Андрогенез in vitro у яровой мягкой пшеницы Горбунова Валентина Юрьевна

Содержание к диссертации

Введение

1. Предпосылки андрогенеза in vitro у яровой мягкой пшеницы (Обзор литературы) 14

1.1.Генетические предпосылки спорофитного пути развития микроспор in vitro у яровой мягкой пшеницы 14

1.2. Влияние условий культивирования на эмбриоидогенез в культуре изолированных пыльников яровой мягкой пшеницы 25

1.3. Цитологические особенности андрогенеза in vitro у яровой мягкой пшеницы 31

1.4. Гормональная регуляция андрогегнеза in vitro у яровой мягкой пшеницы 54

1.5. Эффективность морфогенеза и регенерации растений в культуре изолированных пыльников яровой мягкой пшеницы 68

2. Материал и методы исследований 75

2.1. Растительный материал 75

2.2. Методы исследований 78

2.2.1. Методы культивирования изолированных пыльников 78

2.2.2. Цитологические методы исследования 82

2.2.3. Морфометрические методы изучения микроспор 95

2.2.4. Биохимические методы исследования 98

2.2.4.1. Комплексный метод выделения фитогормонов из растительных тканей 98

2.2.4.2. Твердофазный иммуноферментный анализ 99

2.2.4.3. Выделение тотальной ДНК 102

2.2.4.4. Проведение ревертазной реакции 105

2.2.4.5. Полимеразная цепная реакция ДНК 108

2.2.5. Статистические методы исследования 111

3. Влияние эндогенных и экзогенных факторов на андрогенез in vitro у яровой мягкой пшеницы 114

3.1. Зависимость андрогенеза in vitro от стадии развития микроспор и состояния стенок гнезда пыльника 114

3.1.1 Влияние цитоплазматической мужской стерильности 126

3.2. Влияние температурных воздействий 129

3.3. Влияние состава питательных сред 143

3.4. Влияние концентрации 2,4-Д на андрогенез in vitro 157

3.5. Исследование чувствительности сортов яровой мягкой пшеницы к 2-4Д 161

3.6. Генетическая детерминация уровня эндогенных фитогормонов в пыльнике у яровой мягкой пшеницы 166

3.7. Взаимовлияние эндо- и экзогенных факторов на андрогенез in vitro

4. Цитологические характеристики андрогенеза in vitro у яровой мягкой пшеницы

4.1. Цитологические характеристики начальных этапов спорофитного пути развития микроспор 187

4.2. Светооптические и ультраструктурные особенности строения клеток эмбриоида 195

4.3. Светооптические и ультраструктурные особенности строения клеток мофогенного и неморфогенного каллуса 201

5. Регенерация растений при у андрогенезе in vitro яровой мягкой пшеницы 13

5.1. Регенерационная способность генотипов яровой мягкой пшеницы в культуре изолированных пыльников 213

5.2. Селекционно-генетическая оценка андроклинных удвоенных гаплоидных линий яровой мягкой пшеницы 218

6. Генетическая изменчивость при андрогенезе in vitro у яровой мягкой пшеницы

6.1. Геномная изменчивость 223

6.2. Молекулярно-генетическая оценка АДГ линий 225

Обсуждение результатов 235

Выводы 254

Список цитированной литературы

• Влияние условий культивирования на эмбриоидогенез в культуре изолированных пыльников яровой мягкой пшеницы
• Методы культивирования изолированных пыльников
• Влияние цитоплазматической мужской стерильности
• Светооптические и ультраструктурные особенности строения клеток эмбриоида

Введение к работе

Актуальность темы диссертации. В современных генетических, моле-кулярно-биологических, биотехнологических и селекционных исследованиях важнейших сельскохозяйственных культур существуют проблемы, решение которых возможно только с помощью новых, нетрадиционных методов, позволяющих выявить генетический потенциал растений.

Внедрение новых клеточных технологий в сочетании с методами классической генетики и селекции открывает большие перспективы и для практического использования, и для решения фундаментальных проблем генетики, биотехнологии и физиологии растений.

Сказанное в большей степени относится к методу культивирования изолированных пыльников, основанного на использовании явления андрогенеза in vitro - процесса образования гаплоидного растения (спорофита) из микроспоры или клеток пыльцевого зерна - гаметофита высших растений (Guha, Maheshvari, 1964). Этот уникальный феномен связан с переключением генетической программы развития спорогенных клеток с обычного для них гаме-тофитного пути на принципиально иной - спорофитный путь развития. Смены поколений (спорофитного на гаметофитное), характерной для растений in vivo, не происходит, а производные спорогенных клеток - микроспоры и пыльцевые зерна ведут себя подобно зиготам ( Батыгина, 1978-1992; Горбунова и др. 1993). Поэтому андрогенез in vitro рассматривается как особая система размножения растений (Суханов, 1983), позволяющая ускоренно получать полностью гомозиготные растения-регенеранты при гомозиготизации гаплоидных растений, выращенных из микроспор гибридных форм в культуре изолировнных пыльников.

Культивирование изолированных пыльников основано на использовании явления прямого или непрямого андрогенеза in vitro (Vasil, Nitsch, 1975; Sangwan, Sangwan-Norrel, 1987). При прямом андрогенезе in vitro образование гаплоидного растения происходит за счет микроспор или клеток пыль-

7 цевого зерна, развивающихся в эмбриоиды. Прямой андрогенез in vitro связан с явлением эмбриоидогенеза как типа бесполого размножения растений (Batygina, 1990). В свою очередь, эмбриоидогенез рассматривается как путь морфогенеза в культуре пыльников (Batygina, 1984, 1986; Kudarov et al., 1990). При непрямом андрогенезе in vitro микроспоры или клетки пыльцевого зерна образуют недифференцированный каллус, который после переноса на среду, индуцирующую органогенез, дает начало растениям-регенерантам различной степени плоидности. Непрямой андрогенез in vitro связан с явлением гемморизогенеза как типа бесполого размножения растений (Batygina, 1990), в то же время, гемморизогенез (органогенез) рассматривается как путь морфогенеза в культуре пыльников (Kudarov et al., 1990). Следует подчеркнуть, что прямой эмбриоидогенез несомненно является более выгодным способом получения гаплоидов in vitro (Суханов, 1983; Шамров и др., 1988; Горбунова и др., 1988; Батыгина и др., 1992;), поскольку он не связан со сложным многоступенчатым процессом морфогенеза через каллус, требующим трудоемкой процедуры пассирования.

Использование в качестве объекта для данных исследований яровой мягкой пшеницы, имеющей огромное народнохозяйственное значение объясняется тем, что не разработаны высокоэффективные технологии массового получения гаплоидных растений злаков. Основная причина этого - методические и методологические трудности, связанные с исследованием и использованием андрогенеза in vitro у представителей именно этого семейства.

Так, одна из принципиальных проблем, стоящая перед исследователями - низкая продуктивность андрогенеза in vitro. Перетасовка условий культивирования, состава питательных сред, особенно их гормональных компонентов для яровой мягкой пшеницы не стала такой же продуктивной, как для культуры тканей двудольных (Sunderland, 1977; Heberle-Bors, 1983). Традиционные методы изучения фитогормонов и не позволяют решать эти проблемы, поэтому исследователям не доступны для изучения процессы фито-

8 гормональной регуляции андрогенеза in vitro. Существенным недочетом многих исследований, поэтому, является то, что изучается влияние того или иного воздействия на эксплант без учета эндогенных изменений в изолированном пыльнике. Так, одна из принципиальных проблем, стоящая перед исследователями - низкая продуктивность андрогенеза in vitro. Перетасовка условий культивирования, состава питательных сред, особенно их гормональных компонентов для яровой мягкой пшеницы не стала такой же продуктивной, как для культуры тканей двудольных (Sunderland, 1977; Heberle-Bors, 1983). Традиционные методы изучения фитогормонов и не позволяют решать эти проблемы, поэтому исследователям не доступны для изучения процессы фитогормональной регуляции андрогенеза in vitro. Существенным недочетом многих исследований, поэтому, является то, что изучается влияние того или иного воздействия на эксплант без учета эндогенных изменений в изолированном пыльнике.

Перспективы к преодолению перечисленных методических ограничений открывает использование метода твердофазного иммуноанализа, который повышает точность экспериментов за счет высокой специфичности отношений антител к фитогормонам.

Критическое отношение к гипотезе прямого андрогенеза in vitro из одиночной клетки высказывалось почти 30 лет назад (Homes et al.,1967; Tor-rey, 1967), что вполне естественно, так как из-за отсутствия детальных цито-эмбриологических данных о начальных этапах эмбриоидогенеза из одиночной изолированной клетки трудно говорить о прямом и организованном пути образования эмбриоида и сейчас. В настоящее время имеются разрозненные публикации о цитологических особенностях разных этапов андрогенеза in vitro у яровой мягкой пшеницы (Размологов и соавт., 1979; Shumann et al., 1986; Kruger et al., 1988; Barnabas et al., 1988; Higuchi, 1991).

Совершенно не разработаны подходы к унификации процесса культивирования изолированных пыльников яровой мягкой пшеницы, что приво-

9 дит к разночтению результатов культивирования. Поэтому невозможно сравнивать экспериментальные данные, полученные разными авторами, успешно работающими в данной области (Дьячук и соавт., 1986; Приходько, 1988; Barnabas et al., 1989; Foroughi-Wehr, et al., 1990; Loschenberger et al., 1992; Shimada et al., 1993; Henry et al., 1993; Горбунова 1993; Першина и соавт., 1993).

До настоящего времени открыт вопрос и об индукторах андрогенеза in vitro. Остается далекой от окончательного решения и ключевая проблема андрогенеза in vitro - механизм переключения генетической программы развития микроспор/клеток пыльцевого зерна с гаметофитного пути на спорофит-ный. Не исследованы вопросы: каковы предпосылки этого явления в условиях in vivo, каковы начальные этапы дифференциации микроспор на эмбрио-идогенез и каллусогенез и каковы эндогенные факторы, предопределяющие выбор различных путей морфогенеза. Поэтому можно предположить, что исследование молекулярно-генетических особенностей ответной реакции экс-планта на условия культивирования и баланса эндо- и экзогенных фитогормонов как в момент инокуляции экспланта в питательные среды, так и в процессе культивирования, являются решающими и для понимания диффереци-альных путей морфогенеза. Изучение этих вопросов может иметь принципиальное значение, так как, знание механизмов «переключения» генетических систем развития микроспор, могло бы приблизить к возможности управления процессом морфогенеза в культуре изолированных пыльников и решению фундаментальной проблемы современной биологии - проблемы морфогенеза.

Цель исследования заключалась в выявлении возможности дифференциальной экспрессии генов, ответственных за реализацию спорофитной генетической программы развития микроспор а также в изучении роли эндогенных фитогормонов пыльника в регуляции спорофитного пути в культуре изолированных пыльников яровой мягкой пшеницы.

10 В процессе реализации поставленной цели решались следующие задачи:

1. Изучение закономерностей нетрадиционной системы бесполого размножения в культуре изолированных пыльников.

2. Исследование генетической изменчивости морфогенных образований и андроклинных удвоенных гаплоидных (АДГ) растений на молекулярном, хромосомном и геномном уровнях.

3. Изучение характера связи между генетической и фенотипической изменчивостью АДГ форм.

4. Выявление эндогенных факторов, влияющих на андрогенез in vitro и изучение их роль.

5. Проведение цитологического мониторинга всего процесса культивирования изолированных пыльников, используя возможности светового (СМ) и электронного микроскопов разных типов: сканирущего (СЭМ) и трансмиссионного (ТЭМ).

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

6. Возможность реализации генетической системы гомофазного (спорофит -спорофит) пути развития микроспор в культуре изолированных пыльников яровой мягкой пшеницы, прямым доказательством которого является получение чистых линий исходных сортов в культуре изолированных пыльников.

7. Осуществление процесса переключения генетической программы развития микроспор с гаметофитного на спорофитный путь при экспрессии генов, участвующих в регуляции и функционировании этапов клеточного цикла.

8. Возможность создания в культуре изолированных пыльников различных клеточных систем с высоким мофогенным потенциалом: эмбриоидов и морфогенных каллусов. Формирование таких структур зависит от: фазы развития микроспор, эндогенного уровня фитогормонов в экспланте и концентрации 2,4-Д в питательной среде.

4. Возможность управления геномной изменчивостью с целью сохранения исходной плоидности ядер микроспор и формирование андроклинньгх удвоенных гаплоидных растений-регенерантов с нормальным набором хромосом. Это важный фактор культивирования изолированных пыльников такого сложного аллоплоида, какой является яровая мягкая пшеница.

5. Использование RAPD - ПЦР анализа амплифицированных фрагментов ДНК исходных и АДГ линий для молекулярно-генетического анализа генетической изменчивости при андрогенезе in vitro.

Научная новизна и практическая ценность работы состоит в проведенном впервые широком системном исследовании роли эндогенных и экзогенных факторов, детерминирующих спорофитный путь развития in vitro у яровой мягкой пшеницы.

Впервые изучены и являются приоритетными: синтез в ревертазной реакции кДНК, на основе мРНК экспланта, дифференциально экспрессирующей-ся в ответ на предобработку изолированных пыльников низкими положительными температурами.

Впервые экспериментально продемонстрирована зависимость дифференциальных путей морфогенеза (эмбриоидогенез и /или каллусогенез) у яровой мягкой пшеницы от концентрации эндогенных фитогормонов, и зависимости индукции эмбриоидогенеза от концентрации 2,4-Д в питательной среде, адекватной эндогенному уровню фитогормонов в экспланте.

Выявлены и описаны закономерности формирования клеточных структур с различной морфогенной способностью и проведен комплексный мониторинг всех ключевых моментов культивирования изолированных пыльников. Использование методов световой и электронной микроскопии в сочетании с твердофазным иммуноферментным анализом фитогормонов позволило описать особенности морфогенеза в культуре изолированных пыльников яровой

12 мягкой пшеницы и показать, что синхронность многих изученных факторов: фаза развития микроспоры, ее эндогенные характеристики (развитие ядра, наличие вакуолей), состояние стенок гнезда пыльников (наличие фиброзных утолщений в эндотеции) и концентрация эндогенных фитогормонов в пыльнике в момент инокуляции их на питательные среды, являются ключевыми для успешного осуществления прямого андрогенеза in vitro.

С помощью RAPD - ПЦР метода исследован характер наследования фрагментов ДНК у АДГ форм.

Исследована динамика изменения градиентов концентраций фитогормонов в замкнутой системе пыльник - питательная среда в течение 21 дня и изучен характер наследования признака «содержание АБК» у АДГ форм

Проведен сравнительный анализ альтернативных путей морфогенеза в культуре изолированных пыльников. Определены, конкретизированы и визуализированы фенотипические и цитологические маркеры, соответствующие оптимальной для андрогенеза in vitro фазе микроспорогенеза.

Унифицирована терминология, используемая для описания процессов, происходящих при культивировании изолированных пыльников.

Разработана технология прямого андрогенеза in vitro у яровой мягкой пшеницы, которая защищена тремя авторскими свидетельствами.

Получены андроклинные удвоенные гаплоидные растения и линии, характеризующиеся высокой продуктивностью, засухоустойчивостью и скороспелостью.

Реализация результатов исследования заключается в том, что технология культивирования изолированных пыльников яровой мягкой пшеницы внедрена в Башкирском НИИ земледелия и селекции полевых культур.

Андроклинные удвоенные гаплоидные гибридные линии, полученные в ходе проведения экспериментов в культуре изолированных пыльников испы-тываются в селекционных учреждениях Башкортостана.

Полученные теоретические и практические результаты активно исполь-

13 зуются при чтении курсов общей генетики с основами селекции, биотехнологии и сцецкурсов в Башкирском государственном педагогическом институте.

Работа выполнена на кафедре общей биологии Башкирского государственного педагогического института и в лаборатории генетики растений Института биохимии и генетики Уфимского Научного Центра РАН. Связь работы с крупными научными программами. За время выполнения работы получены гранты следующих фондов: ГНТП «Новейшие методы биоинженерии (1987-1993), «Приоритетные направления генетики (1989)», «Российского фонда фундаментальных исследований (1994-1995, 1999-2001)», Фонда «Государственная поддержка интеграции высшего образования и фундаментальной науки» (1997-2000 гг.).

Автор выражает сердечную благодарность чл-корр. РАН Бутенко Р.Г., проф., д.б.н. Шаминой З.Б. и проф., д.б.н. Батыгиной Т.Б за инициацию данных исследований.

Глубокую признательность диссертант выражает проф., д.б.н. Круп-нову В.А., проф., д.б.н. .Вахитову В.А., к.б.н. Внучковой В.А. - к сожалению, скоропостижно ушедшей от нас, за постоянное внимание к работе. Также благодарит коллег, которые принимали участие в проведении экспериментов и обсуждении результатов: д.б.н. Кудоярову Г.Р., к.б.н. Круг-лову Н.Н., к.б.н. Геращенкова Г.А., к.б.н. Абрамова С.Н., Надольскую С.Н., за неоценимую помощь при оформлении работы - к.б.н. Богданова М.Р., за методическую помощь при сканирующем электронном микроско-пировании - к.б.н. Г.Е. Титову.

14 1. Обзор литературы

1.1. Генетические предпосылки спорофптного пути развития микроспор in vitro у злаков

Со времени открытия андрогенеза in vitro у пасленовых английскими учеными S.Guha, S.Maheshwari (1964), прошло околоЗб лет. С этого момента началось триумфальное шествие этого уникального феномена по исследовательским программам, в результате выполнения которых обнаруживались возможности спорофитного пути развития в культуре изолированных пыльников у многих видов растений. И с того момента, когда D.Clapham (1971, 1973) получил гаплоидные растения ячменя из культивируемых пыльников, исследователи нацелены, главным образом, на увеличение выхода числа гаплоидных регенерантов с целью использования их для получения гомозиготных дигаплоидных растений в количестве, достаточном для проведения, как фундаментальных исследований, так и выполнения селекционно-генетических программ, так как развитие новых, нетрадиционных методов, позволяющих выявить потенциальные возможности растительного организма и вместе с тем, в более короткие сроки получать новые линии и сорта -важная задача современных генетико-селекционных и биотехнологических исследований.

К настоящему времени накоплен значительный фактический материал по различным аспектам изучения этого удивительного явления у представителей различных семейств покрытосеменных растений.

Тем не менее, несмотря на обширные фактологические данные, открытыми остаются вопросы: каковы индукторы и триггеры андрогенеза in vitro; каков механизм переключения развития микроспоры (клетки) на иной путь, не предусмотренный природой; каковы предпосылки этого явления в естественных условиях. Остается далекой от окончательного решения и ключевая

15 проблема андрогенеза in vitro - детерминация спорофитного пути развития

микроспор/клеток пыльцевого зерна. Решение этой проблемы имеет принципиальное значение, так как, зная механизм детерминации, можно ставить вопрос об управлении процессом андрогенеза in vitro и, кроме того, приблизиться к решению фундаментальной проблемы современной биологии - проблемы морфогенеза.

Хорошо изучена определяющая роль генотипа в реализации андроге-нетических способностей пыльника in vitro. Многие исследователи указывают на то, что разные генотипы дают различный выход регенерантов при культивировании пыльников на изучаемой среде (Тураев, Шамина, 1986; Liang et. al., 1987; Koinuma et. al., 1990; Горбунова, 1993, Горбунова, Кругло-ва, 1994; Нгуен и соавт.,1991).

