Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 14
1.1. Бобово-ризбиальный симбиоз 16
1.2. Plant Growth-Promoting Rhizobacteria (PGPR) и возможности их применения
1.2.1. Ризобии как PGPR 19
1.2.2. Механизмы стимуляции роста растений ризобиями 20
1.3. Бактериальные и растительные компоненты клеток, участвующие на ранних этапах становления растительно микробных взаимодействий
1.3.1. Бактериальная аутоагглютинация 26
1.3.2. Биопленки 28
1.3.3. Полисахариды клеточной стенки ризобий 29
1.3.4. Бактериальные адгезины
1.4. Ризобиальный адгезин RapA1 36
1.5. Способы улучшения колонизации корней растений ризобиями 39
1.6. Бинарные биоудобрения на основе ризобактерий 43
Глава 2. Материалы и методы исследования
2.1. Объекты исследования, бактериальные штаммы и векторы 47
2.2. Олигонуклеотидные праймеры, использованные при проведении ПЦР
2.3. Реактивы и материалы 50
2.4. Составы использованных стандартных водных растворов и сред
2.5. Методы исследований 53
2.5.1. Выделение и очистка ДНК бактерий 53
2.5.2. Полимеразная цепная реакция 54
2.5.3. Аналитический гель-электрофорез ДНК 55
2.5.4. Препаративный гель-электрофорез ДНК 57
2.5.5. Выделение белков из клеток растений и бактерий 57
2.5.6. Вестерн-блот анализ 58
2.5.7. Обработка ДНК щелочной фосфатазой и полинуклеотидкиназой фага Т4
2.5.8. Расщепление ДНК рестрикционными эндонуклеазами 60
2.5.9. Выделение и очистка плазмидной ДНК
2.5.10. Подготовка компетентных клеток E. coli 64
2.5.11. Трансформация компетентных клеток E. coli плазмидной ДНК
2.5.12. Автоматическое секвенирование ДНК ферментативным методом
2.5.13. Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей 66
2.5.14. Приготовление электрокомпетентных клеток Agrobacterium sp. и ризобактерий
2.5.15. Электропорация компетентных клеток Agrobacterium sp. и ризобактерий
2.5.16. Определение ростовых параметров растений 67
2.5.17. Определение нитрогеназной активности бактерий 68
2.5.18. Выделение чистых культур клубеньковых бактерий 69
2.5.19. Бинарное сокультивирование бактерий и микроскопирование
2.5.20. Агробактериальная трансформация листовых пластинок растений табака
2.5.21. Анализ -глюкуронидазной (gus) активности 72
2.5.22. Выделение и очистка ДНК растений 72
2.5.23. Выделение и очистка РНК растений 73
2.5.24. Синтез кДНК 74
2.5.25. Иммунофлуоресцентный анализ для определения локализации белка
2.5.26. Обработка корней табака R. leguminosarum, E. coli и подсчет количества адсорбированных на поверхности корней бактерий
2.5.27. Статистический анализ 75
Глава 3. Результаты и обсуждение
3.1. Поиск и выделение гена rapA1 из штаммов R. leguminosarum 77
3.2. Создание генно-инженерной конструкции на основе вектора 79 pJN105 для конститутивной экспрессии гена rapA1 в бактериях
3.3. Получение и анализ рекомбинантных по гену rapA1 бактерий 81
3.3.1. Вестерн-блот белка RapA1 в трансформированных бактериях 81
3.4. Агглютинация бактерий, рекомбинантных по гену rapA1, в бинарной системе сокультивирования
3.5. Оценка влияния рекомбинантных штаммов ризобий на образование клубеньков, нитрогеназную активность и ростовые параметры на растения фасоли
3.6. Бинарная инокуляция растений фасоли и козлятника рекомбинантными и нетрансформированными штаммами
3.6.1. Совместная обработка рекомбинантными и нетрансформированными штаммами ризобий растений фасоли и козлятника
3.6.2. Идентификация гена rapA1 у бактерий, выделенных из клубеньков обработанных растений
3.7. Получение и анализ трансгенных по гену rapA1 растений табака
3.7.1. Создание векторной конструкции pCambia 1301 несущей ген адгезина rapA1 с лидерным пептидом секретируемого лектина гороха PSL
3.7.2. Получение растений табака, экспрессирующих ген rapA1 106
3.7.3. Вестерн-блот анализ белков, выделенных из трансгенных растений табака
3.7.4. Иммунофлуоресцентный анализ локализации белка RapA1 на корнях трансгенных растений табака
3.7.5. Адгезия бактерий на корнях трансгенных растений табака 111
Заключение 115
Выводы 118
Список литературы
- Бактериальные и растительные компоненты клеток, участвующие на ранних этапах становления растительно микробных взаимодействий
