью (Noens et al., 2005), а многие из тех, кто может разговаривать, используют коммуникацию в основном для выражения своих потребностей, но редко для социализации. Речь детей с РАС характеризуется определенными аномалиями, из которых наиболее частыми являются эхолалия и отсроченное повторение стереотипных фраз (Noens et al., 2005). Еще одним симптомом, характерным для РАС, является стереотипное поведение и интересы, иначе называемые стереотипиями. Такое поведение может принимать разнообразные формы, среди которых – привязанность к определенным объектам, сосредоточенность на частях предметов, сопротивление изменениям, навязчивые ритуалы (Rutter et al., 1971). Стереотипии могут мешать как проявлению уже имеющихся навыков, так и приобретению новых. Дети, у которых менее выражено повторяющееся поведение, с большей вероятностью вовлекаются в игровые действия (Honey et al., 2007), а большая выраженность стереотипий может являться предиктором общей тяжести заболевания (Bodfish et al., 2000). Предположения о том, что аутизм имеет генетическую природу, начали подтверждаться в 1967 году, когда было отмечено, что риск развития аутизма для сибсов в разы выше общепопуляционного. Четыре первых близнецовых исследования оценили конкордантность по заболеванию в 60% для монозиготных и 0-5% для дизиготных близнецов, что наглядно демонстрировало вклад наследственности в исследуемую болезнь (Happ., Ronald., 2008). К концу 80-х годов было показано, что индекс наследуемости для данного заболевания составляет 0.85-0.92 (Miles, 2011). Частота аутизма на данный момент является относительно высокой. Ранние работы по оценке распространенности аутизма указывали на то, что это редкое заболевание, проявляющееся с частотой примерно 4:10000 (Wing et al., 1976). Со временем, однако, диагностические критерии изменились и расширились, вследствие чего изменились и показатели – от 1:1000 в 1988 году, до 1:150 – 1:200 в 2002 для заболеваний аутистического спектра, и 1:500 для узкого диагноза «аутизм» (Autism and Developmental Disabilities Monitoring Network Surveillance, 2002).

Сложность диагностики аутизма заключается в отсутствии валидных лабораторных тестов или биологических маркеров, которые могли бы подтвердить диагноз, поэтому диагностика строится целиком на наблюдении за поведением и определении когнитивного фенотипа. В связи с тем, что этот диагноз в настоящее время не основан на этиологии или патофизиологии, заболевания аутистического спектра не являются одним единым диагнозом, а скорее обобщающей группой заболеваний или клинических синдромов.

Коэффициент интеллекта среди индивидуумов с аутистическим расстройством также различается. Он может колебаться от «нормального» до «выше нормы», а его снижение наблюдается, по различным оценкам, в 30-70% случаев РАС (Autism and Developmental Disabilities Monitoring Network Surveillance Year., 2002; Bertoglio et al., 2009). Генетические нарушения, выявляемые при РАС, можно разделить на цитогенетически видимые хромосомные аномалии (5%), вариации числа копий последовательности ДНК (CNV) (10– 20%) и моногенные заболевания (5%) (Miles, 2011).

Практическое применение результатов исследований молекулярных механизмов нарушений психики

Различные исследования, направленные на изучение молекулярных сетей, в которые вовлечены белки, ассоциированные с умственной отсталостью, выявили, что многие из них принадлежат к хорошо известным сигнальным путям. Потенциальные терапевтические подходы, которые модулируют их активность, могут быть проверены в доклинических испытаниях. Например, большинство мутаций, влияющих на малые GTPазы, ведут к гиперактивации пути транспорта данных ферментов. Чтобы уменьшить трансдукцию сигнала, можно использовать либо общие ингибиторы малых GTPаз, либо более специфические ингибиторы, целью которых являются нижележащие киназы (Pavlowsky et al., 2012). Ингибирование фарнезил-трансферазы или HMG-CoA-редуктазы с BMS191563 и молекулами из семейства Statin было успешно использовано для уменьшения уровня активации Ras у модельных животных с нейрофиброматозом первого типа, комплексном нервно-психическом нарушении, обусловленном потерей функции RasGAP, NF1 (Shilyansky et al., 2010). Мутации в других генах, ассоциированных с умственной отсталостью, могут инактивировать некоторые универсальные геномные сети типа APIX /Rac / PAK3 / LIMK или IL1RAPL1 / JNK. В этих случаях, терапевтические стратегии могут быть связаны с активацией нижележащих эффекторов.