Достоверно установлено, что основным фактором, детерминирующим переключение развития микроспор/клеток пыльцевого зерна на путь андрогенеза в условиях in vitro, является генотип донорного растения и указывается, что некоторые генотипы или совсем неотзывчивы (Koinumaet al., 1990), или проявляют небольшую, в пределах сотой доли процента, способность к эмбриоидогенезу (Ни, 1986), в то время как другие формы дают более 70 % эмбриоидов и каллусов к числу инокулированных пыльников (Горбунова и соавт., 1987).

Согласно литературным данным, способность к формированию эмбриоидов и каллусов находится под контролем ядерных генов (Bullock et al., 1982). Предполагается, что способность к андроклинии определяется такими генотипическими особенностями донорных растений, как уровень плоидно-сти, степень гомо - и гетерозиготности, гибридности, наличия цитоплазмати-ческих генов, обусловливающих стерильность пыльцевых зерен, и даже типа онтогенеза (Hlasnicova, 1977; Picard et al, 1978; Bullock et al., 1982; Hu, 1986; Горбунова и соавт., 1987). Предполагается также, что способность к андроклинии наследуется и может быть передана путем гибридизации. Показано,

что высокая способность к андроклинии одной из родительских форм передается гибриду первого поколения (Bullock et al., 1982). Однако в литературе сосуществуют два противоположных подхода к возможности передачи генов, ответственных за «андроклинию», другим линиям или сортам при скрещиваниях. По мнению одних исследователей, в пользу возможности отбора генотипов с высокой способностью к андроклинии свидетельствует тот факт, что при повторном культивировании пыльников диплоидных форм, полученных из андроклинных эмбриоидов путем удвоения числа хромосом или возникших спонтанно, наблюдается увеличение частоты андроклинии по сравнению с исходными формами, причем, считается, что эта способность сохраняется в ряду поколений (Bullock et al., 1982). Однако согласно другой точке зрения, частота эмбриоидогенеза у дигаплоидов андроклинного происхождения ниже, чем у исходных форм (Ни, 1986). Более того, при скрещивании сортов с дигаплоидными формами наблюдается даже снижение эффективности каллусогенеза и регенерационной способности гибридных форм (Karsai et al, 1991).

Установлено также, что гетерозиготный исходный материал более отзывчив к условиям на культивирования чем гомозиготный. При гомозигот-ности используемых доноров картина несколько меняется. Результаты, приведенные Н.Ни (1986), показывают, что при рекультивировании гомозиготные линии, полученные из пыльников растений Fi (Jinghong 5 х Xiaoyan) с высоким гетерозисным эффектом показали неменделевское расщепление признаков в потомстве, т.е. наблюдалось три класса расщепления с различной степенью частоты индукции андроклинии: выше, чем у родительских форм, ниже, чем у них и промежуточный тип. Но все типы реакции были ниже, чем у растений гибрида Fi. Автор объясняет данное явление влиянием на экспрессию гибридной силы генотипа физиологических, а не генетических факторов.

Имеются разноречивые данные об отношении генотипов к культивированию. Отмечены, например, случаи, когда способность к андрогенезу in vitro у гибридных растений первого поколения была значительно выше, чем у родительских форм (Ни, 1986). Результаты, полученные этим автором, свидетельствуют о том, что гибридная сила в некоторых случаях хорошо выражена. Так, при использовании сортов Xiaoyan 759 и Ketong 58 в качестве одной из родительских форм частота индукции каллусов и зеленых растений у гибридов Fj значительно выше, чем у родительских форм. По частоте индукции морфогенных образований между реципрокными комбинациями различий не обнаружено (Bullock et al., 1982; Ни, 1986). Интересные результаты получены M.Lazar et al. (1984) при изучении реципрокных гибридов между четырьмя сортами яровой пшеницы. Ими показано, что влияние генов ядра на способность к образованию каллусов, эмбриоидов и регенерацию растений выражается аддитивными доминантными генетическими взаимодействиями. Однако, по их данным, может иметь место и матроклиния. Она проявилась у реципрокных гибридов между сортами Chris, Walder и Fielder. В случае, когда первый сорт является материнским компонентом скрещивания, различия по изучаемому признаку значительны. И если это так, то есть возможность количественной оценки степени генетической детерминации признака «степень морфогенеза in vitro» в культуре пыльников.

Известно также мнение D.Kudirka с соавт. (1986), которые подтверждают, что способность к спорофитному типу развития может наследоваться и что способность к андроклинии может передаваться через ядра быстрее, чем через цитоплазматические гены.

Так, M.A.A.Miah et all., (1985), исследовали возможность наследования способности к каллусообразованию у пыльников разных сортов риса. В ди-аллельных скрещиваниях использовали четыре сорта с различной способностью к каллусогенезу. Анализ 12 гибридных комбинаций показал, что способность к каллусообразованию наследуется как простой рецессивный при-

18 знак, обусловленный отдельным блоком генов. Установлено, что в определении данного признака аддитивные эффекты неаллельных генов преобладают над эффектом доминирования. Имеются факты, показывающие, что частота андроклинии зависит от степени гетерозиготности, а также от гибридности исходного материала. В культуре пыльников гибридов табака частота эм-бриоидогенеза была выше, чем у родительских форм. Это связано, по мнению автора, с эффектом гетерозиса (Hlasnikova, 1977). У яровой мягкой пшеницы также установлено, что самоопыленные линии F₅-F₆ характеризовались меньшей частотой возникновения каллусов и эмбриоидов (0,14 %), чем гибриды Fi (1,41%) и потомство F₂ (0,45-1,16%) (Pikard, 1978). Ими же показано, что линии с ЦМС на основе цитоплазмы Triticum timopheevi обладают большей способностью к образованию каллусов и эмбриоидов (0,65%), чем имеющие обычную цитоплазму (0,27%).

Систематическое изучение различных сортов и гомозиготных линий пшеницы показало, что не все генотипы одинаково реагируют на воздействия условий культивирования (Дьячук, 1989; Внучкова и соавт., 1986; Лукьянюк, Игнатова, 1986; Loschenberger F, Heberle-Bors, 1992; Shimadaetal., 1993).

Таким образом, ясно, что генотип - важнейший лимитирующий фактор при культивировании пыльников. Этот вывод относится не только к модели получения растений-регенерантов табака (Hlasnicova, 1977; Touraev et al., 1996 a,b), но также и пшеницы (Picard, de Buyser, 1973, 1975), риса (Guha -Mukherjee, 1973), ячменя (Forough-Wehr et al., 1976; Waul et al., 1976), ржи (Wenzel et al., 1975, 1977), картофеля (Jacobson and Sopory, 1978), петунии (Mitchell et al., 1980), хлопчатника (Yistra et al., 1992) и многих других видов. Для того чтобы снять ограничения, которые накладывает генотип, необходимо знать, как генотип контролирует образование пыльцевого растения. По мнению Е. Heberle-Bors (1983), образование растения пыльцевого происхождения включает две различные фазы. Во время первой фазы в растении in situ образуются так называемые «Р-зерна» (премейотические) - эмбриоген-

19 ные микроспоры и/или пыльцевые зерна. В течение второй фазы, протекающей in vitro, эти Р-зерна могут развиваться в эмбриоиды и растеньица на соответствующей культуральной среде.

По данным Е. Heberle-Bors (1984), генотип оказывает влияние на образование Р-зерен различными способами. Во-первых, генотип регулирует частоту образования Р-зерен при нормальных условиях. Во-вторых, генотип устанавливает тип реагирования на условия среды обитания (влияние длины дня, температуры, влажности и т. д.). И, в - третьих, генотип определяет степень влияния факторов среды на частоту образования Р-зерен. Таким образом, по мнению Е. Heberle-Bors (1984), можно выделить 3 основных направления влияния генотипа: уровень образования Р-зерен in situ, образование ингибитора спорофитного деления в стенке пыльника и время созревания Р-зерен. Как полагает автор, наиболее жестко генетически детерминирован признак «число Р-зерен у генотипов». В то же время, два других направления влияния генотипа могут оказаться признаками с широкой «нормой реакции» и быть управляемыми. Это значит, что их влияние можно элиминировать подбором адекватных условий среды.

В то же время, показано, что Р-зерна функционально стерильны (Heberle-Bors, 1982 а, в; 1984), и множество пыльцевых зерен, погибающих в течение первых нескольких часов культивирования, могут состоять только из них. Причина их гибели, по мнению Е. Heberle-Bors (1984), состоит в присутствии ингибитора спорофитного деления в тканях гнезда пыльников. С другой стороны, культивирование микроспор Nicotiana tabacum L., освобожденных от тканей пыльника, не привело к существенному увеличению продуктивности морфогенеза (Heberle-Bors, 1984).

Таким образом, считается, что образование Р-зерен строго ограничено и регламентировано генотипом (Heberle-Bors, 1984). Микроспоры и пыльцевые зерна, способные образовывать эмбриоиды, предопределены условиями роста и развития растений еще до начала культивирования (Homer, Mott, 1979, Heberle-Bors, Reinert, 1980, 1981; Heberle-Bors,

20 1982 а). Предложен метод отбора и определения частоты Р-зерен. По мнению Е. Heberle-Bors (1984) скрининг их доступен и рекомендуется для использования в селекционной практике в следующем виде: суспензию микроспор и пыльцевых зерен фракционировать в градиенте сахарозы в Percoll, при этом Р-зерна элюируются как легкая фракция, а нормальные (N) зерна располагаются в более плотных слоях (Heberle-Bors, Reinert, 1980). Для представителей семейства Solanaceae, особенно для таких родов, как Datura и Nicotiana, показано существование Р-зерен в культивируемых пыльниках. Что же касается существования Р-зерен у семейства Роасеае, прямых экспериментальных доказательств этому в научной литературе мы не обнаружили, кроме работы S.Gregoire at al. (1989) в которой имеются косвенные характеристики таких микроспор, определенные по степени окрашиваемо-сти микроспор ацетокармином.

В более поздних исследованиях Е. Heberle-Bors (1985) конкретизировал назначение Р-зерен как микроспор, содержащих большое количество спорофитной информации и отличающихся морфологически от нормальных микроспор, в которых имеется только гаметофитная программа развития. На этом основании им высказано предположение, что растения надо различать по их способности «переносить» спорофитную информацию в гаметофитную стадию. Автор этой теории приводит данные о наличии двух типов микроспор у некоторых видов: «Р»-тип, отличающийся морфологически от нормальных микроспор и содержащий большое количество спорофитной информации, способный к эмбриоидогенезу in vitro, и «№>-тип - нормальный тип пыльцевых зерен (микроспор), способных развиваться по гаметофитно-му пути.

Если же вышеописанные события происходят, то, как и когда in vivo осуществляются эти процессы и чем они обусловлены? Поиск ответов на эти вопросы привел к следующим размышлениям.

Начнем с того, что при исследовании биохимии и физиологии мейоза в пыльниках растений H.Dickinson (1987) обратил внимание на особый цикл метаболизма как информационной, так и рибосомальной РНК. Его экспери-

21 ментами показано, что после распада тетрады в цитоплазме микроспоры быстро уменьшается количество тотальной постмейотической спорофитной РНК. Не ясно, чем обусловлено изменение концентрации РНК: остановкой ли синтеза м- и р-РНК или активацией действия гидролаз. Так или иначе, происходит элиминация как информационной, так и рибосомальной РНК спорофита в цитоплазме микроспоры и этим обеспечивается «чистая цитоплазма» для быстрой гаметофитной дифференциации. Во время спорогенеза также поразительно быстро уменьшается число рибосом. Это явление показано у папоротника мужского и считается общепринятым для всех высших растений (Sheffield, Bell, 1979). Результатом исчезновения этих компонентов клетки является ослабление синтеза клеточных белков.

Однако некоторая спорофитная информация сохраняется и при гаме-тофитном пути развития пыльцевых зерен. Так, например, строение и особенности нэкзины II (внутреннего слоя экзины) у представителей семейства Liliaceae контролируется спорофитом и синтезируется в конце стадии тетрады (Dickinson, 1987).

В то же время, не представляется возможным точно определить момент начала экспрессии гаметофитной программы. Как предполагает H.Dickinson (1987), рибосомы, несущие гаметофитную программу, по-видимому, синтезируются на ядрышковых организаторах хромосом еще в профазе мейоза II. Однако остается тайной, когда образуется первая гамето-фитная мессенджер-РНК. Что же касается спорофитной мессенджер - РНК, то высказано предположение, что часть ее остается зарезервированной в ин-вагинизированных складках оболочки ядра микроспоры (Dickinson, 1987). И если это так, то какие дальнейшие события должны произойти, чтобы она вышла из ядра и начала транслироваться?

Итак, вышеприведенные данные показывают, что после распада тетрады в микроспоре идут активные действия по «очистке» цитоплазмы от спорофитной информации. В то же время, в цитоплазме еще нет и гаметофитной

22 информации. Возможно, культивирование микроспор на этой стадии развития может спасти часть спорофитной информации и таким образом способствовать массовому получению гаплоидов. Одноко, как показывают эксперименты, инокуляция пыльников на этой ранней стадии развития микроспор на культуральные среды неэффективна, т.к. микроспоры не вступают на путь морфогенеза и быстро дегенерируют, даже не приступив к делению (Горбунова, 1993). С другой стороны, слишком поздняя инокуляция пыльников, после первого неравного митоза, полностью блокирует независимость генеративной клетки (Sunderland et al., 1979).

Кроме вышеописанных Р-зерен, компетентной считается также S-пыльца (Sunderland, 1973; 1974). Строго говоря, вопросы, касающиеся Р-, S-, Е-зерен, нужно и рассматривать как проявление пыльцевого полиморфизма (Горбунова и соавт., 1993). Однако мы сочли нужным разграничить их и обсудить эти проблемы в данной главе в связи с проблемой генетической детерминации особых, морфогенетически компетентных образований.

Впервые о S-зернах (small) было сообщено La Cour (1949) при изучении формы и размеров микроспор у Tradescantia bracteata. Автор обнаружил в пыльниках этого объекта небольшую популяцию мелких пыльцевых зерен с двумя равными ядрами - В-тип (два ядра вегетативного типа). Их происхождение он объяснил неравным распределением цитоплазмы в результате смещения оси деления в мейозе П. Кроме того, известна S-пыльца и другого, А-типа (Horner, Street, 1978). Пыльцевые зерна А-типа имеют отчетливо различимые генеративную и вегетативную клетки. Характерными особенностями всех S-зерен являются: их меньший размер по сравнению с нормальными пыльцевыми зернами и наличие слабоокрашиваемой цитоплазмы при яркой окраске ядер (Horner, Street, 1978). Показано, что основным фенотипическим критерием для определения фазы микроспорогенеза и микрогаметогенеза у Nicotiana tabacum служит размер бутонов (Sunderland, Wick, 1971, Yistra et al., 1992). Так, например, у сорта Burley бутоны длиной 5-7 мм содержали

23 тетрады, а при длине бутонов в 8-14 мм в них развивались микроспоры; митоз происходил при длине бутонов в 14-15 мм (Horner, Street, 1978). Диморфизм, точнее, полиморфизм пыльцевых зерен (Батыгина, 1987) в этих экспериментах проявился именно на стадии образования ранних пыльцевых зерен. Продуктивность эмбриоидогенеза была выше при культивировании пыльников, содержащих пыльцевые зерна с двумя равными клетками В-типа (Horner, Street, 1978). Кроме того, в этой популяции микроспор отмечена и S-пыльца А-типа, описанная ранее N. Sunderland (1973). Авторы (Horner, Street, 1978) доказывают, что S-пыльца обоих типов появляется в условиях культивирования, причем наличие S-зерен В-типа, с равными по размеру и окраске ядрами - явление редкое. Это утверждение авторов согласуется с экспериментальными данными, полученными ранее N. Sunderland (1973). Увеличение размеров S-зерен при культивировании было незначительным, хотя другие пыльцевые зерна в таких условиях несколько увеличивались в размерах (Horner, Street, 1978).

Таким образом, из анализа литературы становится очевидным факт существования у Nicotiana tabacum S-зерен, которые более всего дифференцируются при культивировании, хотя, по-видимому, они появляются на стадии микроспор. Отмечается также, что не все S-зерна морфогенны, большая их часть дегенерирует при культивировании наряду с гибелью N-зерен (Horner, Street, 1978). Полиморфизм пыльцевых зерен, наблюдаемый в культивируемых пыльниках, детально описан у другого сорта табака - White Burley (Sunderland, Wick, 1971). Особенности полиморфных пыльцевых зерен этого же сорта табака изучены как фотометрически (Bhojwani, Dunwell, Sunderland, 1973), так и электронномикроскопически (Dunwell, Sunderland, 1974a,b). Полиморфизм у зрелых пыльцевых зерен описан и в пыльниках Paeonia: около 20 % пыльцевых зерен в популяции были «карликовыми», схожими с S-зернами (Sunderland, 1977). Подобный случай описан у ячменя сорта Sabarlis (Sunderland, 1974). Этот сорт детально изучен в культуре тка-

24 ней D. Clapham (1971, 1973). У другого сорта ячменя Акка (Dale, 1975) и у

сорта табака Burley большая часть S-зерен наиболее отчетливо проявляла себя на средней двуклеточной стадии развития пыльцевых зерен (Homer, Street, 1978). Инокуляция таких пыльцевых зерен приводила к морфогенезу in vitro. Однако каллусогенез инициировался также и при культивировании пыльников, находящихся на стадии микроспор (Dale, 1975). Автор обнаружил прямую корреляцию между числом образовавшихся каллусов и количеством S-зерен, присутствовавших в зрелом пыльнике тех же растений. Он предположил, что S-зерна у ячменя возникают так же, как и у табака, в силу неравномерного распределения цитоплазмы в мейозе II материнских клеток и что степень этой неравномерности детерминирует образование S-зерен либо А-типа, либо В-типа (Dale, 1975).

В последующих экспериментах и на других объектах показано, что количество S-зерен в большей степени регулируется условиями развития пыльников и, в особенности, на протяжении эквационного мейотического деления (Horner, Street, 1978).

Если это так и полиморфизм является стабильным признаком растений, тогда этот критерий можно было бы использовать как индикатор при проведении биотехнологических исследований у высших растений. Дело остается за малым - знать, какие причины вызывают неравное распределение цитоплазмы и искусственно получать такие аномалии. На практике же далеко не все так просто. N. Sunderland (1974), работая с удвоенными дигаплоид-ными гомозиготными растениями табака, не обнаружил единообразного ответа в культуре пыльников. Это значит, что полиморфизм микроспор и пыльцевых зерен является следствием не генетических процессов, а результатом прцессов, сопутствующих культивированию пыльников, и/или влияния каких-то других факторов. Подтверждением сказанному служит эксперимент, проведенный R. De Fossard (1974). Автор показал, что пыльники и пыльцевые зерна гомозиготных растений биотипов любых видов, не содер-

25 жащие дефектных и летальных генов, влияющих на развитие генеративной

сферы, теоретически не различаются. Их генотипы почти идентичны. Следовательно, при культивировании их пыльников ответ должен быть также идентичным. Однако этого не происходит. Культивирование изолированных пыльников вносит очень большой диссонанс. Ответная реакция идентичных генотипов при культивировании их пыльников в этих экспериментах различалась по продуктивности каллусогенеза от 0 до 1,2 % (De Fossard, 1974).

В литературе, посвященной андрогенезу in vitro у злаковых, очень много внимания уделяется особенностям культивирования линий, содержащих цитоплазматические факторы, приводящие к стерильности пыльцы, т.е., не только ядерные, но и цитоплазматические гены играют роль в детерминации андрогенеза in vitro (Picard et al., 1978; Внучкова, 1990). Доказательств генетической детерминированности признака «цитоплазматическая мужская стерильность» накоплено достаточно. Прекрасные работы, анализирующие все аспекты ЦМС, написаны А.Н.Палиловой (1969) и В.А.Крупновым (1973). Цитоплазматические характеристики ЦМС у злаков описаны в методическом пособии, подготовленном Л.И.Орел (1974). Цитоплазматические и генетические особенности проявления ЦМС у районированных на Южном Урале сортов яровой мягкой пшеницы изучены также нами (Ильина и соавт., 1976). Что касается морфогенеза in vitro у злаков, то существует мнение о том, что линии с ЦМС, полученные на основе цитоплазмы Triticum timopheevi, обладают большой способностью к образованию каллусов и эмбриоидов (Picard et al., 1973, 1978; Sagi et al.,1989). По их данным, продуктивность эуплоид-ной формы сорта Champlain с обычной цитоплазмой была равна 0,27 % , а формы с ЦМС - 0,65 %. Как видим, разница между этими данными небольшая.

В то же время, есть сведения о том, что признак ЦМС не приводит к увеличению частоты каллусогенеза у линий, полученных на основе и Triticum timopheevi и Aegilops speltoides (Becraft, Taylor, 1989; Горбунова,

26 1993). По мнению авторов, высокая андрогенетическая компетенция у двух

линий ЦМС в культуре пыльников, которая наблюдалась в опытах E.Heberle-Bors, W.Odenbach (1985), могла быть обусловлена благоприятными ядерно-плазменными взаимодействиями, но не ЦМС как таковой (per se).

1.2. Влияние условий культивирования на эмбриоидогенез

в культуре изолированных пыльников яровой мягкой пшеницы

В многочисленных исследованиях выявлены факторы, способствующие увеличению доли морфогенных микроспор в условиях in vivo и in vitro. Важнейшие из них - генотип донорных растений, условия выращивания до-норных растений (температурный и световой режимы), стрессовые воздействия на донорные растения в условиях in vivo или на изолированные пыльники в условиях in vitro, обработка донорных растений гаметоцидами, состав питательной среды для культивирования пыльников (Heberle-Bors, Reinert, 1981; Rashid, Reinert, 1981a,b,c; Heberle-Bors, 1983; Лукьянюк, Игнатова, 1986; Ouyang, 1986; Hu, Huang, 1987; Sangwan, Sangwan-Norreel, 1987; Внуч-кова, Чеботарева, 1990; Touraev et al., 1996 a,b,c) и многие другие условия.

Как известно, частота проявления андроклинии у разных сортов зависит как от внутренних - генотипических и эпигенетических условий, о которых говорилось выше, так и от внешних, паратипических. К паратипическим предпосылкам относятся: сезон года выращивания растений, состав питательной среды, температурные воздействия до и после инокуляции пыльников на питательные среды, фотопериод и длина волны освещаемого света при использовании исскуственного освещения. Для увеличения выхода гаплоидных растений используют различные типы воздействий на донорные растения, как в условиях вегетации, так и в условиях культивирования. Наиболее существенными и продуктивными являются следующие факторы: центрифугирование колосьев, облучение их %-лучами, обработка гормонами и

27 воздействие на колосья пониженными положительными температурами. Последнее воздействие дало наибольший положительный эффект при эмбриои-догенезе в культуре изолированных пыльников и в силу этого, включается теперь как обязательный компонент технологии культивирования изолированных пыльников яровой мягкой пшеницы.

По мнению многих исследователей, воздействие низкими положительными температурами (3-7С) на изолированные соцветия донорных растений в течение 7-9 суток до инокуляции пыльников - принципиально важный момент в индукции андрогенеза in vitro у злаков. Однако единое мнение о механизмах индуцирующего действия холода в литературе отсутствует. Так, Сандерлэнд и соавт. (Sunderland et al, 1975) установили, что у ячменя низкотемпературный стресс способствует образованию большего, по сравнению с контролем, количества многоклеточных структур, дающих начало андроген-ным новообразованиям. При этом оказываются затронутыми все пути образования таких структур, ни одному из них не отдается предпочтения. Эти данные подтверждаются исследованием влияния холодовой предобработки на частоту индукции каллуса в культуре пыльников риса (Qu, Chen, 1983; Vasil, 1980), пшеницы (Wei, 1982; Lazar et al., 1985), тритикале (Schumann, 1986). Исследователями показано, что холодовая предобработка колосьев пшеницы способствует сохранению жизнеспособности эмбриогенных микроспор за счет снижения интенсивности дыхания пыльников (Heberle-Bops, Odenbach, 1985; Ouyang Jun-Wen, 1986).

Как полагает Суханов (1983), в данном случае устанавливается синхронность в развитии микроспор и пыльцевых зерен внутри одного пыльника и между пыльниками различных цветков одного колоска. Высказано предположение, что холодовая предобработка вызывает реориентацию веретена деления при первом митозе, что приводит к формированию микроспор с двумя равными ядрами - такие микроспоры обладают большим эмбрио-генным потенциалом (Nitsch, 1972). По данным Рэшида и Рейнерта (Rashid, Reinert, 1981a,b,c), эмбриоидогенные пыльцевые зерна табака отличаются от гаметофитных своей

28 недодифференцированностью; вероятно, под влиянием холода подавляются процессы

нормальной дифференциации пыльцевых зерен, что ведет к увеличению их эмбриоидо-генного потенциала. Высказано также предположение, что стрессовая холодовая предобработка приводит к подавлению гаметофитной транскрипции в микроспорах, стимулирует изменения в уровне эндогенных гормонов и в общей метаболической активности микроспор (Sunderland, 1982). Заслуживает внимания гипотеза, согласно которой действию холода приписывается либо выключение генов, либо ингибирование функции генных продуктов, ответственных за развитие микроспор по гаметофитному пути, что способствует переключению микроспор на спорофитный путь развития (Chen et al., 1986). Детальное изучение влияния предобработки холодом на культуру пыльников риса показало, что положительный эффект в данном случае связан с более длительным сохранением жизнеспособности стенки гнезда пыльников и взаимосвязей стенки с микроспорами, задержкой процесса дегенерации микроспор и пыльцевьк зерен, увеличением числа многоядерных и многоклеточных структур (Fang et al., 1985).

Известно также мнение исследователей о том, что нет необходимости низкотемпературной предобработки пыльников перед культивированием на искусственных питательных средах (Мс Gregor, 1990).

Кроме холода, эффективным фактором, влияющим на эмбриоидогенез в культуре изолированных пыльников, является воздействие на донорные растения гаметоцидами, вызывающими стерильность пыльцы на определенных фазах онтогенеза. Так, показано, что обработка пыльников донорных растений гаметоцидами (Picard et al., 1987; Внучкова и совт., 1990; Schmid et al., 1986а) или добавление их в питательную среду в сочетании с низкими концентрациями 2,4-Д (Schmid et al., 1986b), повышают продуктивность эм-бриоидогенеза in vitro у яровой пшеницы.

Только стерильное пыльцевое зерно и/или микроспора, по мнению некоторых исследователей, может вступить на путь морфогенеза в культуре изолированных пыльников. Хотя имеются многочисленные данные, проти-

29 воречащие этим высказываниям, и что аномальная пыльца не является единственным источником андрогенеза (Не Ding-Gong, Ouyang Jim - Wen, 1985).

Физиологические условия культивирования также играют важную роль в индукции и развитии интактных растений из микроспор и/или пыльцевых зерен. С улучшением состава питательных сред выход зеленых растений в культуре пыльников пшеницы увеличился с 0,7 до 5 %. В отдельных случаях этот показатель достигал 30%. У сорта яровой мягкой пшеницы Сіапо в оптимальных условиях культивирования исследователи получали до 70 зеленых растений на 100 пыльников (Ни, 1985).

Важный шаг в этом направлении был сделан при попытке выделить наиболее важные компоненты питательной среды. Эти опыты показали положительной влияние увеличения кощентрации нитратного и уменьшение аммонийного азота. На этой основе были разработаны различные варианты азотных сред, из которых наиболее оптимальными для культивировани пыльников риса, пшеницы, тритикале и других злаков оказалась среда N₆ (Chu,Weng,1985).

Значительный прогресс при культивировании изолированных пыльников пшеницы был достигнут благодаря разработанным в Китае различным вариантам питательных сред с добавлением картофельного экстракта. Наибольшую популярность приобрели варианты Potato I и Potato П. Среда Potato II превосходит N6 по частоте формирования каллуса, a Potato І по частоте индукции зеденых растений (Chuang, Quang, 1978).

Картофельный экстракт (действующее начало) может частично заменяться глута-мином в концентрации 200 мг/л в питательной среде Potato Л (Zhang, et al., 1987).

Изучалось влияние разных по составу углеводов (Chi et al., 1990) и консистенции питательных сред (Sunderland, Roberts, 1977; Wei, 1982; Henry, Buyser, 1981) на выход андрогенных структур в культуре изолированных пыльников злаков. Однако использование жидкой питательной среды отрицательно влияло на выход зеленых растений-регенерантов (Chen et al., 1980), поэтому есть рекомендации прекультивировать пыльники сначала на агаро-

вой среде 14 дней (Henry, Buyser, 1981), затем продолжить культивирование на жидкой питательной среде. Это требование неожиданно получило объяснение в работах К. Aruga и Т. Nakajma (1985b), показавших роль стенок пыльника в эмбриоидогенезе в культуре изолированных пыльников. Оказалось, что такие аминокислоты, как глутамин и аспарагин, необходимые для образования эмбриоидов, поступают из стенок пыльника и только на восьмой день культивирования, когда стенки пыльника деградируют, начинается поступление к микроспорам Сахаров и других веществ из питательной среды. До этого времени эти вещества поступают к ним из стенок пыльника.

В работе Touraev et al. (1996, с) показано, что питательные среды, содержащие сахарозу, оказывались менее эффективными для индукции эм-бриоидогенеза при 25 С, а при 33 С даже в присутствии сахарозы более 50% микроспор табака приступали к морфогенезу.

Есть сведения о повышении частоты индукции эмбриоидов в 2-Ю раз на жидкой питательной среде при замене сахарозы 0,21 М глюкозой (Chi et al., 1990).

Немаловажную роль для успеха культивирования изолированных пыльников играет подбор видоспецифического варианта питательной среды. Он должены содержать макро- и микросоли, углеводы, аминокислоты, фито-гормоны, различные экстракты и витамины (Бутенко, 1964; Калинин и совт., 1980; Шамина, 1981). Подробный анализ опубликованных работ, касающихся состава питательных сред, приведен в работе Т.И.Дьячук и соавт. (1989).

К числу факторов, влияющих на продуктивность эмбриоидогенеза in vitro, относится, по мнению T.Ouyang et al. (1983), повышение температуры культивирования в первые дни после инокуляции пыльников на питательные среды до 32-34 С. Отмечается успешное культивирование изолированных пыльников и микроспор, если к температурному шоку добавляется голодание культуры в течение 6 дней (Aruga et al., 1985а; Touraev et al, 1996a).

Таким образом, на индукцию эмбриоидов и растений благотворно влияют следующие факторы:

1) содержание экзогенной 2,4-Д в пределах 0,25 мг/л (Суханов, 1983), 1-5 мг/л (Xu et al.,

1981) и даже при концентрации 5,0; 10,9; 20,0 мг/л 2,4-Д не выявлено ингибирующего эффекта ауксина на образование каллусов (Raghavan, 1978);

2. определенные типы органических добавок, такие, как мио-инозитол (100-1000 мг/л), глутамин и кондиционирование питательной среды различными экстрактами, а также, прекультивирование пыльников (Xu et al., 1981);

3. для культуры пыльников пшеницы требуются высокие концентрации сахарозы, которая не только регулирует осмотическое давление среды, но и является лучшим источником углерода. Как показано, для культивирования пыльников пшеницы оптимальной концентрацией сахарозы является 7-10% (Dunwell, 1985a,b) или 9% (Buyzer, Henry, 1986). Эта концентрация благоприятна не только для индукции эмбриоидогенеза, но и для последующей регенерации растений.

4. различные комбинации Сахаров, в частности, глюкозы с сахарозой (Као, 1981).

5. культивирование изолированных пыльников при высокой температуре (32С) в первые семь дней, а затем перевод их на 27 С (Ouyang et al., 1983)

6. Перенос пыльников на свежий субстрат после 12 дней культивирования (Andersen et al., 1987).

Имеются публикации о взаимодействиях генотип х условия произрастания (Lazar et al., 1984, Andersen et al.,1987), генотип x температура выращивания растений (Heberle-Bors et al., 1980), фотопериода и интенсивности света при выращивании донорных растений (Vasil, 1980; Heberle - Bors, Reinert, 1981).

1.3. Цитологические особенности эмбриоидогенеза in vitro у яровой мягкой пшеницы

Многочисленные исследования свидетельствуют о том, что благоприятная фаза развития микроспор и пыльцевых зерен (и, естественно, благо-

32 приятный период в развитии пыльника в целом) во время инокуляции - один

из основных факторов, определяющих успешное культивирование изолированных пыльников как злаков, так и представителей других семейств. Микроспоры и пыльцевые зерна реагируют на условия культивирования только в пределах ограниченного промежутка времени.

В связи с этим, необходимо коснуться вопроса о периодизации развития пыльника как сложной интегрированной системы, все элементы которой (а именно - ткани стенки гнезда и спорогенная ткань) развиваются взаимосвязанно и сопряженно. В развитии пыльника различают премейотический, мейотический и постмейотический критические периоды (Резникова,1983,1984; Батыгана, 1987). Как правило, исследователи культивируют изолированные пыльники постмейотического периода, содержащие микроспоры той или иной фазы развития. Однако авторы абсолютного большинства работ ограничиваются указанием лишь на стадию «микроспора», не конкретизируя фазу ее развития. Деление же на фазы учитывать совершенно необходимо, так как игноруруя их и говоря лишь о стадии микроспоры, без ее детализации, исследователь зачастую приходит к невозможности повторить эксперимент в точности. Кроме того, как в отечественной, так и в зарубежной литературе употребляются термины типа «средняя одноядерная стадия микроспоры» и «поздняя одноядерная стадия микроспоры». Понятия «средняя», «поздняя», равно как и «ранняя» - достаточно субъективны, в такой периодизации отсутствует четкий критерий.

Нами разработана периодизация развития микроспор (Круглова, Горбунова, Баты-гина, 1991), согласно которой на основании наличия или отсутствия вакуолей, степени их выраженности, а также расположения ядра относительно поры прорастания, можно в стадии «микроспора» выделять фазы: невакуолизированная (ядро занимает центральное положение в клетке), слабовакуолизированная (ядро занимает различное положение относительно поры прорастания) и сильновакуолизированная, или микроспора с центральной вакуолью (ядро расположено на стороне, противоположной поре прорастания). Несмотря на то, что в литературе известны более дробные периодизации развития микроспор (Sunderland et al., 1974; Ouyang, 1986; Rose et al., 1986; и соавт.), предлагаемая периодизация отличается большим удобством в практическом использовании.

33 Необходимо коснуться следующего важного методического и методологического

аспекта. При исследовании особенностей индукции эмбриоидов в культуре пыльников
злаков, в частности, пшеницы, возникает необходимость сравнивать показатели продук
тивности пыльников при инокуляции их на разных фазах микроспорогенеза. Следует от
метить, что злаки характеризуются асинхронностью прохождения фаз микроспорогенеза в
пределах одного и того же пыльника (Круглова, 1984; McCormick, 1993). Поэтому мы
пользовались следующим критерием для определения фаз микроспорогенеза у пшеницы:
фаза считалась наступившей, если превалирующее (более 50%) количество микроспор на
ходилось на конкретной фазе микроспорогенеза (Горбунова, 1992). Вышеописанное ха
рактеризует цитологические критерии оптимальной для андрогенеза in vitro фазы развития
микроспор. Что же касается фенотипических критериев, то они так же разноречивы. Так
по одним данным благоприятный период для эмбриоидогенеза коррелирует со следую
щими морфологическими показателями: влагалище предпоследнего листа должно быть
расположено на середине колоса, находящегося в трубке (Суханов и соавт., 1983), или, по
другим источникам - кончик колоса, находящийся в трубке, должен располагаться на Ул
расстояния от лигулы флагового листа до влагалища предпоследнего листа (Ни, 1986). Ра
нее приводился еще один критерий определения фазы вакуолизированной микроспоры по
формуле: (Е+Т)/Г = 0,8-1, где

Е - длина колоса,

Т - длина последнего междоузлия,

Г - длина влагалища флагового листа, заключенного между лигулой флагового листа и вторым сверху листом (Bernard, 1980).

К настоящему моменту исследователи не пришли к единому мнению о фазе развития микроспор, адекватной для начала культивирования пыльников злаков. Наиболее часто в литературе встречаются сведения о том, что оптимальной для индукции андрогенеза in vitro у злаков является так называемая поздняя фаза микроспорогенеза (Ни, Huang, 1987; Schumann, 1987; При-ходько, 1988; Lorenz, 1989; Hassawi, Liang, 1990; Hassawi et al., 1990; и др.), которая соответствует сильновакуолизированной фазе в разработанной нами

34 периодизации (Круглова и соавт., 1991). Однако ряд исследователей сообщают об иных фазах микроспорогенеза, оказавшихся оптимальными для индукции андрогенеза in vitro у тех или иных видов злаков. Так, у яровой мягкой пшеницы (Ouyang et al., 1973), у кукурузы (Guo et al., 1987), ячменя (Wheatley et al., 1986), риса (Zapata et al., 1982), твердой пшеницы (Hadwiger, Heberle-Bors, 1986) оптимальна средняя фаза развития микроспор (соответствует слабовакуолизированной микроспоре). С.Ф.Лукьянюк и С.А.Игнатова (1986) на примере тритикале, а Б.Барнабас с соавт. (Barnabas et al., 1987) на примере кукурузы установили, что оптимальна ранняя фаза развития микроспор (соответствует фазе невакуолизированной микроспоры). G. Kleijer с соавт. (1986) и Т.Н.Сатарова (1994) делают вывод о том, что у кукурузы оптимальным для индукции андрогенеза in vitro является уже гамето фит - дву-клеточное пыльцевое зерно, тогда как Де ла Пена сообщает об успешном культивировании пыльников ржи, содержащих еще мейоциты (De la Репа, 1986). В то же время, и по пшенице есть также данные о том, что возможно получать морфогенные образования, инокулируя пыльники на десяти стадиях развития, начиная от стадии мейоцитов до трехклеточного пыльцевого зерна (Не, Ouyang, 1984; Не, Ouyang, 1985; Ouyang, 1986).