Несмотря на прогресс в изучении молекулярных механизмов заболеваний, в настоящее время существуют два ограничения потенциального терапевтического подхода. Первое заключается в том, чтобы специфично ориентироваться на конкретные изменения в центральной нервной системе, хотя эта проблема является общей для всех терапевтических подходов, ориентированных на распространенные геномные сети. Вторым главным ограничением являются временные рамки, в которых появляются нарушения, и промежуток времени, в котором лечение может их устранить. В заключение можно сказать, что рассматривать две основные терапевтические стратегии (основанную на вовлеченных в нарушенные сигнальные пути белках и основанную на биологическом процессе, нарушенном мутацией), можно только зная патогенетические механизмы психических нарушений. Таким образом, изучение геномных сетей и взаимодействия генов является необходимым для полноценного анализа результатов молекулярного кариотипирования, что делает биоинформатический анализ неотъемлемой частью интерпретации результатов (Юров и др., 2013; Iourov et al., 2014, 2015).

Молекулярное кариотипирование - метод SNP array

Молекулярное кариотипирование методом SNP array проводилось при помощи оборудования фирмы Affymetrix. Для анализа использовался чип CytoScan HD. Данный чип содержит более 2,6 миллионов маркеров для анализа CNV и около 750,000 SNPs. Основным отличием принципа данного метода является отсутствие необходимости в контрольной ДНК (рис 4).

Подготовка чипа к анализу разбивалась на 9 стадий (согласно протоколу, предоставленному компанией Affymetrix, рис. 5): обработка геномной ДНК рестриктазой, лигирование, ПЦР (полимеразная цепная реакция), Очистка амплифицированной ДНК, измерение концентрации ДНК, фрагментация, мечение, таргетная гибридизация. Вначале буферный раствор с низким содержанием ЭДТА ТЕ (трис и этилендиаминтетрауксусная кислота) и 96-ти луночный планшет помещались на лд вместе с пробирками, содержащими геномную ДНК, разбавленной до 50 нг/мкл с помощью буфера. Геномную ДНК образцов перемешивали на вортексе в течение 3 секунд, затем осаждали в течение 1 минуты. Пять микролитров первого образца переносили в лунку A1 планшета (рис.5). Остальные образцы переносились таким же образом. В случае контрольной ДНК, 5 микролитров из CytoScan Reagent Kit (+) переносили в лунку A7, а Low EDTA TE buffer (–) в лунку A8. Планшет закрывали и центрифугировали в течение 1 минуты при 2000 оборотах.