Еще один принципиально важный, по нашему мнению, вопрос касается состояния стенки гнезда пыльника в момент инокуляции. К сожалению, исследования в этой области крайне редки, если не единичны (Горбунова, 1992, 1993; Sunderland et al., 1975; Chen et al., 1984). Между тем, учитывая подход к пыльнику как к сложной интегрированной системе (Батыгина с соавт., 1963; Vasil, 1973; Батыгина, 1974, 1983; 1987; Резникова, 1983; 1984; Круглова, 1985), такого рода исследования проводить совершенно необходимо. Важно учитывать особенности физиологического статуса отдельных тканей стенки гнезда пыльника в момент инокуляции, взаимодействие тканей друг с другом и с микроспорами.

В целом, вопрос об оптимальной для индукции андрогенеза in vitro фа-

35 зе микроспоро - или микрогаметогенеза не решен однозначно. По-видимому,

точная фаза развития, коррелирующая с максимальным количеством «ответивших» пыльников, различается в пределах семейства и вида. Кроме того, этот вопрос тесно связан с проблемой морфогенетической компетентности микроспор и пыльцевых зерен.

Анализ литературы свидетельствует о том, что уже на ранних этапах работы по изучению андрогенеза in vitro возникло представление о существовании в пыльниках особой фракции «морфогенетически компетентных» микроспор, способных развиваться по спорофитному пути (Sunderland, 1983; Sunderland, Wicks, 1971; Sunderland et al., 1975). Вопрос о том, приобретается ли компетентность к спорофитному развитию только в условиях in vitro (Sunderland, Wicks, 1971; Sunderland, 1973; Bhojwani, Dunwel, Sunderland, 1973; Dunwell, Sunderland, 1974 a,b) или морфологическим эквивалентом компетентных микроспор являются различного рода аномальные микроспоры, уже присутствующие в пыльниках in vivo, до культивирования, в силу так называемого пыльцевого полиморфизма (Dale, 1975; Horner, Street, 1978; Heberle-Bors, Reinert, 1980; Zhou, 1980; Rashid, Reinert, 1981a,b,c; Heberle-Bors, 1982a,b, 1984, Idzikowska et al., 1982; He, Ouyang, 1985; Heberle-Bors, Odenbach, 1985; Gregoire, Brown, Picard, 1989; Хеберле-Борс, 1991 Батыгина, 1987), пока не решен однозначно, хотя имеется немало данных в пользу именно последнего предположения.

Подробный анализ содержания работ, в которых обсуждаются эти проблемы, дан и в наших публикациях (Горбунова, Круглова, Потапова, 1992; Батыгина, Круглова, Горбунова, 1992; Горбунова, Круглова, Батыгина, 1993).

В этой связи следует еще раз обсудить вопрос об используемой терминологии. Так, компетентными считаются S-пыльца (от англ. «small» - мелкий) (Sunderland, Wicks, 1971; Bhojwani et al., 1973; Sunderland, 1973) и так называемые Р-пыльцевые зерна (от англ. «premeiotic» - премейотический) (Heberle-Bors, 1982a,b, 1984; Heberle-Bors, Reinert, 1981; Gregoire, 1989; Хе-

36 берле-Борс, 1991). Предложены термины «спорофитная пыльца» (Kruger,

1988), «андрогенная пыльца» (Бугара с соавт., 1986), «андрогенная микроспора» (Chen et al., 1984), «эмбриогенная микроспора» (Wenzel et al., 1975; Maeda, Nakano, 1979; Rashid, Reinert, 1980, 1981a,b,c; Rashid et al., 1982; Rashid, 1983; Heberle-Bors, 1983; Sangwan, 1983; Aruga et al., 1985; Pace et al., 1987; Sangwan, Sangwan-Norreel, 1987; Schumann, 1987; Kott et al., 1988; Nakano, Maeda, 1988; Pechan, Keller, 1988; Семова, Анохин, 1990; Kyo, Ohkawa, 1991). По-видимому, эти термины, за исключением последнего, имеют право на существование. Термин же «эмбриогенная микроспора» хотя и самый распространенный в литературе, вызывает серьезные возражения. Как известно, эмбриогенез - процесс развития зародыша, образующегося путем амфимиксиса, т.е. объединения гамет. Эмбриогенная же микроспора, в понимании авторов термина, дает начало либо эмбриоиду, либо каллусу, поэтому было бы правильнее назвать ее либо эмбриоидогенной, либо каллусо-генной. Однако на стадии микроспоры практически невозможно определить, по какому пути морфогенеза in vitro - эмбриоидогенезу или каллусогенезу -будет развиваться эта клетка (если она вообще вступит на путь морфогенеза). Поэтому мы предлагаем использовать термин «морфогенная микроспора». (Горбунова и соавт., 1992).

Касаясь вопросов терминологии, важно сделать следующее замечание. В литературе, особенно западной, большое распространение получил термин «пыльцевой диморфизм» - наличие в пыльнике микроспор и пыльцевых зерен нормального и мелкого размера (например, Хеберле-Борс, 1991). На наш взгляд, использование термина «диморфизм» вместо «полиморфизм» - неточно, так как в пыльнике имеются микроспоры и пыльцевые зерна различного размера. Кроме того, микроспоры и пыльцевые зерна различаются, разумеется, не только по размерам, но и по морфологическим, физиолого-биохимическим, архитектоническим и иным параметрам.

Большое внимание исследователи уделяют раннему выявлению мор-

37 фогенных микроспор, т.е. поиску их специфического цитологического маркера. Эта сложная проблема решается путем анализа отличительных особенностей структурной организации таких микроспор. Наиболее изучен в этом отношении дурман. Р.Сэнгван и Х.Кэймфорт (Sangwan, Camefort, 1983) установили, что эмбриогенные микроспоры дурмана через 1 час культивирования пыльников развивают специфическую оболочку, окружающую тоно-пласт. Ранее (Sangwan-Norreel, 1983) на этом же объекте было показано, что начальный момент индукции андрогенеза in vitro состоит в подавлении гаме-тофитного развития в компетентных пыльцевых зернах, которы выражается в. подавлении аккумуляции крахмала, синтеза РНК, развития органелл. Отсутствие синтеза крахмала на ранних стадиях культивирования отмечено и в эмбриогенных микроспорах табака (Rashid, Reinert, 1980). Дж.Данвелл и Н.Сандерлэнд (Dunwell, Sunderland, 1974, a,b) считают, что первый признак пыльцевого эмбриогенеза (правильнее - эмбриоидогенеза) у дурмана - нарушение цитокинеза при делении микроспоры. Морфогенные пыльцевые зерна табака можно выявить через 7 суток культивирования по наличию в цитоплазме вегетативной клетки зон, содержащих мультивезикулярные тельца, сходные с лизосомами (Dunwell, Sunderland, 1974, a,b). На табаке же показано, что морфогенные пыльцевые зерна этого растения, в отличие от гамето-фитных пыльцевых зерен, характеризуются тонкой экзиной, увеличенной интиной и незаполненной цитоплазмой - эти показатели в значительной мере сближают такие пыльцевые зерна с микроспорами, что позволяет предполагать незавершенность их развития (Rashid, Reinert, 1981a,b,c, 1982). Автора-диографическими исследованиями с включением Н -уридиновой метки в культуру пыльников белены, установлено, что самым ранним проявлением морфогенности пыльцевых зерен является начало синтеза РНК в генеративных клетках (Raghavan, 1979). Исследования пыльцевых зерен табака с использованием двумерного гель-электрофореза и авторадиографии показали, что в период эмбриогенной дедифференциации характерно увеличивалась

38 интенсивность некоторых фракций фосфопротеинов (Kyo, Ohkawa, 1991).

Подобные исследования по злакам довольно малочисленны. Следует упомянуть работу Дж. Пэйса с соавт. (Расе et al., 1987), посвященную попытке выявить морфогенные микроспоры в культивируемых пыльниках кукурузы с помощью флуоресцентных красителей. Исследованиями С.Тсей с соавт. (Tsay et al., 1986) показано, что в пыльниках риса морфогенетической способностью обладали микроспоры, содержащие большие количества аморфных липидов в первые дни культивирования, тогда как в пыльниках кукурузы такой способностью характеризовались микроспоры, накопившие крахмал (Barloy et al., 1990). На примере риса выявлено, что способностью к андрогенезу in vitro отличались пыльцевые зерна более крупных размеров (Mercy, Zapata, 1987) или мелкие, с плотной цитоплазмой (Cho, Zapata, 1990), тогда как у сорго такой способностью обладали пыльцевые зерна, в которых генеративная клетка оставалась прикрепленной к оболочке (Willson et al., 1978). Кроме того, в упомянутой работе С.Мерси и Ф.Запата (Mercy, Zapata, 1987) указывается, что на спорофитный путь развития вступают микроспоры риса со слабо окрашенной цитоплазмой, в малой степени электроноплотные. Микроспоры и пыльцевые зерна пшеницы в этом отношении практически не изучены. В единственной обнаруженной нами работе сообщается, что пыльцевые зерна пшеницы, способные к образованию эмбриоидов, не окрашиваются ацетокармином или окрашиваются этим красителем слабо - в оличие от большинства интенсивно окрашивающихся ацетокармином пыльцевых зерен (Gregoire et al., 1989). Эти результаты все же вызывают сомнение, поскольку, как известно, ацетокармин - краситель, интенсивно окрашивающий именно жизнеспособные клетки (Прозина, 1960). По логике авторов, эмбриоидоген-ные пыльцевые зерна пшеницы нежизнеспособны.

Таким образом, микроспоры инокулированных пыльников, в зависимости от их морфогенетической компетентности и адекватности условиям культивирования, становятся на тот или иной путь развития.

Среди предложенных схем путей развития микроспор, ведущих в условиях культивирования к формированию эмбриоидов и каллусов, наибольшей полнотой и логичностью отличается схема, предложенная Н.Сандерлэндом (Sunderland, 1980). Автор выделяет следующие пути развития инокулированных микроспор представителей различных семейств покрытосеменных, в том числе злаков.

Путь Б. Аномальное деление микроспоры ведет сначала к образованию двух равных ядер, а далее - к формированию единой клеточной группировки гаплоидной природы. Этот путь развития микроспоры изучен на примере ячменя (Sunderland, 1980; Idzikowska et al., 1981; Chen et al., 1984 a,b; Ouyang, 1986), пшеницы (Размологов, Пухальский, 1979; Внучкова и соавт., 1990; Горбунова и соавт., 1992; Sunderland, 1980; Vasil, 1980; Zeng, Ouyang, 1980; Kruger, 1987, 1988; Barnabas et al., 1988;), тритикале и риса (Vasil, 1980; Chang et al., 1981; Zapata et al., 1982; Fang, Liang, 1985), кукурузы (Kuo et al., 1978). Образование двух потенциально равных ядер у ячменя К.Идзиковска с соавт. (Idzikowska et al., 1981) связывают с параллельным или произвольным положением веретена деления относительно оболочки материнской микроспоры (в отличие от перпендикулярного положения, наблюдаемого в условиях in vivo); распределение всех клеточных органелл в данном случае равное; клеточная оболочка между двумя ядрами никогда не обнаруживалась -ее закладка происходила после формирования многоядерных структур. У ячменя же отмечено слияние равных ядер, ведущее к увеличению плоидно-сти; по мнению исследователей, этот процесс обусловлен какими-то неизвестными причинами, а не только наличием близко расположенных и контактирующих друг с другом ядер (Hadwiger, Heberle-Bors, 1986).

Путь Ц. Микроспора претерпевает нормальное неравное митотическое деление с образованием генеративной и вегетативной клеток. Слияние этих клеток и ее последующее деление дает единую клеточную группировку, но уже негаплоидной природы: в ее происхождение вносят вклад и генератив-

40 ная, и вегетативная клетки (путь Ц-1); «включение» делений генеративной

клетки на поздней стадии культивирования, после деления вегетативной клетки, дает начало образованию двух отдельных клеточных группировок различного происхождения (путь Ц-2). Однако ситуация, например, у ячменя, усложняется дифференциацией генеративной клетки: в пределах одного клеточного цикла конденсированное состояние ядра генеративной клетки может быть нарушено, и оно по своей морфологии не отличимо от ядра вегетативной клетки (Sunderland, 1980).

Путь А-Б (в предыдущих исследованиях НСандерлэнд обозначает этот путь как «А» - см. Sunderland, 1974; Sunderland et al., 1975; Sunderland, Evans, 1980). Микроспора также претерпевает неравное митотическое деление. Далее развивается функциональная вегетативная клетка без какого-либо участия генеративной клетки (путь А-Б-1). У ячменя (Sunderland, 1980) при этом доминируют свободные деления ядра вегетативной клетки, которые синхронизируются после нескольких циклов; нерегулярное образование клеточных оболочек ведет к формированию как многоклеточных и многоядерных структур, так и структур с частично образованной оболочкой. Отмечены, однако, и организованные неравные клеточные деления. В этом случае мелкие гагшоидньїе клетки-произюдньїе занимают различное положение относительно дегенерирующей генеративной клетки. В крупных же клетках-произюдных происходят свободные ядерные деления и нерегулярное образование оболочки. Таким образом формируются химерные структуры, состоящие из гаплоидного и негаплоидного компонентов (пути А-Б-2 и А-Б-3). Далее тжшоидный мелкоклеточный компонент развивается как зародыш, полиплоидный крупноклеточный компонент - как эндосперм. Образование гаплоидов из вегетативной клетки отмечено также у таких злаков, как кукуруза (Kuo et al., 1978; Мао et al., 1981; Barnabas et al., 1987), пшеница (Sun, 1981; Henry et al., 1984), рожь (Sun, 1981; Mlevska-Pawliczuk, 1987), сорго (Rose et al., 1986).

Путь А-ГБ связан с независимым развитием генеративной и вегетативной клеток Наиболее детально А-ГБ-путь изучен на примере ячменя (Sunderland et al., 1975): после неравного деления микроспоры во время предобработки холодом в условиях культивирова-

⁴¹ /РОССИЙСКАЯ

ния независимо развиваются обе клетки; образовавшиеся многоклеточные струщры-сшк;;

заны своим происхождением с различным количеством производных генеративной и вегетативной клеток в различных комбинациях. К образованию многоклеточных структур, ахлоящих из клеток разной плоидности, ведут и независимые деления эндомитотическо-го ядра вегетативной клетки и гаплоидного ядра генеративной клетки (Chen et al., 1984). А-ГБ-путь отмечен таюке у риса, пшеницы, тритикале, кукурузы (Kuo et al., 1978; Sunderland, 1980; Sunderland et al., 1975).

Путь А-Г. Микроспора претерпевает неравное деление; далее развивается только генеративная клетка, образовавшиеся многоклеточные структуры гаплоидны. Вегетативная клетка претерпевает ограниченное число делений и в целом играет вспомогательную роль суспензороподобной материнской клетки. Независимую морфогенетическую роль генеративной клетки впервые убедительно показал на примере белены В.Рагхаван (Raghavan, 1975). Однако деления генеративной клетки были отмечены в культивируемых пыльниках ячменя и ранее, хотя это явление не было охарактеризовано как морфогенетический процесс (Willson et al., 1978). Тем не менее, Ч.Сан (Sun, 1981) на примере ряда злаков указал на роль генеративной клетки как материнской клетки эмбриоида.

Таким образом, у одного и того же вида растений (в частности, у злаков) показана возможность образования андрогенных новообразований из микроспор или клеток пыльцевого зерна несколькими путями. Как отмечают СМахешвари с соавт. (Maheshwari et al., 1982), этот феномен не ограничивается каким-либо отдельным цитологическим путем, а выбор того или иного пути развития определяется на уровне, не поддающемся анализу с использованием микроскопа. Авторы не уточняют свою мысль; возможно, речь идет о биохимических факторах, вшдействующих на начальный ход морфогенеза в культуре изолированных пыльников.

Таковы основные пути развития микроспор и клеток пыльцевого зерна, ведущие к образованию многоядерных и многоклеточных структур и далее - эмбриоидов и каллусов. Остальные микроспоры, по-видимому, находились в не оптимальной для индукции анд-

42 рогенеза in vitro фазе развития, в силу асинхронности в развитии спорогенных клеток in

vivo в пределах пыльника, отмеченной в той или иной степени практически у всех злаков (см., например, Суханов, 1983; Кругаова, 1984). Аналогичные процессы отмечены в культивируемых пыльниках представителей других семейств (Егорова, Резникова, 1982; Калинин, 1987; Маруненко, Кучко, 1988; Teplitskaya, 1992; и др.).

Невысокая «отзывчивость» микроспор на условия культивирования может быть обусловлена и их какими-то индивидуальными физиолого-биохимическими или архитектоническими особенностями. Кроме того, как было отмечено выше, на путь андрогенеза in vitro вступают, скорее всего, аномальные микроспоры, количество которых в «нормальном» пыльнике, естественно, ограничено. В целом данный аспект, тесно связанный с проблемой морфогенетической компетентности микроспор, требует дальнейшего исследования.

Материнская клетка при дальнейшем культивировании дает начало группе неорганизованных клеток, количеством 5-20, располагающихся в пределах одной неповрежденной оболочки микроспоры или пыльцевого зерна, достигшей предела растяжимости. Для обозначения этой группы клеток предложено немало терминов: «эмбриоподобная микроскопическая структура» (Sunderland et al., 1975), «индуцированная микроструктура» (Schumann, 1987а), «многоклеточная пыльцевая единица» (Sunderland, 1980; Huang, 1986), «многоклеточная масса» (Miao et al., 1981), «микроструктура-синцитий» (Не, Ouyang, 1985), «потенциальная эмбриогенная клеточная масса» (Huang et al., 1987), «многоклеточный агрегат» (Zeng, 1980), «эмбриогенная клеточная масса» (Huang et al., 1987), «эндоспориальное многоклеточное образование» (Тивари, 1988), «многоклеточная андрогенная масса» (Tsay et al., 1986) и, наконец, наиболее употребимый термин - «многоклеточное пыльцевое зерно» (Idzikowska, Mlodzianowski, 1979; Maeda, Nakano, 1979; Chang et al., 1981; Henry et al., 1984; Dunwell, 1985; He, Ouyang, 1985; Barnabas et al., 1987; Hu, Huang, 1987; Kruger, 1988; Nakano, Maeda, 1988; и др.). С эмбрио-

43 логических позиций пыльцевым зерном данная масса клеток, разумеется, не

является. На наш взгляд, называть ее «многоклеточным образованием» (Раз-мологов, Пухальский, 1979) или «многоклеточной структурой» (Chen et al., 1984 a,b) корректнее. В ряде работ приводятся различные классификации многоклеточных структур злаков. Так, на основании электронно-микроскопических данных по исследованию пыльников пшеницы между 9 и 14 сутками культивирования выявлены многоклеточные структуры четырех типов (Barnabas et al., 1988): 1) гетерогенного состава: дегенерирующие клетки содержат очень плотную цитоплазму с множеством липидных капель, функциональные клетки содержат гетерохроматиновое ядро и обычные клеточные органеллы; в клетках обеих групп отмечены амилопласты; 2) гетерогенного состава: часть клеток сильно вакуолизирована, другие клетки содержат множество крахмальных зерен и липидных капель; 3) гомогенного состава: клетки характеризуются наличием плотного слоя обезвоженной цитоплазмы; состояние клеточных органелл свидетельствует о нежизнеспособности клеток; 4) гомогенного состава, имеющие все характеристики жизнеспособности: гетерохроматиновые ядра с двумя ядрышками, цитоплазма, богатая рибосомами; клетки находятся в меристематическом состоянии.

На примере ячменя предложена классификация многоклеточных структур, основанная на особенностях цитоплазмы (Ни, Huang, 1987). Авторы выделяют меристематические, вакуолизированные, запасающие и цено-тические многоклеточные структуры; при этом только меристематические многоклеточные структуры способны к дальнейшему развитию. Частота образования меристематических многоклеточных структур увеличивается при переносе культивируемых пыльников на свежую среду на 10-е сутки эксперимента.

Особого внимания заслуживает вопрос о способах образования клеточных стенок при развитии многоклеточных структур. Этот вопрос особенно важен с той точки зрения, что в литературе до сих пор нет единого мне-

44 ния о том, какие именно структуры - многоядерные или многоклеточные -

дают начало эмбриоидам и каллусам. В работе, посвященной ультраструктурным аспектам андрогенєза in vitro, Б.Хуанг (Huang, 1986) на примере пшеницы и ячменя сообщает, по крайней мере, о двух способах образования клеточных стенок: а) путем ее центрипетального врастания вовнутрь от ин-тины микроспоры или пыльцевого зерна с двух сторон одновременно, как правило, после нескольких ядерных делений; рядом с «растущими концами» таких фрагментов клеточной стенки обнаружены многочисленные везикулы, в которых предположительно содержатся участвующие в построении стенки вещества, высвобождаемые в «точку роста». Образованные таким способом клеточные стенки могут быть неполными. Аналогичный способ образования клеточной стенки был отмечен у ячменя ранее (Idzikowska, Mlodzianowski, 1979); б) путем формирования типичных фрагмопластов. В этом случае клеточные стенки - полные. Сравнивая светооптические и электронно-микроскопические данные, автор приходит к выводу, что первый способ образования клеточной стенки характерен для сильновакуолизированных клеток, тогда как в «богатых цитоплазмой» клетках доминирует второй тип. На примере культивируемых пыльников пшеницы показана синхронность образования клеточных стенок в пределах каждого митотического деления при развитии многоклеточных структур (Zhu et al., 1978, Гобунова, 1993).

В ходе дальнейшего развития многоклеточных структур, после высвобождения их из пыльцевой оболочки путем ее разрыва, формируются эмбриоиды или каллусы. Направленность процесса в сторону прямого (эмбриоидогенез) или непрямого (каллусогенез) андрогенєза in vitro определяется, прежде всего, генетическими особенностями донорньк растений (Гаплоидия и селекция, 1976; Idzikowska et al., 1981; Sangwan, 1983; He, Ouyang, 1985; Ермаков, Матвеева, 1986; Лукьянкж, Игнатова, 1986; Тырнов, 1986; Chen et al., 1986; Keller et al., 1986; Горбунова, 1993) и сосгаюм питательных сред, главным образом гормональными добавками (Qu, Chen, 1983; Heberle-Bors, 1984,1985; Ермаков, Матвеева, 1986; Barnabas et al., 1987; Горбунова, 1993).

45 Анализ разрывающейся пыльцевой оболочки у риса, выполненный с

помощью сканирующего микроскопа, показал, что экзина при этом покрывается слизистым секретом неустановленной природы; авторы, однако, не сообщают, совпадает ли место выделения секрета с местом разрыва экзины (Maeda, Nakano, 1979).

В литературе приводится анализ тех многоклеточных структур, которые дают начало именно эмбриоиду. Так, согласно данным Г.Шуманна (Schumann, 1987a,b), в формировании эмбриоида у тритикале принимают участие многоклеточные структуры, характеризующиеся наличием мелколопастных клеток с тонкой оболочкой. По мнению Б.Барнабас с соавт. (Barnabas et al., 1988), эмбриоиды пшеницы формируются из многоклеточных структур гомогенного состава, клетки которых находятся в меристема-тическом состоянии, тогда как Г.У.Крюгер (Kruger, 1987, 1988) также на примере пшеницы отмечает, что такие многоклеточные структуры состоят из множества мелких клеток, взаимно разделенных тонкими клеточными оболочками. Дж.Данвелл (Dunwell, 1985a,b) обратил внимание исследователей на низкую выживаемость каждой компетентной клетки многоклеточной структуры. Ясно, что гибель части клеток внутри любой структуры исключает нормальный ход ее развития. Возможно, отмирание части клеток многоклеточной структуры - одна из причин общего низкого выхода эмбриоидов в культуре пыльников.

К настоящему времени эмбриоидогенез in vitro обнаружен у многих видов растений из различных семейств.

Впервые эмбриоидогенез у цветковых растений был обнаружен Ф.Стюардом (Steward, 1958) и Дж.Райнертом (Reinert, 1958) при изучении морфогенеза в суспензионной культуре моркови.

Термин «эмбриоид» был предложен И.Вэзилом и А.Хилдебрандтом (Vasil, Hildebrandt, 1966) для обозначения зародышеподобных структур, возникающих как in vivo («нуцеллярные» и «фолиарные» зародыши), так и in

46 vitro. Термин «эмбриоидогенез» соответствует термину «соматический эмбриогенез», предложенному Б.П.Токиным (Токин, 1969) для обозначения развития целых организмов из соматических клеток. В трактовке В.Гальперина (Halperin, 1966, 1970) соматический эмбриогенез (эмбриоидогенез) - это процесс формирования интегральной структуры с осью побег-корень. По Дж. Циммерману (Zimmermann, 1993), соматический эмбриогенез - это развитие культивируемых клеток в зародыши, способные превратиться в целое растение.

При исследовании эмбриоидов, образовавшихся в процессе культивирования изолированных пыльников, употребляются термины «андрогенный зародыш» (например, Nakano, Maeda, 1989) и «глобулярный пыльцевой зародыш» (например, Barnabas et al., 1987; Kyo, Ohkawa, 1991). На наш взгляд, эти термины абсолютно неприемлемы. Применяемый же термин «пыльцевой эмбриоид» (Guha-Mukherjee, 1973) эмбриологически грамотнее, хотя и здесь возможна более корректная редакция, например, «эмбриоид микроспориаль-ного (пыльцевого) происхождения».

В разрабатываемой Т.Б.Батыгиной концепции репродукции (Батыгина, 1987, 1990, 1993; Батыгина с соавт., 1978; Эмбриология цветковых, 1994; Batygina, 1992) эмбриоид рассматривается как зародышеподобная биполярная структура, образующаяся асексуально, как зачаток нового растительного организма, как одна из структурных единиц бесполого размножения цветковых растений in vivo и in vitro. Автор концепции предлагает выделять эм-бриоидогенный тип репродукции, рассматривать эмбриоидогению как особый способ образования нового индивидуума, а эмбриоидогенез - как оригинальный способ образования спорофита (в сравнении с эмбриогенезом и ге-моризогенезом) при гомофазном (спорофит —» спорофит) воспроизведении. Эмбриоид, аналогично половому зародышу, характеризуется сопряженным развитием апексов побега и корня, развиваясь как отдельная (от материнского организма или каллуса) единая система с закрытым радикулярным полю-

47 сом. Эмбриоиды могут возникать на разных органах растения и на разных

стадиях онтогенеза.

Э.Виллиамс и Дж.Махешваран (Williams, Maheshwaran, 1986) полагают, что эмбриоидогенез in vitro проходит при участии клеток, уже детерминированных для эмбриогенного развития in vivo, до помещения их в изолированную культуру. Для экспрессии эмбриоидогенеза требуются только действие регуляторов роста и создание благоприятных условий.

На примере многих растений показано, что эмбриоиды, формирующиеся в изолированной культуре, зачастую достигают весьма продвинутых стадий развития, но не развиваются в растения. Этому факту трудно найти однозначное объяснение. Справедливо, на наш взгляд, мнение А.М.Бугары с соавт. (1986), полагающих, что на каждом этапе эмбриоидогенеза наблюдается блокирование развития, связанное с критическими событиями в дифференциации эмбриоидов. В такие критические периоды процесс эмбриоидогенеза, вероятно, индуцируется фитогормонами и взаимодействующими с ними группами соединений, отсутствие которых в питательной среде приводит к остановке развития. Снятие такого блокирования может быть достигнуто подбором оптимальной питательной среды. О большом значении гормонального фактора в регенерации растений из эмбриоидов сообщается во многих публикациях (Горбунова, Круглова, 1993, 1994; Горбунова с соавт., 1993; Armstrong et al., 1987; Schumann et al., 1991). Однако ряд авторов указывают и на иные факторы, определяющие непрорастание эмбриоидов. Так, К.Шарма и С.Бходжвани (Sharma, Bhojwani, 1989) причиной неспособности эмбриоидов пыльцевого происхождения у Brassica juncea (L.) Czern. к нормальному прорастанию считают структурные аномалии в их строении (отсутствие почечки и корешка, дегенерация гипокотиля и корешка) и физиологическую незрелость. У эмбриоидов пшеницы, полученных в культуре незрелых зародышей, напротив, отмечена тенденция к преждевременному созреванию (Orias-Akins, Vasil, 1982). Структурные аномалии в форме отсутст-

48 вия полярности отмечены и при изучении эмбриоидогенеза в культуре пыльников сорго (Schumann et al., 1991). Тем не менее, у некоторых видов путем эмбриоидогенеза получены и нормальные интактные растения, например в культуре пыльников картофеля (Маруненко, Кучко, 1989), гевеи (Zhenghua et al., 1982), пшеницы (Schumann et al., 1991; Горбунова с соавт., 1992). Однако многие из регенерантов, образовавшихся в культуре пыльников, альбиносы. Сведения о дальнейшем развитии эмбриоидов злаков в растение в литературе крайне скудны. В единственной отмеченной нами работе Т.Армстронга с соавт. (Armstrong et al., 1987) указывается, что в ходе генезиса эмбриоидов пшеницы у них развиваются колеориза, щиток, колеоптиль, корни и побеги, т.е. эмбриоидогенез in vitro сходен с зиготическим эмбриогенезом in vivo. Некоторые этапы развития эмбриоидов, полученных в культуре зародышей злаков, также обнаруживают удивительное сходство с таковыми у зиготиче-ских зародышей; однако, как справедливо отмечают В.П.Банникова с соавт. (1991), считать весь ход развития первых и последних тождественным -преждевременно, поскольку ни в одном из исследований эмбриоиды не рассматривались последовательно, через определенные промежутки времени, на различных средах и в течение всего периода культивирования.

Это замечание целиком можно отнести и к изучению эмбриоидов, полученных в культуре пыльников. В целом, вопрос о соотнесении эмбриогенеза in vivo и эмбриоидогенеза in vitro настолько же важен, насколько и сложен. Вполне возможно, что первые этапы эмбриоидогенеза in vitro могут отличаться от первых этапов эмбриогенеза in vivo; в условиях in vitro могут образоваться структуры, неспецифичные для зародышей злаков в условиях in vivo. Этот интереснейший вопрос требует тщательного изучения.

В литературе приводятся немногочисленные данные по ультраструктурному строению клеток эмбриоида, например, по сканированию поверхности эмбриоидов, полученных в результате культивирования изолированных пыльников как злаков, так и представителей других семейств (Dodds,

49 Reynolds, 1980; Khan et al., 1990; Higuchi, Maeda, 1991). Однако авторы всех

проанализированных работ исследовали поверхность эмбриоидов, уже «вышедших» из гнезда пыльника на его поверхность.

Что касается анализа многоклеточных структур, дающих начало каллусам, то, по наблюдениям Б.Барнабас с соавт. (Barnabas et al., 1988), у пшеницы в каллусы развивается жизнеспособная, функционирующая часть многоклеточных структур гетерогенного состава. Г.Шуманн (Schumann, 1987a,b) сообщает о том, что каллус у тритикале образуется из многоклеточных структур с крупнолопастными, частично вакуолизированными, толстостенными клетками. В свою очередь образование самих «каллусогенных» многоклеточных структур у ячменя (Sunderland, 1980) и пшеницы (Kruger, 1988) связано с нетипичным делением вегетативной клетки, тогда как у кукурузы, риса и тритикале (Sunderland, 1980; Mercy, Zapata, 1987) в образовании таких структур принимают участие и генеративная, и вегетативная клетки. Согласно Г.Виллсону с соавт. (Willson et al., 1978), каллусы ячменя чаще образовывались вслед за равным делением микроспоры, однако отмечены случаи участия в этом процессе и вегетативной клетки. В работах Г.Крюгера (Kruger, 1987, 1988) приводятся данные о том, что у пшеницы на путь каллусогенеза вступают пыльцевые зерна, претерпевшие обычный неравный митоз, но вегетативная клетка которых сохранила способность к делениям. Иными словами, в данном случае каллус берет начало от вегетативной клетки; генеративная клетка не вовлекается в процесс дальнейших делений и постепенно дегенерирует. Образование каллуса, связанное только с равными делениями микроспоры, описано для риса (Chang et al., 1981). Таким образом, в целом, формирование каллуса связано с аномальным развитием микроспор или клеток пыльцевого зерна.

Способность к каллусогенезу как in vivo, так и in vitro обнаружена у представителей всех порядков и классов растений, причем почти из всех частей растения. В природных условиях каллусы появляются как результат ме-

50 ханического воздействия или влияния микроорганизмов и насекомых

(Yeoman, 1970). Однако образование каллуса в интактном растении - сравнительно кратковременный феномен.

Первые работы, посвященные получению каллуса in vitro из изолированных частей растений, например, сегментов мезофилла листа и изучению каллусогенеза, появились еще в конце прошлого - начале нашего века (цит. по: Муромцев и др., 1990). Сообщение о способности пыльцевых зерен в условиях in vitro к индукции гаплоидной каллусной ткани (на примере Ginkgo biloba L.) впервые встречается в работе В.Тьюлеке, написанной больше 40 лет назад (Tulecke, 1953). Однако до настоящего времени однозначного определения понятия каллуса нет. По Дж.Доддсу и Л.Робертсу (Dodds, Roberts, 1985), каллус - неорганизованная меристематическая или опухолеподобная масса растительных клеток, формирующаяся in vitro. В словаре, приведенном Р. Пьериком (Pierik, 1987), дается следующее определение: каллус - активно делящаяся неорганизованная ткань, состоящая из неорганизованных и дифференцированных клеток. По мнению М.Терци и З.Санга (Terzi, Sung, 1986), каллус - произвольно пролиферирующая ткань, растущая или на твердой поверхности (каллус в строгом смысле слова), или в виде суспензии в жидкой среде. В работе Г.С.Муромцева с соавт. (1990) каллусом названа ткань, возникшая путем неорганизованной пролиферации клеток растений. Как полагает Т.Б.Батыгина (1987), каллус - гетерогенная интегрированная структура (система), образующаяся в результате пролиферации клеток на поверхности отдельных структур растительного организма; каллус формируется, как правило, из исходно разных клеток генеративных или вегетативных органов; состоит из групп неоднородных клеток, имеющих морфогенетиче-ские потенции, которые реализуются различными путями (эмбриоидогенез, органогенез, гистогенез).

Для характеристики каллуса, возникшего в культуре изолированных пыльников, по-видимому, имеет смысл согласиться с терминами «микроспориальный каллус»,

51 «пыльцевой каллус» (Ouyang et al., 1973; Willson et al., 1978; Simola, 1982) в редакции: «каллус микроспориального (пыльцевого) происхождения». На наш взгляд, допустимы также термины «андрогенный каллус» (Искакова, 1991; Yadav et al., 1989) и «каллус андрогенно-го происхождения». Но в этом случае следует иметь в виду, что необходимо различать понятия «андрогенез in vitro» и собственно «андрогенез» (Гырнов, 1986).

Критический момент каллусогенеза в культуре изолированных пыльников - инициация процесса. Каллус, как и эмбриоид, берет начало от так называемьк морфогенных микроспор, которые отличаются от неморфогенных рядом качественных показателей, главным образом меристематичностью (Круглова, Горбунова, 1993; Круглова с соавт., 1991; Kruglova, Gorbunova, 1992).

Э.Виллиамс и Г.Махешваран (Williams, Maheshwaran, 1986) полагают, что в отличие от эмбриоидогенеза in vitro, для каллусогенеза необходимы редетерминация дифференцированных клеток, пролиферация их и развитие эмбриогенно детерминированного состояния.

В ходе дальнейшего развития многоклеточных структур они высвобождаются из оболочки микроспоры или пыльцевого зерна. В гнездах пыльников обнаруживаются клеточные соединения - синцитии. Разрастаясь, синцитии разрывают стомиум и оказываются на поверхности пыльника в виде глобул с беспорядочными трещинами на поверхности (Kruger, 1988). Так формируются каллусы.

Отмечено значительное морфологическое разнообразие каллусов, возникших при культивировании пыльников. Большинство авторов выделяют два типа каллусов: мягкие, рыхлые, водянистые, желтоватой окраски - так называемые неморфогенные (неэмбриогенные) и компактные, узловатые, плотные, белого цвета - так называемые морфогенные (эмбриогенные) (Daniel, 1990; Hoffman et al., 1990; Redway et al., 1990; Tsay et al., 1990; Guiderdoni, 1991; Богуспаев с соавт., 1992; Горбунова с соавт., 1992). Регене-рационной способностью обладают, естественно, каллусы второго типа.

Авторы ряда работ выделяют и большее количество типов каллусов

52 андрогенного происхождения. Например, Х.Чанг с соавт. (Chang et al., 1981)

в культуре пыльников риса наблюдали образование трех типов каллусов - все эмбриогенные, различающиеся по содержанию ДНК. Б.Гоффманн с соавт. (Hoffman et al., 1990) сообщают о формировании в культуре пыльников пшеницы также трех типов каллуса, различающихся морфологически и гистологически (один компактный и два рыхлых). В культуре пыльников пшеницы с помощью метода сканирующей электронной микроскопии выявили четыре типа каллусов, причем к регенерации были способны только два их них (Barchowsky, Zemetra, 1988). Анализ каллусов, полученных в культуре пыльников ячменя, позволил выявить пять их типов, различающихся гистологически (Искакова, 1991).

Серия работ посвящена изучению белков и ферментов, характерных как для мор-фогенных, так и для неморфогеннных микроспориальных каллусов пшеницы (Тивари, 1989; Тивари с соавт., 1990а, 19906; Богуспаев с соавт., 1991; Искакова, 1991; Биотехнология зерновых..., 1992; Кударов с соавт., 1992; Рахимбаев, Тивари, 1992; Анапияев и соавт., 1993). Авторы выявили изменчивость активности ряда ферментов не только в различных типах каллусов, но и в каллусах на разньк стадиях развития. Гетерогенность элекгрофоре-тического спектра, например, L-амилаз исследователи считают важным показателем начальных этапов процесса морфогенеза в культуре пыльнков, а обнаруженную в морфо-генных каллусах глуїаматдещдрогеназу, строго специфичную к коферменту НАДФ, рассматривают как биохимический маркер начальных этапов морфогенеза in vitro. Ранее, на примере пыльников кукурузы, было показано, что морфогенные и неморфогенные каллусы различаются также и по содержанию белка и нуклеиновых кислот (Huang et al., 1987).