Далее, проводили обработку рестриктазой и готовили Digestion Master Mix, затем последний добавляли в пробирки с геномной ДНК и контролем (по 14,75 мкл). Встряхивали планшет на вортексе при высокой скорости в течение 1 секунды, затем убавляли скорость до 2000 оборотов и встрояхивали в течение 1 минуты. Загружали планшет в термоциклер и запускали в программу CytoScan Digest (2 часа при температуре 37C, 20 минут при температуре 95C, далее поддерживается температура 4C). Образцы подготавливались к лигированию: пробирки центрифугировали при 2000 оборотах в течение 1 минуты, затем перемешивали на вортексе 3 раза, каждый раз по 1 секунде. Далее подготавливали смесь для лигирования и добавляли 5.25 мкл Ligation Master Mix к каждому образцу. Затем, пробирки встряхивали на вортексе на высокой скорости в течение 1 секунды, затем снижали скорость и встряхивали на 2000 оборотов 1 минуту. Далее запускали программу CytoScan Ligate на термоциклере (3 часа при температуре 16C, 20 минут при температуре 70C). Когда программа CytoScan Ligate завершалась, вынимали планшет и крутили на 2000 в течение 1 минуты. Затем добавляли 75 мкл воды к каждой пробирке. Пробирки крутили на вортексе на высокой скорости в течение 1 секунды, затем снижали скорость и крутили на 2000 оборотов, 1 минуту. На нижнюю часть рабочей поверхности помещали новый планшет и помечали «ПЦР». Добавляли 10 мкл каждого образца в соответствующие 4 лунки в новом планшете. Крутили на 2000 оборотов в течение 1 минуты. Готовили PCR Master Mix. Добавляли 90 мкл PCR Master Mix к каждому образцу. Далее на льду переносили планшет в зону пост-ПЦР. Крышку термоциклера нагревали. После загрузки планшета в термоциклер запускали программу CytoScan PCR. Далее результаты ПЦР визуализировались с помощью электрофореза. Если размер амплифицированной последовательности ДНК находился между 150 пн и 2000 пн, переходили к следующему этапу. Для начала готовили Purification Wash Buffer, затем добавляли 720 мкл Purification Beads в каждый образец. Образцы хорошо перемешивали, переворачивая 10 раз, затем инкубировали 10 минут при комнатной температуре. Далее, пробирки загружали в центрифугу и прокручивали 3 минуты на максимальной скорости (16100 оборотов). Пробирки оставляли на магнитной мешалке до тех пор, пока осадок не переместится по направлению к магниту. Надосадочную жидкость затем удаляли, и добавляли Purification Wash Buffer - 1 мл к каждой пробирке. Далее прокручивали на вортексе 2 минуты при максимальной скорости и центрифугировали пробирки в течение 3 минут, также при максимальной скорости. Пробирки помещали на магнитную мешалку, пока осадок не переместится по направлению к магниту. Декантировали супернатант, затем оставляли на 30 секунд на максимальной скорости. К образцам добавляли 52 мкл элюирующего буфера. Образец в количестве 47 мкл переносили в соответствующую лунку на планшете. Далее переходили к измерению концентрации ДНК с использованием NanoDrop. Концентрацию измеряли в 2 мкл каждого образца при 260, 280 и 320 нм (где 280 и 320 использовали как контроль). Концентрацию мкл/мл рассчитывали по формуле:

Если результат составлял 3.0 мкг/мкл, переходили к этапу фрагментации. Подготавливали буфер и смесь для фрагментации и, затем добавляли 10 мкл смеси к каждому образцу. Центрифугировали на охлажденной центрифуге на 2000 в течение 1 минуты. Реакции фрагментации проверяли на электрофорезе и переходили к мечению. Рис.6 Схематическое изображение SNP анализа Labeling Master Mix добавляли к образцам (по 19.5 мкл), затем крутили на вортексе на высокой скорости, затем 1 минуту при 2000 оборотах. Переходили к этапу таргетной гибридизации. На компьютере создавали Batch Registration File, чтобы зарегистрировать новый образец, используя AGCC (Affymetrix GeneChip Command Console Portal). Готовили гибридизационную смесь, затем добавляли по 190 мкл к каждому образцу. Планшет с образцами помещали в разогретый термоциклер и включали программу CytoScan Hyb (10 минут при температуре 95C, далее поддерживается температура 45C) . Затем образцы помещались на чип, по 200 мкл, после чего чипы помещали в специальную кювету и ставили в гибридизационную печь. Далее чипы вращались при 50C, 60 оборотов/мин в течение от 16 до 18 часов. После этого переходили к этапу «отмывка, окрашивание и сканирование». Для каждого чипа в 1,5 мл микроцентрифужные пробирки добавлялись следующие реагенты: 500 мкл окрашивающего буфера, 500 мкл окрашивающего буфера 2, 800 мкл Array Holding Buffer. Когда этап отмывки и окрашивания завершался, чипы из аппарата вынимали и проверяли наличие пузырьков. На AGCC выбирали протокол CytoScanHD_Array_450, являющийся сопровождением к этапу сканирования. Далее начинали сканирование с использованием сканера GeneChip Scanner 3000 7G (рис.6). Дальнейшая обработка данных проводилась с помощью специализированного оборудования The Affymetrix Chromosome Analysis Suite (ChAS). CHAS использует геномную аннотацию Hg19, и содержит обновляемые данные, получаемые из баз данных DGV, OMIM и RefSeq.