Цитолого-гистологический анализ рыхлого неэмбриогенного каллуса, полученного в культуре пыльников пшеницы, позволил выявить в составе этого новообразования беспорядочно расположенные клеточные скопления, окруженные крупными межклеточными пространствами, которые и придают ему рыхлую структуру; в таком каллусе отсутствуют сосудистые пучки (Горбунова с соавт., 1992). В свою очередь, компактный эмбриогенный андро-

53 генный каллус, например, ячменя характеризуется наличием обширных участков плотной паренхимной и меристематической ткани, состоящей из клеток с крупными, четко окрашенными ядрами и тонкими клеточными стенками (Искакова, 1991).

Цитологические исследования каллусов ячменя микроспориального происхождения показали (Биотехнология зерновых..., 1992; Рахимбаев, Ти-вари, 1992), что каллус берет начало как от микроспор, прикрепленных к та-петуму обычным образом, так и от микроспор, не связанных с тапетумом и располагающихся свободно в полости гнезда пыльника.

Необходимо учитывать, что каллус может происходить и от клеток соматических тканей стенки пыльника. Формирующиеся диплоидные каллусы регенерируют диплоидные растения (Sung et al., 1981). Для идентификации растений, образованных из микроспор или клеток пыльцевого зерна, предложено использовать биохимические маркеры (например, спектры кислой фосфатазы), которые позволяют отсортировать гомозиготные линии от гетерозиготных (Mercy, Zapata, 1987).

Поверхность пыльцевых каллусов риса, как показали данные сканирующей электронной микроскопии, может быть разной - гладкой, узловатой, ворсистой, бугорчатой (Maeda et al., 1986).

Обнаружена значительная цитогенетическая гетерогенность андроген-ных каллусов. С помощью кариологического анализа выявлены гаплоидные, диплоидные, полиплоидные, анеуплоидные, миксоплоидные каллусные клетки (Тивари, 1989; Искакова, 1991). Изменение числа наборов хромосом могло произойти не только в ходе эндомитоза, эндоредупликации или слияния микроспориальных клеток, но и в результате возможного мутагенного эффекта гормонов, входящих в состав питательной среды.

Цитогенетический статус каллуса влияет на его регенерационную способность. Так, у ячменя более высокой регенерационной способностью обладали диплоидные андрогенные каллусы (Тивари, 1989; Тивари с соавт.,

54 1990a, 19906; Искакова, 1991).

Таким образом, исследователями широко изучаются вопросы, касающиеся как количества выделяемых типов каллусов микроспориального (пыльцевого) происхождения, так и их морфолого-физиологических показателей, коррелируюших с морфогенетическими потенциями и регенерацион-ной способностью.

1.4. Гормональная регуляция андрогенеза in vitro у яровой мягкой пшеницы

Генотип донорного растения - основной фактор, детерминирующий переключение гаметофитной программы развития микроспор/клеток пыльцевого зерна на спорофитную. Однако исследователи зачастую ограничиваются лишь констатацией этого факта, сообщая о «генотипических вариациях отзывчивости пыльников на условия культивирования». Также известно, что индукция андрогенеза in vitro при культивировании изолированных пыльников, иначе говоря, индукция спорофитного пути развития микроспор или клеток пыльцевого зерна, приводящего к развитию эмбриоидов или каллусов, а далее - растений-регенерантов, зависит от многих взаимосвязанных факторов. Один из них - введение в состав культуральной среды определенных фитогормонов конкретной концентрации. И выбор оптимальной концентрации экзогенных гормонов при культивировании пыльников носит главным образом случайный характер.

Как известно, фигогормоны - органические, сравнительно низкомолекулярные соединения, с помощью которых осуществляется взаимодействие клеток, тканей и органов и которые в малых количествах необходимы для запуска и реализации физиологических программ (Полевой, 1982; Чайлахян, 1982; Дерфлинг, 1985). Впервые о введении фитогормонов (в частности, кинетина) в состав питательной среды и успешном получении эмбриоидов пыльцевого происхождения у Datura sp. сообщили пфвооткрыватели андроге-

55 неза in vitro Гуха и Махешвари (Guha, Maheshwari, 1964). Впоследствии был накоплен достаточный эмпирический материал по изучению влияния различных фитогормонов на индукцию андрогенеза in vitro и регенерацию растений в культуре изолированных пыльников, хотя при этом получены зачастую противоречивые результаты. В целом, значение фи-тогормонального состава питательной среды для индукции и самого хода процесса андрогенеза in vitro в культивируемых пыльниках можно считать достоверно установленным (Горбунова с соавт., 1989, Горбунова 1992; Gorbunova, Kruglova, 1994).

Накоплен достаточный эмпирический материал по изучению влияния различных фитогормонов на индукцию морфогенеза (эмбриоидогенеза и каллусогенеза) и регенерацию растений в культуре изолированных пыльников, хотя при этом получены противоречивые результаты.

Показано, что один и тот же гормон может оказывать различное действие в культуре пыльников различных генотипов одного растения. Например, АБК в низких концентрациях стимулировала образование эмбриоидов у одних изученных сортов пшеницы и подавляла у других (Shimada et.al., 1989).

Способ действия фитогормонов, по-видимому, заключается в том, что они в качестве эффекторов взаимодействуют с регуляторными субъединицами в мембранах и с регуляторными белками генного аппарата.

В настоящее время известно пять групп соединений, относящихся к фитогормонам. Это ауксины, цитокинины, гиббереллины, абсцизины и этилен. Между этими физиологически активными веществами существуют многообразные связи. Действие всех фитогормонов на растение поливалентно. Все они действуют на рост и деление клеток, на процессы старения и адаптации, на транспорт веществ, дыхание, синтез нуклеиновых кислот, белков и другие процессы. Однако у каждой группы фитогормонов имеются и свои специфические особенности. Например, ауксины индуцируют корнеобразо-вание, а цитокинины - образование стеблевых почек. Гиббереллины оказывают специфическое влияние на удлинение стеблей, черешков и жилок. В то же время, нельзя сказать, что у растений есть узкая специализация деятель-

56 ности гормонов. Для регуляции различных физиологических и морфогенети-

ческих процессов используются одни и те же фитогормоны, но в различных

сочетаниях и соотношениях (Кулаева, 1982).

Наиболее важными фитогормонами, необходимыми для индукции морфогенеза, являются ауксины и цитокинины.

В качестве ауксинов, которыми являются производные индола, для получения и поддержания культур тканей используются: природный ауксин -гетероауксин, или индолилуксусная кислота (ИУК), а также его синтетические аналоги - индолилмасляная (ИМК), нафтилуксусная кислота (НУК), 2,4-дихлорфеноксиуксус-ная кислота (2,4-Д) и др.

Ауксины влияют на деление, растяжение и дифференцировку клеток. Ауксин прежде всего необходим для инициации репликации ДНК (Дмитрие-ва,1972, 1973; Полевой, 1986).

Индолил-3-уксусная кислота (ИУК) - белое кристаллическое вещество с молекулярной массой 175,19 и температурой плавления168-169 С (с разложением). На свету быстро темнеет. Максимум поглощения находится в области 279 нм. ИУК хорошо растворима в метиловом, этиловом и других спиртах, в серном эфире и этилацетате. Плохо - в воде, бензоле и хлороформе, лучше растворяется в горячей воде. Калиевая соль ИУК хорошо растворима в воде. ИУК быстро разлагается в кислой среде и при наличии окислителей, например, перекиси водорода. В щелочной среде она более стабильна (Полеюй, 1986).

К группе цитокининов относятся N - замещенные производные адени-нина: кинетин, 6 - бензиламинопурин (БАП), зеатин и другие.

Еще в 1955 году F.Skoog, C.Miller (1957) установили, что добавление в питательную среду эфирного экстракта длительно хранящегося препарата ДНК животного происхождения стимулирует деление клеток, а также рост стеблевого каллуса табака и изолированной сердцевинной паренхимы стебля табака. Активный компонент был выделен и назван кинетином.

57 Кинетин - белое кристаллическое вещество с молекулярной массой

215,2. В водном растворе имеет максимум поглощения 267 нм и минимум 234,5 нм. Кинетин слабо растворим в воде и хорошо - в этаноле, серном эфире, растворах щелочей и кислот. Кинетин устойчив к нагреванию, автоклави-рованию, действию щелочей и кислот.

Зеатин и его производные широко распространены в растениях. Соотношение этих соединений у различных объектов различно. Показано, например, что зеатинрибозид является основным цитокинином кокосового молока. Поскольку биологическая активность рибозид - и риботидпроизводных зеа-тина ниже, чем у зеатина, наличие их в растениях рассматривают как способ регуляции уровня цитокининовои активности тканей. На это, указывает, в частности, тот факт, что вводимые в ткани цитокинины превращаются в формы рибозидов и риботидов. По-видимому, рибозид- и риботидпроизвод-ные цитокининов могут служить транспортными или запасными формами. Из других производных зеатина у растений обнаружены дигидрозеатин, ри-бозил-транс-зеатин, рибозид-цис-зеатин, мезо-рибозилзеатин-рибофурано-зилзеатин (Полевой, 1986).

Цитокинины играют важнейшую роль в процессе дедифференцировки, индуцируя переход клеток к митозу и цитокинезу.

Деление клеток, как правило, не индуцируется одним цитокинином или одним ауксином, лишь определенное сочетание обоих гормонов приводит к их активному делению клеток. Установлено, что начальные стадии процесса индуцируются ауксином, а затем необходимо присутствие обоих гормонов (Дмитриева, 1972).

Интересные результаты получены Дмитриевой Н.Н. (1973) при исследовании дедифференциации клеток сердцевинной паренхимы стебля табака. Выявилась временная последовательность действия гормонов в цикле индуцируемого клеточного деления. Было показано, что ранние изменения в интенсивности синтеза РНК и начало синтеза ДНК протекают одинаково как

58 при добавлении обоих гормонов - ауксина и кинетина, так и при добавлении

только одного ауксина. Добавление к питательной среде в тех же условиях одного кинетина не вызывает изменений в синтезе нуклеиновых кислот по сравнению с контролем на среде, не содержащей гормонов. Клетки, находящиеся на среде с обоими гормонами, начинают делиться и образуют каллус-ную массу, тогда как на среде, содержащей один ауксин, клетки, подготовленные к делению прошедшими синтезами РЕК и ДНК, в митоз не вступают. Блокированные отсутствием кинетина в синтетическом периоде цикла, клетки переходят к росту растяжением. Таким образом, именно кинетин может считаться триггером, определяющим переход подготовленной действием ауксина клетки растения к делению или росту. Очевидно, цитокинины определяют синтез специфических РНК и белков, необходимых для перехода клетки к митозу и завершению деления.

Специфической особенностью цитокининов, их органогенным эффектом является индукция образования стеблевых почек. Помимо этого, цитокинины снимают апикальное доминирование, нарушают покой и стимулируют рост покоящихся органов, индуцируют развитие пазушных почек, регулируют рост соматических зародышей, замедляют старение органов и повышают их устойчивость к неблагоприятным условиям внешней среды (Ку-лаева,1973). В культуре тканей цитокинины необходимы для дифференциации стеблевых почек из клеток эксплантов. Таким образом, для образования корней неоходим сдвиг соотношения концентраций ауксин-цитокинин в сторону ауксина, а для закладки стеблевых почек - в сторону цитокинина.

Ауксин 2,4-Д в культуре клеток и тканей используют как в качестве единственного индуктора новообразований, так и вместе с другими стимуляторами роста (Borkird et al., 1986; Barnabas, 1989). Столь широкое применение обусловлено тем, что 2,4-Д является сильным дедифференциатором.

Многими исследователями изучена роль 2,4-Д как синтетического гормона аукси-нового типа. Так, в результате изучения действия ауксина 2,4-Д на морфогенез в культуре

59 пыльников ячменя было установлено, что количество образующихся каллусов увеличивалось по мере возрастания концентрации 2,4-Д в среде для индукции; однако увеличение концентрации 2,4-Д приводило к снижению веса каллусов (Тивари, Рахимбаев, 1989). Влияние концентрации экзогенного 2,4-Д на индукцию конкретного пути морфогенеза изучено и в культуре пыльников пшеницы: Пониженные концентрации этого гормона стимулировали эмбриоидогенез, тогда как повышенные - каллусогенез (Горбунова, 1993). О важной роли 2,4-Д в индукции андрогенеза in vitro у гексаплоидной пшеницы сообщается в работе Moieni et al., (1996). Исключение из среды этого гормона (при сохранении других гормонов) вело к отрицательной реакции на условия культивирования пыльников всех изученных генотипов. В то же время, добавление к среде 2,4-Д при культивировании пыльников белены вело скорее к образованию недифференцированных каллусов, чем нормальных биполярных эмбриоидов; образования регенератов достигали только после переноса каллусов на среду без ауксина (Corduan, 1975). Введение 2,4-Д в виде раствора в стебель тритикале в фазе мейоза микроспороцитов и в фазе вакуолизированной микроспоры вело к значительному увеличению выхода андрогенных новообразований (Носова, 1993).

При культивировании пыльников ряда растений предложено использовать нетрадиционные в культуре тканей и клеток фитогормоны, такие, как этилен. Этот гормон в культуре пыльников Solanum carolinense L. сам по себе не индуцировал каллусогенез, но в смеси с ауксином снижал процент кал-лусогенеза (Reynolds, 1989). К числу нетрадиционных фитогормонов относится также ауксин ФУК - фенилуксусная кислота. Изучая влияние ФУК на регенерацию растений в культуре пыльников пшеницы и ячменя, исследователи установили, что этот ауксин незначительно увеличивал выход зародышей, но заметно снижал количество альбиносов среди регенератов (Ziauddin et. al., 1992); однако на тех же объектах другие исследователи не выявили индуцирующей андрогенез in vitro роли ФУК (Moieni, et al., 1996).

Рядом авторов показано значительное повышение эффективности регенерации растений из каллусов пыльцевого происхождения у пшеницы при

60 добавлении в среду практически не используемой в культуре тканей ГК

(гибберелловая кислота) вместо традиционно используемых НУК и кинетина

(Zhou et. al., 1989). Однако в работе (Moieni A., Sarrafi А., 1996) сообщается

об уменьшении количества образовавшихся эмбриоидов и зеленых регене-

рантов (при увеличении количества альбиносных регенерантов) в культуре

пыльников гексаплоидной пшеницы при введении в состав среды ГК.

Установлено комплексное воздействие фитогормонов на индукцию морфогенеза в культуре пыльников in vitro. Так, при совместном применении 2,4-Д и зеатинрибозида в культуре пыльников ячменя наблюдалось значительное увеличение образования каллуса; добавление в среду только 2,4-Д немного увеличивало частоту образования каллуса, тогда как применение только зеатинрибозида в невысоких концентрациях не влияло на этот процесс, а в высоких - подавляло образование каллуса (Ye et. al., 1985). У этого же объекта усиление индукции каллусогенеза и регенерации зеленых растений в культуре пыльников достигалось применением ГК совместно с бензи-дазолом (Гурецкая, 1998). Увеличение количества образовавшихся эмбриоидов и зеленых регенерантов при совместном введении в состав среды 2,4-Д и ГК отмечено и в культуре пыльников гексаплоидной пшеницы (Moieni et al., 1996). Тем не менее, в работе Sopory S.K., Maheshwari S.C. (1975), посвященной именно вопросу изучения одиночного и комплексного действия фитогормонов (ауксинов, гиббереллинов, цитокининов) на развитие пыльцевых эмбриоидов Datura innoxia, сделан вывод о том, что комбинация гормонов не ведет к увеличению ответной реакции пыльников на условия культивирования по сравнению с применением этих гормонов в отдельности.

Кроме фитогормонов многие исследователи для получения первичной пролиферации ткани в культуре и для поддержания интенсивного недифференцированного роста ткани в пассажах добавляют к питательной среде эндоспермы из незрелых плодов и семян разных растений. Чаще всего, для этой цели применяют эндосперм кокосового ореха, конского каштана, грец-

кого ореха, кукурузы и пшеницы. Широко применяют солодовый и дрожжевой экстракты. Наибольшим стимулирующим действием обладают незрелые эндоспермы ряда растений (Touraev et al., 1996 a,b,c), а экстракты из незрелых семян и органов угнетают рост культуры тканей.

При культивировании изолированных пыльников используют также способ кондиционирования питательных сред с помощью тех органов, которые затем будут культивироваться. В случае кондиционирования питательных сред изолированными пыльниками, их культивируют в течение 5 дней, затем удаляют, снова стерилизуют и инокулируют исследуемые образцы (Тураев, 1998).

Таким образом, гормоны являются также неотъемлемым компонентом культуральной среды. При культивировании изолированных тканей и органов растений используются экзогенные фитогормоны в различных сочетаниях. Изменяя их концентрацию, исследователю удается направить развитие культивируемых эксплантов в нужном русле, так как фитогормоны способны обеспечить рост большинства растительных тканей и индуцировать в них многообразные морфогенетические изменения. При этом между эксплантом и экзогенными фитогормонами могут возникнуть различные уровни взаимодействия: интерференция, подавление и/или усиление действия. Таким образом, результат применения экзогенных фитогормонов зачастую может зависеть от вида растительного материала, что может быть связано с интерференцией экзогенных и эндогенных гормональных факторов. Этот вопрос, также как и многие другие аспекты гормональной регуляции, остаются сла-боизученными по ряду причин. Во-первых, существуют методические трудности количественного определения фитогормонов. Имеющиеся методы очень трудоемки и требуют больших навесок исследуемого материала.

Во-вторых, сложность изучения гормональной регуляции морфогенеза связана также с интегральным характером морфогенетических процессов, их зависимостью от многих внешних и внутренних факторов (Бутенко, 1984).

Важность дополнения минеральной среды фитогормонами для индукции андрогенеза in vitro в культивируемых пыльниках различных растений показана многими исследователями. Помимо использования общепринятых в практике культивирования клеток, тканей и органов сред МС (Murasige, Skoog, 1962), Блейдса, (Blades, 1966), В₅ (Gamborg, Eveleng, 1968) были подобраны и испытаны специальные среды для культивирования пыльников -N₆ (Chu, 1975; Chu, 1978; Reddy, et al., 1985; Tsay et al., 1986; Schumann, 1987a,b), варианты среды Potato II (Chuang, Quang, 1978) и другие.

При сравнении сред МС и ~N₆ на примере культивирования пыльников риса в каждую из них для получения каллусов добавляли 2,4-Д, для регенерации растений из каллусов - кинетин и ИУК; показано, что среда N _б намного эффективнее для формирования каллусов, тогда как среда МС благоприятнее для регенерации растений (Bojadjiv et. al., 1988). Наиболее подходящей средой для образования каллуса при культивировании пыльников риса (подвид japonica) оказалась среда МС с добавлением НУК и кинетина; для регенерации растений рекомендуется среда МС, дополненная НУК и кинетином вдвое меньшей концентрации (Chen, Tsay, Huang, 1986). В пыльниках красного каштана образовывались пыльцевые зародыши и растеньица при культивировании на среде МС, содержащей различные концентрации 2,4-Д и кинетина; при этом наибольшее количество эмбриогенных пыльников получили на среде с равными концентрациями ауксина и кинетина (Radojevic et. al., 1989). Для культивирования пыльников гексаплоидных тритикале использовали 7 питательных сред с добавлением 2,4-Д и кинетина к основной питательной среде Ыб.Установлено, что морфогенез в значительной степени зависел от добавления фитогормонов: наиболее активный эмбриогенез отмечен на среде N6 с добавлением кинетина (Schumann, 1987,a,b). Введение ауксина или комбинации ауксина и кинетина в среду МС при культивировании пыльников ряда пасленовых (табака (Sunderland, Wicks, 1971), дурмана (Narayanaswamy, Chandy, 1971; Geier, Kohlenbach, 1973), красавки (Rashid,

63 Street, 1973)) также ведет к развитию части пыльцевых зерен в эмбриоиды.

На пасленовых же детально изучена ответная реакция пыльников на каждый из вводимых в состав питательной среды цитокининов - кинетин, зеатин, зеатинрибозид; установлено, что только зеатинрибозид увеличивал продуктивность пыльников, а у картофеля показано, что существует два разных пути андрогенеза, которые определяются типом ауксина, присутствующим в питательной среде (Reynolds, 1986).

Кроме сред МС и N₆, исследователи используют для культивирования пыльников иные среды с и другие составом фитогоромонов: модифицированную среду Гамборга-В₅, содержащую БАП, ИУК, НУК, кинетин и 2,4-Д (Chua, Chen et. al., 1984), модифицированную среду В₅, содержащую БАП и 2,4-Д (Govil et.al., 1986), или среду В₅ с добавлением НУК (Phippen et.al., 1990), среду 85D12 с добавлением одного из ауксинов и кинетина (Hassawi et. al., 1990), а также среды без специальных названий, но также содержащие различные модификации гормональных добавок (Гурецкая, 1998; Moieni, Sarrafi, 1996 и мн. др.).

Такие замены для ряда видов оказываются оправданными. Например, в работе, посвященной изучению роли фитогормонов в культуре пыльников ячменя, авторы сообщают о влиянии на частоту индукции новообразований и выход регенерантов не только модифицированного гормонального состава среды, но и гормональной предобработки колосьев донорных растений (Гурецкая, 1998). Однако, например, в культуре пыльников капусты добавление БАП к среде не оказало полезного влияния на образование зародышей; интересно, что зеленые регенераты в этих экспериментах формировались главным образом на безгормональной среде (Lillo et.al., 1987). Об отсутствии необходимости гормонов для индукции андрогенеза in vitro сообщается и в работах, посвященных культуре пыльников кукурузы (Tsay et.al., 1986), пшеницы (Горбунова, 1993), белены (Raghavan, 1975) и перца (Тюкавин,1993). Так, при культивировании пыльников белены на простой минеральной среде

64 без регуляторов роста у небольшой части пыльцевых зерен начинаются ми-

тотические деления, ведущие к формированию эмбриоидов, которые внутри гнезда пыльника, до выхода на верхность в виде проростков, повторяют нормальные стадии развития зиготических зародышей. Не требовались гормоны и в случае образования вторичных эмбриоидов из первичных эмбриоидов, полученных в культуре пыльников рапса; однако побеги на вторичных эмбриоидах начинали образовываться после переноса их на питательные среды с добавлением кинетина или кинетина и ИУК (Loh et.al., 1983).

С другой стороны, уровень ауксина 2,4-Д оказывает влияние и на генетическую стабильность растений-регенерантов, концентрация 1мг/л является наиболее оптимальной. Некоторые исследователи рекомендуют добавлять в индукционные питательные среды кинегин в концентрации 0,5 мг/л (Ouyang, 1986). Его роль сводится к ингибированию формирования каллуса из связника.

В то же время при культивировании пыльников кукурузы японских сортов исследователи не наблюдали существенных различий в процессах эмбриоидо- и каллусогенеза при использовании сред с различным гормональным составом (Koinuma et. al., 1990).

Для получения растений-регенерантов цветной капусты пыльники 11 гибридных сортов культивировали на основной среде В₅ с добавлением НУК; показано, что генотипы отличались значительно в отношении выхода зародышей (Phippen et al., 1990). Только от генотипа зависела и частота регенерации зеленых растений в культуре пыльников пшеницы, состав среды на этот показатель не влиял (Shimada et al., 1989). Более того, известны публикации, в которых указывается на неотзывчивость к условиям культивирования пыльников некоторых сортов злаков на всех испытанных средах и во всех изученных вариантах исследования (Горбунова, 1993; Горбунова, Круглова, 1994; Koinuma et al., 1990).

Количество исследований, посвященных влиянию экзогенных фито-гормонов определенной концентрации на пыльники, содержащие микроспо-

65 ры/пыльцевые зерна той или иной фазы развития, достаточно ограничено.

Например, на примере томатов было показано, что высокие концентрации фитогормонов в среде при инокуляции пыльников, содержащих микроспоры в фазе мейоза, усиливали каллусогенез, в фазе одноядерных микроспор - эм-бриоидогенез. Таким образом, авторы обнаружили фазоспецифичное действие фитогормонов на процессы, происходящие в культивируемых пыльниках, установили, что если направление процесса клеточных дифференциро-вок зависит от фазы развития, то его темп определяется гормональными факторами, причем стимулируется доминирующий процесс (Нгуен Т. Д., Шами-на, 1978). V.Raghavan (1978) культивировал пыльники белены разных стадий развития на среде из минеральных солей и сахарозы с добавлением ауксина 2,4-Д. Установлено, что добавление 2,4-Д усиливало эффективность культивирования пыльников, но не влияло на количество эмбриогенных пыльцевых зерен, дававших начало каллусу. Однако автор не сообщает о влиянии стадии развития пыльника (и, соотвественно, фазы развития пыльцевого зерна) белены на индукцию каллусогенеза.

Данные, полученные при культивировании целых пыльников, некоторые исследователи сравнивают с данными, полученными при культивировании изолированных микроспор или пыльцевых зерен. Например, для сравнения эмбриогенной способности культур микроспор и пыльников у капусты были использованы различные фитогормоны; установлено, что по образованию зародышей культура микроспор оказалась в 10 раз эффективнее культуры пыльников (Siebel et al., 1989). Однако в целом, несмотря на эффективность, метод культуры изолированных микроспор/пыльцевых зерен не получил большого распространения, по-видимому, в силу своей трудоемкости и частых неудач. Высказано предположение, что неудачи при культивировании микроспориальных или пыльцевых культур обусловлены несовершенством методов, а не с отсутствием генов, детерминирующих способность к пролиферации in vitro (Lichter, 1989).

В последнее время в литературе появились интересные публикации, посвященные молекулярно-биологическим аспектам культивирования пыльников и зависимости их от фитогормонов. Например, в работе (Wilen et al., 1990) сообщается об изучении влияния АБК на регуляцию экспрессии генов запасных белков в эмбриоидах рапса, полученных из микроспор. Реакция на АБК была стадиеспецифичной: максимальные уровни мРНК для запасных белков наблюдались на стадии торпедо. Обработанные АБК эмбриоиды накапливали гормон очень быстро, максимальная концентрация АБК отмечена через 24 ч, но через 72 ч концентрация АБК понижалась до исходных уровней.

Таким образом, зависимость морфогенеза в культуре изолированных пыльников от фитогормонального состава среды и фитогормональных особенностей экспланта можно считать достоверно установленной.

В последние годы накоплен огромный фактический материл о действии фитогормонов на разных этапах культуры изолированных клеток, тканей и органов, в том числе пыльников. Сделаны важные обобщения, позволяющие приблизиться к пониманию физиологических и цитолого-гистологических особенностей процесса морфогенеза in vitro.

Однако нерешенных проблем еще немало. Например, в недостаточной степени изучены молекулярные механизмы действия фитогормонов. Выделение гормонсвязывающих белков, поиск гормональных рецепторов - первые шаги в изучении начальных этапов гормонального действия. Наибольший прогресс достигнут в этой области в исследовании действия ауксинов, для которых были выделены и охарактеризованы ауксинсвязывающие белки, являющиеся, как считается, истинными первичными рецепторами ауксина в растительной клетке; показано, что ряд известных мутаций по чувствительности к ауксину (например, мутация diageotropica у томата) связан с изменениями в спектре ауксинсвязывающих белков; подобные связывающие белки находятся в стадии интенсивного изучения и для других гормонов (по Коваленко, 1993). Для ауксинов же показано их участие в регуляции экспресии генов бактерий и растений (Кацы,1997).

Несомненно, что в процессе перепрограммирования клеток и детерминации их к морфогенезу важную роль должны играть процессы перестройки цитоскелета, которому в настоящее время придают большое значение, не исключая даже функцию рецепции и передачи информации между клетками (Медведев, 1996).

При морфогенезе in vivo экспрессируются гены, кодирующие белки, связанные с определенными этапами развития зародыша. Важная роль фито-гормонов в этом процессе очевидна. Это положение начинает получать экспериментальную поддержку: на примере кукурузы проведен анализ множественных классов генов, реагирующих на АБК в процессе эмбриогенеза (Beaumont et al., 1995). Было бы чрезвычайно интересно изучить этот вопрос при морфогенезе в культуре изолированных пыльников.

Многое остается неясным и в процессах детерминации развития микроспор по спорофитному пути. Такие понятия, как сигналы и индукторы, их природа и специфичность, приобретение и потеря компетентности клетками не имеют пока точных характеристик. Предполагается участие внеклеточных гаметофитных белков в регуляции морфогенеза микроспор in vitro (Meins, 1985).

Еще одно перспективное, на наш взгляд, направление дальнейших исследований - изучение иммунолокализации фитогормонов в микроспорах культивируемых пыльников как в момент инокуляции их на питательную среду, так и в процессе морфогенеза и регенерации растений. Использование специфических антител к гормонам при морфогенезе in vitro в культуре изолированных пыльников позволит по динамике их изменения прогнозировать пути морфогенеза. Кроме того, иммунохимическии подход, основанный на фило- и онтогенетической оценке специфичности антигенных детерминант, открывает возможность решать в единой концепции биологического узнавания как фундаментальные, так и прикладные проблемы физиологии растений, биохимии, генетики, селекции, а это в свою очередь создает основу для развития соответствующих направлений фитоиммунобиотехнологии (Воло-

68 дарский, 1994).

Разрабатывается и такое интересное направление, как исследование кинетики роста и динамики гормональных градиентов на модельных многоклеточных структурах растительного типа - компьютерных растениях (Романов, Суховеров, 1997).

Можно надеяться, что новые идеи и применение все более совершенных аналитических методов помогут исследователям ответить на вопросы, которые пока не имеют ответа.

1.5. Эффективность морфогенеза и регенерации растений в культуре изолированных пыльников яровой мягкой пшеницы

Оценка продуктивности морфогенеза и регенерационной способности генотипов в культуре изолированных пыльников наталкивается на ряд трудноразрешимых проблем. Наиболее существенной из них является, на наш взгляд, невозможность сопоставления результатов, полученных разными авторами. Причиной тому является отсутствие единой технологии культивирования изолированных пыльников. Поэтому анализ имеющейся литературы по этому вопросу затруднителен.

В литературе имеется мнение о том, что андроклиния зачастую приводит к генетическим изменениям, что выражается в возникновении анеушюи-дов, миксоплоидов и растений разной плоидности. Важным является вопрос о причинах возникновения растений с разной плоидностью в культуре пыльников. Одна из очевидных причин заключается в том, что теоретически, образование каллуса и растений-регенерантов может происходить не только из гаплоидной микроспоры и/или пыльцевого зерна, но и из соматических клеток пыльника. На практике, пролиферации соматических клеток пыльника возможно избежать, изменяя концентрацию фитогормонов в культуральной среде. Наиболее частые и значительные изменения в числе хромосом, приво-

дящие к анеуплоидии и полиплоидии, наблюдаются в том случае, когда из

пыльцы первоначально образуется каллус (Суханов, 1983).

Установлено, что эндоредупликация и слияние ядер на начальных стадиях эмбриоидогенеза являются основными причинами появления растений, различающихся по плоидности. В частности, показано, что при культивировании пыльников на стадии одноклеточных микроспор плоидность проэм-бриоидов меняется в результате репликации ДІЖ и слияния ядер после первого митоза (Sunderland, 1971). Имеются сведения о том, что при инокуляции пыльников на стадии поздней микроспоры, ядра которой находятся на G₂ стадии клеточного цикла, перед митозом, может произойти вторая репликация ДНК. Из таких микроспор в дальнейшем развиваются диплоидные растения (Wenzel, 1975). Теоретически, полиплоидные растения, возникающие из гаплоидных микроспор путем эмбриоидогенеза, сопровождающегося эн-доредупликацией и слиянием ядер, должны быть гомозиготными и в дальнейшем не расщепляться. Еще одной причиной появления диплоидных растений является их возникновение из нередуцированных микроспор, как это было установлено у ржи (Wenzel., 1975).

Следует заметить, что диплоидизация клеток может осуществляться и на разных этапах онтогенеза андроклинных растений. Цитологический анализ 26 альбиносных и 62 хлорофильных растений ячменя выявил, что у молодых растений встречаются только гаплоидные клетки, а в более развитых обнаруживаются клетки с диплоидными и анеупло-идными наборами хромосом. В растениях, находящихся на стадии 2-6 побегов, в большинстве изученных метафаз было установлено диплоидное число хромосом (Суханов, 1983).

Поэтому проблема генетической стабильности и селекционно-генетической оценки удвоенных андроклинных дигаплоидных линий растений остается животрепещущей. Обширные исследования потомств растений, полученных из микроспор и/или пыльцевых зерен у ряда важных сельскохозяйственных растений были проведены в Китае. У риса, пшеницы и табака

70 диплоидные потомства андроклинного происхождения в полевых условиях

сравнивали с их исходными сортами. Коэффициент вариации по хозяйственно важным признакам либо был сходен, либо был несколько ниже у по-томств андроклинных растений. Обобщенные многолетние результаты исследований, полученные Ни et al. (1987), показывают, что 90% дигаплоидньгх линий были генетически однородными и гомозиготными и только у 10% по-томств наблюдалось расщепление. На большом экспериментальном материале доказана генетическая (в данном случае - хромосомная) стабильность соматических клеток андроклинных линий как в первом, так и в последующих поколениях (Buyser et al., 1984; Ни, 1986; Ни et al, 1987, 1990). Эти результаты позволяют рассматривать метод получения гомозиготных линий в культуре изолированных пыльников как важную теоретическую основу селекции. Однако накопилось много данных о появлении в популяции расте-ний-регенерантов гаметоклональных вариантов (Evans et al., 1984). Феноти-пически эти различия проявились в изменении сроков колошения, высоты растения, устойчивости к болезням, урожайности и массы 1000 зерен (Park et al., 1976; Reinbergs et al., 1978; Baenziger et al., 1983; Friedt et al., 1983; Powell et al., 1984; Buyser et al., 1985, 1987,1989).

Как стабильность, так и генетическая гетерогеность андроклинных растений важны для создания исходного селекционного материала, а также материала для генетической инженерии. Учитывая, что андроклинные растения возникают вследствие отклонений от гаметогенеза, можно было бы предположить, что у андроклинных растений частота нарушений в пыльниках может быть повышенной. Однако на практике такого явления не наблюдается. При изучении гомозиготных растений, полученных из пыльников различных сортов пшеницы, микроспоры в пыльниках оказались нормальными. И только у андроклинной линии "REX" с цитоплазматической мужской стерильностью наблюдали дополнительные деления ядер в пыльце in vivo, обусловленные, как полагают авторы, влиянием цитоплазмы Triticum

71 timopheevi. Таким образом, генотипический и фенотипический полиморфизм

андроклинных растений является также следствием и комбинативной, и мутационной изменчивости (Ни et al., 1987).

С другой стороны, потомство растений андроклинного происхождения как правило, характеризуется выравненностъю признаков (Внучкова и соавт., 1990). Существует связь между конкретным методом получения андроклинных растений и их генетической стабильностью. В тех случаях, когда метод включает промежуточную стадию каллусоге-неза, генетическая изменчивость усиливается соответственно с увеличением длительности этой стадии. Эмбриоидогенез коррелирует с относительно большей генетической стабильностью.

Происхождение гаметоклональной изменчивости не совсем объяснимо. Этому явлению способствуют все факторы, воздействующие на эксплант при культивировании in vitro (Kudirka et al., 1986). Гаметоклональную изменчивость обусловливают хромосомальные и молекулярно-генетические процессы, такие как увеличение плоидности, анеуплоидия, разрывы хромосом (Ни et al., 1982; Fried et al., 1983; Kudirka et al., 1983; De Buyser et al., 1985; Charmet et al., 1986), делеции в хлоропластной ДНК (Day et al., 1985),, появление гетероморфных бивалентов в метафазе мейоза 1 у андроклинных дигаплоидных линий (Marburger et al., 1989).

Причиной такого разнообразия нарушений могут быть использование высоких экзогенных концентраций гормонов в культуральной среде для индукции каллусогенеза и применение колхицина для получения дигаплоидов. Результаты этих воздействий сказываются и при сравнительной оценке селекционных линий. В целом, однако, колхицинирование не оказывает отрицательного влияния на проявление признаков.

Тем не менее, использование метода культуры изолированных пыльников с последующим колхицинированием регенерантов в генетических и селекционных исследованиях дает исследователю большие преимущества перед традиционными методами селекции в ускорении получения гомози-

72 готных форм. Показано, что коэффициент корреляции между числом колхи-

цинированных гаплоидных и числом удвоенных фертильных растений очень высок. Этот прямой эффект удвоения числа хромосом положительный и высокозначимый (г = 0,96). Однако, существует и непрямой эффект этого воздействия, который проявляется в сильном депрессивном состоянии растений после обработки гаплоидных проростков колхицином (Devaux, 1989). Однако этот вопрос сейчас оспаривается и предлагается метод ОСП (одно семя с растения на потомство, или single seed descent - SSD) как альтернативный способ ускоренного перевода гетерозиготных генотипов в гомозиготные линии. В.А.Крупнов (1989) приводит сравнительный анализ методов АДГ и ОСП. Основной довод, выдвигаемый им в пользу ОСП - незначительные, по сравнению с андроклинной технологией, затраты на получение гомозиготных линий у яровых злаков.

Исследования, проведенные В.А.Пухальским (1992), показывают также, что при SSD методе растения 7-го - 8-го поколений более гомозиготны, чем растения АДГ-линий. В то же время ими установлена неравнозначность отбора методом SSD частоты доминантных и рецессивных генов.

В публикациях зарубежных исследователей также указывается на трудоемкость и малоэффективность метода АДГ для широкого использования в качестве единственного метода селекции пшеницы. Тем не менее, высказываются оптимистические предположения о возможности использования метода АДГ. Это может приозойти, если усовершенствовать технологию, как культивирования изолированных пыльников, так и получения гомозиготных удвоенных андроклинных растений.

Селекционную оценку дигаплоидных линий проводят обычными методами, используемыми в селекционно-генетических исследованиях. Исследователи отмечают, что объем выборки у линий АДГ может быть значительно меньшим, чем при оценке исходных популяций, за счет низкой гамето-клональной изменчивости (Benziger et al., 1989).