Результаты и обсуждение

Методами молекулярного кариотипирования в нашей лаборатории было исследовано 374 ребенка с аутизмом и/или задержкой психомоторного/психоречевого развития или умственной отсталостью, врожденными пороками и/или микроаномалиями развития. В исследуемой когорте пациентов были выявлены: хромосомные аномалии (делеции и наличие дополнительного хромосомного материала размером более 500 тыс. пн.), потеря гетерозиготности, затрагивающая импринтированные гены, увеличение числа участков потери гетерозиготности, характерного для детей, рожденных от кровнородственных браков, сложные хромосомные перестройки (рис.9, табл.9). Клинически значимых и вероятно патогенных вариантов генома не было обнаружено у 26 детей (7%). Хромосомные аномалии обнаружены у 108 пациентов (28,9%), из которых регулярные делеции составляли 8,6% (32 случая), а дополнительный хромосомный материал был выявлен в 4,5% случаев (17 детей).

Среди хромосомных аномалий также наблюдались мозаичные делеции (7 детей, 1,9%) и дупликации (5 детей, 1,3%), а также случаи сочетания мозаичных и регулярных перестроек, затрагивающие один участок (15 человек, 4%) (рис.10). В исследованной когорте у 26 пациентов (7%) были также выявлены случаи комплексных перестроек (хромосомных аномалий) в виде сочетания нескольких хромосомных аномалий и сочетания хромосомной аномалии и потери гетерозиготности в импринтированном участке. У двоих пациентов (0,5%) отмечалась геномная нестабильность в виде множественных крупных CNV и хромосомных аномалий (рис.11). В двух случаях (0,5%) была выявлена анеуплоидия: моносомия хромосомы 21 и трисомия хромосомы Х (рис.12). У одного пациента (0,3%) была выявлена мозаичная трисомия хромосомы 8 не менее чем в 20% клеток. В одном случае было предположено наличие маркерной хромосомы. Множественные потери гетерозиготности, характерные для детей от кровнородственных браков, были выявлены в 13 случаях (3,5%)(рис.13). Потеря гетерозиготности в импринтированных генах отмечалась в 36 случаях (9,6%). Таким образом, нарушения генома в виде анеуплоидии, хромосомных аномалий, сложных хромосомных перестроек, потери гетерозиготности, характерной для детей от кровнородственных браков, а также потери гетерозиготности в импринтированных генах, были выявлены в 157 случаях (42%) (табл.9), патогенных или вероятно патогенных вариантов не было выявлено в 26 случаях (7%), а у 191 (51%) пациента были обнаружены патогенные и вероятно патогенные CNV или интрагенные перестройки размером от 1 тыс.пн до 500 тыс. пн (табл.10).

Данные различных исследований методами молекулярного кариотипирования показывают, что диагностическая значимость метода сильно варьируется. Группа D Arrigo, исследовав 329 пациентов с умственной отсталостью и задержкой развития, направленных в специализированный медицинский центр, при помощи платформ AGILENT4X180 platform и ISCA 4x180 K Cytochip, BlueGenome, выявили, что патогенные варианты наблюдаются в 16% случаев, и вероятно патогенные варианты обнаруживаются еще в 31%, что в общей сложности составляет 47% (D Arrigo et al., 2016). В настоящей работе диагностическая эффективность молекулярного кариотипирования для хромосомных аномалий и нарушений генома/эпигенома составила 42%, а патогенные и вероятно патогенные варианты (CNV) были выявлены в 51% случаев. В работе Uwineza. et al., 2014 диагностическая значимость array CGH определяется как 26%. Было исследовано 50 пациентов с использованием SurePrint G3 Human CGH Microarray ISCA 4x180K v2 (AMADID 031748; Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). Другая группа исследователей (Battaglia et al., 2013), обследовав 349 пациентов с задержкой развития/умственной отсталостью/РАС (Integrachip 0.8 Mb, Technogenetics, Milan, Italy и Agilent 44 K or 180 K), пришла к выводу, что патогенные варианты наблюдаются в 71.4%. Таким образом, можно заключить, что разброс оценок диагностической значимости молекулярного кариотипирования существенно больше, чем по отношению к HR CGH и кариотипированию с применением G окрашивания (Ворсанова и др., 2013б). Можно предположить, что причинами такого разброса данных являются различия в выборе обследуемых групп, разрешения чипов, алгоритмов анализа и критериев определения патогенных вариантов. Тем не менее, полученные данные касательно патогенных вариантов согласуются с литературными данными. Однако, наши совокупные результаты (93%) превышают литературные. Вероятно, это связано с высокой эффективностью алгоритма определения патогенных и вероятно патогенных CNV. Для уточнения наличия анеуплоидии, маркерных хромосом и сбалансированных геномных перестроек была выбрана группа пациентов, которым было рекомендовано подтверждение результатов молекулярного кариотипирования с помощью цитогенетического анализа.

Цитогенетическим методом с использованием G- и С-окрашивания было обследовано 253 ребенка. Кариотип без хромосомных нарушений (46,ХХ или 46,ХY без учета хромосомной нестабильности и вариантов гетерохроматина) был выявлен у 209 детей (82,6%). Хромосомные и геномные аномалии были выявлены в следующем количестве (рис.14): делеции – у 15 детей (5,9%), дополнительный материал – у 8 пациентов (3,1%), транслокации – 3 (1,2 %), инверсии – 1 (0,4%), мозаицизм – 12 (4,7%), маркерные и кольцевые хромосомы – 3 (1,9%), анеуплоидии – 2 случая (0,8%). В таблице 10 представлены подробные описания перестроек.

Исходя из вышеописанных данных, диагностическая значимость кариотипирования составила 17,4%. Согласно данным различных исследований, в группе детей с умственной отсталостью (задержкой развития), врожденными пороками развития, аутистическими проявлениями и другими нарушениями, диагностическая значимость кариотипирования составляет от 3-5% до 15%-20% (Rauch et al., 2006). В некоторых работах представлена эффективность 8,8% (Bi, Borgan et al., 2012). Группа Bartnik et al. исследовала 256 пациентов с умственной отсталостью/задержкой развития, врожденными пороками развития и другими нарушениями. При помощи кариотипирования с применением G-окрашивания (разрешение 550 полос), у 234 пациентов был выявлен нормальный кариотип. В работе Bi et al., 2012 было выявлено 8% пациентов с несбалансированными нарушениями (делециями или дупликациями) и 0,8% сбалансированных перестроек. В настоящем исследовании несбалансированные делеции и дупликации были выявлены в 9% случаев. В работе Rauch, A. et al., 2006 исследовали 600 и 570 пациентов, направленных в цитогенетическую лабораторию и генетическую клинику по причине задержки развития/умственной отсталости, соответственно. В данных группах патогенные аберрации были выявлены в 15 и 20% случаев, соответственно. Таким образом, можно заключить, что вариативность данных относительно результатов кариотипирования в когортах с умственной отсталостью, РАС и пороками развития достаточно велика. Вероятно, это обусловлено критериями отбора пациентов для молекулярно-цитогенетического исследования или особенностями формирования выборки. В целом, наши результаты согласуются с литературными данными. Диагностическая значимость генетических исследований УО и РАС увеличилась на протяжение последних десятилетий. Так, в 1970х, когда кариотипирование только внедрялось в качестве стандартного исследования при умственной отсталости, диагностическая значимость определялась как 3–6,5%. Внедрение молекулярного кариотипирования к 2010 году увеличило эту цифру как минимум до 15-23% (Vissers et al 2016).