Ценность конкретной андроклинной дигаплоидной линии определяется в сравнении со всеми линиями, полученными у данного генотипа. В селекционно-генетической практике андроклинные дигаплоидные линии могут использоваться как компоненты скрещивания, т.е. в качестве исходного материала при решении конкретных задач и могут явиться родоначальниками новых сортов. Наибольшее практическое применение метод культуры изолированных пыльников нашел в Китае, где за короткий срок с использованием метода андрогенеза in vitro создано более 20 сортов риса, озимой и яровой пшеницы, кукурузы (Ни, 1986). При этом было показано, что даже при незначительных объемах культивирования (всего около 400 пыльников) можно получить такой же большой спектр рекомбинативной изменчивости, как и при традиционной селекции (Ни, 1987). Во Франции создаются сорта озимой пшеницы с высокой гомозиготностью линий, что не мешает им конкурировать с ранее созданными сортами (Buyser et al., 1987). Особую ценность представляют гомозиготные андроклинные дигаплоидные линии при использовании их в рекуррентной селекции для повышения селекционной ценности популяции (Galais, 1990) и получения чистых линий (Размологов, Пухальский, 1979), ускоренного получения гомозиготных форм у сложных гибридных комбинаций (Внучкова и соавт., 1993). Культура изолированных пыльников становится хороршей модельной системой для фундаментальных исследований при получении и изучении мутантных форм, а так же в экспериментах по генетической трансформации ДНК растений (Ни et al., 1990)

Использование дигаплоидных линий гибридов первого поколения для генетического анализа позволяет также оценивать эффекты сложно наследуемых генов, в частности, генов полукарликовости Rhtl и Rht2, и оценить их вклад в общую продуктивность растений (Inagaki et al., 1992).

Исследованиями В.А.Внучковой с сотр. (1993) показано, что АДГ-линии, при умелом подборе исходных пар для скрещивания, могут превос-

74 ходить родительские формы не только по продуктивности, но и по качеству

и количеству белка.

Наибольших успехов в нашей стране по практическому применению андрогенеза

in vitro у яровой мягкой пшеницы достигли в лаборатории клеточной селекции НИИСХ

Юго-Востока под руководством ТЛДьячук За 1986-90 гг. ими передано в лабораторию

селекции и семеноюдства того же института более 900 андрогенных линий, из которых

более 30 % отобраны для дальнейших селекционно-генетических исследований (Кузь-

менко с соавт., 1990).

Влияние условий культивирования на эмбриоидогенез в культуре изолированных пыльников яровой мягкой пшеницы

В многочисленных исследованиях выявлены факторы, способствующие увеличению доли морфогенных микроспор в условиях in vivo и in vitro. Важнейшие из них - генотип донорных растений, условия выращивания до-норных растений (температурный и световой режимы), стрессовые воздействия на донорные растения в условиях in vivo или на изолированные пыльники в условиях in vitro, обработка донорных растений гаметоцидами, состав питательной среды для культивирования пыльников (Heberle-Bors, Reinert, 1981; Rashid, Reinert, 1981a,b,c; Heberle-Bors, 1983; Лукьянюк, Игнатова, 1986; Ouyang, 1986; Hu, Huang, 1987; Sangwan, Sangwan-Norreel, 1987; Внуч-кова, Чеботарева, 1990; Touraev et al., 1996 a,b,c) и многие другие условия.

Как известно, частота проявления андроклинии у разных сортов зависит как от внутренних - генотипических и эпигенетических условий, о которых говорилось выше, так и от внешних, паратипических. К паратипическим предпосылкам относятся: сезон года выращивания растений, состав питательной среды, температурные воздействия до и после инокуляции пыльников на питательные среды, фотопериод и длина волны освещаемого света при использовании исскуственного освещения. Для увеличения выхода гаплоидных растений используют различные типы воздействий на донорные растения, как в условиях вегетации, так и в условиях культивирования. Наиболее существенными и продуктивными являются следующие факторы: центрифугирование колосьев, облучение их %-лучами, обработка гормонами и воздействие на колосья пониженными положительными температурами. Последнее воздействие дало наибольший положительный эффект при эмбриои-догенезе в культуре изолированных пыльников и в силу этого, включается теперь как обязательный компонент технологии культивирования изолированных пыльников яровой мягкой пшеницы.

По мнению многих исследователей, воздействие низкими положительными температурами (3-7С) на изолированные соцветия донорных растений в течение 7-9 суток до инокуляции пыльников - принципиально важный момент в индукции андрогенеза in vitro у злаков. Однако единое мнение о механизмах индуцирующего действия холода в литературе отсутствует. Так, Сандерлэнд и соавт. (Sunderland et al, 1975) установили, что у ячменя низкотемпературный стресс способствует образованию большего, по сравнению с контролем, количества многоклеточных структур, дающих начало андроген-ным новообразованиям. При этом оказываются затронутыми все пути образования таких структур, ни одному из них не отдается предпочтения. Эти данные подтверждаются исследованием влияния холодовой предобработки на частоту индукции каллуса в культуре пыльников риса (Qu, Chen, 1983; Vasil, 1980), пшеницы (Wei, 1982; Lazar et al., 1985), тритикале (Schumann, 1986). Исследователями показано, что холодовая предобработка колосьев пшеницы способствует сохранению жизнеспособности эмбриогенных микроспор за счет снижения интенсивности дыхания пыльников (Heberle-Bops, Odenbach, 1985; Ouyang Jun-Wen, 1986).

Как полагает Суханов (1983), в данном случае устанавливается синхронность в развитии микроспор и пыльцевых зерен внутри одного пыльника и между пыльниками различных цветков одного колоска. Высказано предположение, что холодовая предобработка вызывает реориентацию веретена деления при первом митозе, что приводит к формированию микроспор с двумя равными ядрами - такие микроспоры обладают большим эмбрио-генным потенциалом (Nitsch, 1972). По данным Рэшида и Рейнерта (Rashid, Reinert, 1981a,b,c), эмбриоидогенные пыльцевые зерна табака отличаются от гаметофитных своей недодифференцированностью; вероятно, под влиянием холода подавляются процессы нормальной дифференциации пыльцевых зерен, что ведет к увеличению их эмбриоидо-генного потенциала. Высказано также предположение, что стрессовая холодовая предобработка приводит к подавлению гаметофитной транскрипции в микроспорах, стимулирует изменения в уровне эндогенных гормонов и в общей метаболической активности микроспор (Sunderland, 1982). Заслуживает внимания гипотеза, согласно которой действию холода приписывается либо выключение генов, либо ингибирование функции генных продуктов, ответственных за развитие микроспор по гаметофитному пути, что способствует переключению микроспор на спорофитный путь развития (Chen et al., 1986). Детальное изучение влияния предобработки холодом на культуру пыльников риса показало, что положительный эффект в данном случае связан с более длительным сохранением жизнеспособности стенки гнезда пыльников и взаимосвязей стенки с микроспорами, задержкой процесса дегенерации микроспор и пыльцевьк зерен, увеличением числа многоядерных и многоклеточных структур (Fang et al., 1985).

Известно также мнение исследователей о том, что нет необходимости низкотемпературной предобработки пыльников перед культивированием на искусственных питательных средах (Мс Gregor, 1990).

Кроме холода, эффективным фактором, влияющим на эмбриоидогенез в культуре изолированных пыльников, является воздействие на донорные растения гаметоцидами, вызывающими стерильность пыльцы на определенных фазах онтогенеза. Так, показано, что обработка пыльников донорных растений гаметоцидами (Picard et al., 1987; Внучкова и совт., 1990; Schmid et al., 1986а) или добавление их в питательную среду в сочетании с низкими концентрациями 2,4-Д (Schmid et al., 1986b), повышают продуктивность эм-бриоидогенеза in vitro у яровой пшеницы.

Методы культивирования изолированных пыльников

Предобработку срезанных колосьев перед инокуляцией пыльников на питательные среды проводили при пониженной положительной температуре (от +2 С до +4 С) в течение 5-10 суток. Для этого каждое срезанное растение в поле помещали в отдельную ячейку самодельного контейнера, который ставили в воду со льдом. В лаборатории контейнер переносили в холодильник с указанной выше температурой. При необходимости меняли воду и подрезали стебли растений, предотвращая их загнивание.

Организация работ для проведения исследований по культуре тканей требует особых лабораторных условий, которые подробно описаны в ряде классических работ (Бутенко, 1964; Калинин и соавт, 1980). В настоящее время, облегчающим моментом при проведении работ в стерильных условиях является наличие различных комфортных ламинарных боксов, создающих и поддерживающих стерильные условия работы.

Приготовление питательных сред Для приготовления питательных сред требуются реактивы высокой степени очистки (квалификация не ниже ч.д.а.)

В целях экономии времени макро- и микросоли готовили в виде концентрированных маточных растворов (х10 или х20 для макро- и хЮО для микросолей), которые хранили в холодильнике. Перед работой растворы проверяли на наличие осадка, загрязнения и видимой инфекции.

Маточные растворы солей кальция и железа готовили отдельно. 2,4-Д, НУК и ИУК растворяли в небольшом количестве спирта, цитокинины - в 0,5Н соляной кислоте, из расчета 1 мг в 1 мл раствора, доводя но нужного объема дистиллятом. Растворы дрожжевого и картофельного экстрактов готовили непосредственно перед экспериментом.

Для приготовления агаризованной питательной среды навеску агара заливали половинным количеством дистиллята и нагревали на водяной бане до полного его растворения. Последовательно сливали в одну колбу растворы макро- и микросолей, сахарозы, витаминов, гормонов, солей кальция и железа. рН среды перед автоклавированием - 5.7. В таблице 2.2 приведен состав основных питательных сред.

Горячую среду разливали в подготовленные пробирки, закрывали ват-но-марлевыми пробками или алюминиевой фольгой. Штативы с пробирками закрывали целлофаном, завязывали шпагатом и автоклавировали при 0,8 атм. (115-120 С) в течение 20 минут.

Стерилизацию колосьев вместе с листовой оберткой проводили диаци-дом и/или 70% спиртом и 3% перекисью Приготовление картофельного экстракта. 1. 200 г свежих картофельных клубней промыть водой, удалить проросшие глазки, разрезать на мелкие куски 2. Варить в 400 мл диет, воды в течение 30 минут. 3. Отжать мацерат через 2 слоя марли, отфильтровать и еще раз прокипятить 20 минут. 4. Жидкий экстракт собрать и сразу смешать с другими компонентами для приготовления 1 литра среды. Объем экстракта не должен превышать 45% от общего объема, включая воду, использованную при варке. Мы остановились на 20% содержании картофельного экстракта. Стерилизация объектов.водорода проточно. Стерилизатор удаляли трехкратной промывкой инокулируемого материала автоклавиро-ванной дистиллированной водой. Металлические инструменты и стеклянную посуду стерилизовали сухим жаром в сушильном шкафу или автоклавировали при 1,5 атм. в течение 30 минут. После стерилизации ламинарного бокса инструменты трижды обжигали в пламени спиртовки.

Инокуляция объектов в питательные среды.

В стерильных условиях ламинарного бокса проводили извлечение специальными стерильными инструментами пыльников из двух нижних цветков шести колосков средней части одного колоса.

Пыльники, извлеченные из двух нижних цветков 6-8 колосков средней части одного колоса, составляли единичную выборку. В одну биологическую пробирку помещали 18-24 пыльника, размещая равномерно по всей поверхности среды.

Индукция андрогенеза in vitro

Штативы с пробирками на 7 суток помещали в темноту при температуре 32С, затем культивирование продолжали также в темноте при температуре 27С до образования эмбриоидов или каллусов. Андрогенные образования появлялись через 28 - 30 дней с момента инокуляции пыльников.

Влияние цитоплазматической мужской стерильности

Для фиксации культивируемых пыльников яровой мягкой пшеницы и образующихся морфогенных структур использовали фиксаторы: Карнуа (Бродский, 1966), Чемберлена и FAA (Батыгина и др., 1974).

Пыльники, содержащие микроспоры, эмбриоиды, каллусы и корешки растений-регенерантов, помещали в мешочки с этикеткой, завязывали ниткой и помещали в фиксатор.

Состав фиксатора Карнуа: абсолютный этиловый спирт или его 96% раствор - 6 частей; хлороформ - 3 части; ледяная уксусная кислота - 1 часть.

Состав фиксатора Чемберлена: этиловый спирт - 50-70% раствор - 90 частей; формалин - 5 частей; ледяная уксусная кислота - 5 частей.

Состав фиксатора FAA: 70% этиловый спирт - 100 частей; формалин частей; ледяная уксусная кислота - 7 частей.

Методика для окрашивания веретена деления любезно предоставлена Шаминой Н.С.(неопубликованные данные), особенностью ее является необходимость предобработки микроспор перед фиксацией раствором кадмия.

Приготовление давленых препаратов

Фиксированный материал для исследований хранили в холодильнике (2-4 С) в фиксаторах Чемберлена и FAA. После фиксатора Карнуа объекты промывали в 96% растворе этилового спирта и хранили в 70 % растворе до окрашивания. Нами иногда использовался метод получения давленых временных препаратов и без применения фиксаторов. Материал также хорошо окрашивался. А результаты не отличались от результатов, полученных при использовании фиксаторов. Но в этом случае объект исследования нужно использовать сразу, это создает некоторые неудобства в работе.

Для исследования временных препаратов пыльники вынимали из мешочков, помещали на предметное стекло в каплю красителя (ацетокармин) и нагревали над спиртовкой до легкого кипения. Затем накрывали покровным стеклом и заостренной спичкой надавливали на объект исследования (Про-зина, 1960). Лишнее количество красителя удаляли фильтровальной бумагой. Полученные давленые препараты просматривали под микроскопом и осуществляли анализ. Полученные временные давленые препараты просматривались при помощи микроскопа NU-2 при увеличении объекта в 25х, 63х и под масляной иммерсией 100х при зеленом светофильтре.

Приготовление постоянных микротомных препаратов

Техника приготовления окрашенных микротомных препаратов для растений введена В. И. Беляевым. Объекты, предназначенные для таких ис следований, претерпевают сложную обработку. Последовательность обработки исследуемого материала такова (Юрцев, 1961; Паушева, 1974): 1. Подготовка материала. 2. Фиксирование материала. 3. Промывка фиксированного материала от фиксатора. 4. Полное обезвоживание промытого материала. 5. Пропитывание материала растворителями парафина (хлороформом, ксилолом или бензолом). 6. Пропитывание материала парафином. 7. Заливка материала в парафин. 8. Изготовление блоков из материала, пропитанного парафином. 9. Получение срезов при помощи микротома. 10. Наклейка срезов на предметные стекла. 11. Просушивание препарата при 40-45 С. 12. Удаление парафина из срезов ксилолом. 13. Удаление ксилола из срезов спиртом. 14. Удаление спирта дистиллированной водой. 15. Окрашивание препаратов. 16. Обезвоживание окрашенных срезов 96% раствором и 100% этиловым спиртом. 17. Замещение спирта в срезах на ксилол. 18. Заключение срезов в канадский бальзам. 19. Просушивание препаратов и подчистка. 20. Изучение препаратов под микроскопом и фотографирование их.

Светооптические и ультраструктурные особенности строения клеток эмбриоида

В наших экспериментах показано, что линия с цитоплазматической мужской стерильностью сорта Саратовская 29, полученная на основе цитоплазмы Triticum timopheevi, не имеет преимуществ перед обычной формой ни по размерам микроспор, ни по размерам ядер (табл.3.10). Цитологические характеристики микроспор, клеток стенки гнезда пыльника также не отличались от сходных показателей формы с нормальной цитоплазмой. Проведенный нами цитологический анализ процесса мейоза у растений с ЦМС, пока зал, что чаще всего нарушения встречаются в метафазе и анафазе 1 (табл.3.8). Несмотря на наличие некоторых нарушений в ходе мейоза, у нас нет достаточных оснований говорить об их влиянии на ЦМС, тем более, что такие же аномалии встречаются и у формы с нормальной цитоплазмой. Стерильность пыльцевых зерен проявляется уже на поздних стадиях микрогаметогенеза (Ильина, Васильева и др., 1976).

Тетрада микроспор фертильной формы сорта Саратовская 29

Все клетки тетрады, образовавшиеся после двух делений мейоза, имеют одинаковые размеры как у линии с нормальной, так и со стерильной цитоплазмой. Нами не наблюдалось также появления и такой аномалии, как "смещение" оси делений в мейозе II. Размеры клеток тетрады как у нормальной по цитоплазме линии, так и у имеющей стерильную цитоплазму были одинаковы (рис.3.3).

Началом культивирования пыльников необходимо считать воздействие на изолированные колосья низкими положительными температурами (+3 -+7оС) в течение определенного времени. Объяснения значения этого способа предобработки пыльников при культивировании приводятся во многих исследованиях. Подробный анализ этих публикаций дан и в наших работах (Горбунова и соавт., 1988, 1992,1993 а,б, 1994, 1995, 1997; Круглова и соавт., 1991, 1993, 1997). Не умаляя значения вышеприведенных доводов в главе 1, хотелось бы обосновать несколько отличающуюся точку зрения на роль хо-лодовой предобработки срезанных колосьев донорных растений до инокуляции на питательные среды.

Итак, в чем смысл холодовой предобработки растительного материала до инокуляции пыльников на питательные среды?

Здесь же мы делаем акцент на том, что, поскольку показано (Dickinson, 1987) реальное существование м-РНК спорофита в ядре и цитоплазме микроспоры, то следы этой информации должны каким-то образом проявиться. Безусловно, постепенное затухание экспрессии спорофитной информации и работа гидролаз уменьшает концентрацию м-РНК. Однако как быстро это происходит? На этот счет мы не нашли ссылок в литературе. Поэтому экспериментально пытались определить возможность сохранения и экспрессии спорофитной программы уже в условиях in vitro. По нашему мнению, холодовое воздействие необходимо единственно для того, чтобы "освободить" из ядра мессенджер-РНК спорофита, "зарезервированную" в конце фазы тетрады микроспор (Dikinson, 1987). Необходимость в мессен-жер-РНК в этот период очень велика, поскольку низкие температуры полностью блокируют физиолого-биохимические процессы, увеличивается количество гормона стресса, причем, чем более длителен период предобработки, тем больше накапливается в пыльниках как АБК, так и ИУК по сравнению с исходным уровнем (в момент срезания колосьев).

На примере культивирования изолированных пыльников некоторых сортов яровой мягкой пшеницы мы изучали эндогенное содержание ИУК в эксплантах после холодовой предобработки колосьев донорных растений. Оценивалась длительность воздействия низкой положительной температурой и способ стерилизации колосьев донорных растений. Также учитывалось время, прошедшее от момента срезания до инокуляции пыльников на питательную среду. Сходные изменения в сторону увеличения концентрации эндогенных фитогормонов наблюдалась у всех изученных сортов.

Это говорит о том, что холодовое воздействие на экспланты перед инокуляцией является большим стрессом для микроспор.

Возможности транскрипции в ядре в этот период стресса очень ограничены или даже невозможны, поэтому, вероятно, в цитоплазму поступает готовая м-РНК спорофита. Сказанное относится к тем микроспорам, которые еще находятся, по всей видимости, в фазе Gi клеточного цикла. По мнению N. Sunderland (1977), данная стадия является поворотным моментом в реализации спорофитной программы развития микроспор. Можно предположить, что только те микроспоры, которые не прошли некую точку в фазе Gi стадии клеточного цикла в момент срезания колосьев, могут развиться в многоклеточные образования эмбриоидоподобного типа (Ш), тогда как микроспоры, уже прошедшие эту точку, хотя и находятся в фазе Gi , развиваются в сторону следующей поворотной точки (II). Условная схема таких изменений представлена на рисунке 3.4.