- Составы использованных стандартных водных растворов и сред
- Приготовление электрокомпетентных клеток Agrobacterium sp. и ризобактерий
- Агглютинация бактерий, рекомбинантных по гену rapA1, в бинарной системе сокультивирования
Бактериальные и растительные компоненты клеток, участвующие на ранних этапах становления растительно микробных взаимодействий
Ассоциативный симбиоз образуют бактерии, колонизирующие ризосферу и ускоряющие рост растений с помощью различных механизмов, которые называются ростостимулирующими ризобактериями (от Plant Growth-Promoting Rhizobacteria или PGPR – ризобактерии, способствующие росту растений) (Kloepper et al., 1980; Dey et al., 2004; Herman et al., 2008). PGPR – это обширная группа бактерий, влияющие на всхожесть семян, увеличивают массу растений и повышают урожайность (Kloepper et al, 2003). Применение PGPR в сельском хозяйстве позволяет снизить уровень использования химических удобрений, пестицидов (Моргун и др., 2009), а также увеличить рост важных сельскохозяйственных культур (Glick, 1995; Lucy et al., 2004) и подавлять рост патогенов растений (Probanza et al., 2001; Pieterse et al., 2002; Recep et al., 2009), в том числе патогенных грибов (Благова, Нигматуллина, 2012; Благова и др., 2012, 2015; Оркодашвили и др., 2013; Вершинина и др., 2013, 2015). Кроме того, обработка растений PGPR вызывает у них развитие защитных механизмов, например, приводит к состоянию индуцированной системной устойчивости (ISR) (Van Loon et al., 1998; Kloepper et al., 1999). Индуцированная системная устойчивость запускает защитные механизмы растений, направленные на борьбу с патогенами (Van Loon et al., 1998).
К PGPR-бактериям принадлежат микроорганизмы, относящиеся к следующим родам: Pseudomonas, Bacillus, Azospirillum, Agrobacterium, Azotobacter, Arthrobacter, Alcaligenes, Serratia, Rhizobium, Enterobacter, Burkholderia, Beijerinckia, Klebsiella, Clostridium, Vario-vovax, Xanthomonas и Phyllobacterium (Kloepper, 1989; De Freitas, 1990; Young, 1995; Quadt-Hallmann,1997; De Silva, 2000; Bullied, 2002; Nicholson, 2002;). Наиболее широко из них изучены Azospirillum (Bashan et al., 2004), Pseudomonas (Kloepper et al., 1980; Cattelan et al., 1999; Adesemoye, 2009), Bacillus (Probanza et al., 2001; Recep et al., 2009), Burkholderia (Joo et al., 2009).
PGPR-бактерии характеризуются положительными (прямыми и косвенными) действиями на растения (Liu, Zhang, 2015). К прямым относится синтез бактериями некоторых метаболитов (ауксинов, цитокининов и гиббереллинов), индукция 1-аминоциклопропан-1-карбоксилат (АЦК) деаминазы, продуцирование сидерофоров, синтез антибиотиков и цианида водорода (HCN), летучих и гормоноподобных соединений. Косвенные механизмы включают в себя растворение минералов (например, фосфора), индукцию системного защитного ответа, а также облегчение усвоения растениями различных питательных веществ из окружающей среды, например, растворение фосфатов и фиксация атмосферного азота (Glick, 1994; Glick, 1995; Кравченко и др., 2002; Wu et al., 2005; Kao et al., 2005; Цавкелова и др., 2005; Kang et al., 2006; Цавкелова и др., 2006; Ashraf, 2013).
Существует много работ, посвященных исследованию образования ассоциативных симбиотических систем на корнях небобовых растений различными штаммами ризобий. Кроме того, было обнаружено, что клубеньковые бактерии способны существовать в почве даже в отсутствие бобового растения-хозяина и колонизировать корни небобовых растений (Perez-Montano, 2014). Так была показана возможность колонизации бактериями R. leguminosarum bv. phaseoli корней кукурузы и салата (Chabot et al., 1996). Эндофитная колонизация ризобиями небобовых растений была обнаружена на таких растениях как рис (Yanni et al., 2001), кукуруза (Gutirrez-Zamora and Martnez-Romero, 2001; Lopez-Guerrero, 2013), табак (Ji et al., 2010). Показана колонизация корней томата и перца штаммами R. leguminosarum и стимуляция роста этих растений (Garcia-Fraile et al., 2012). Также обнаружено, что ризобии способны образовывать биопленки на корнях арабидопсиса и рапса (Santaella et al., 2008).
Таким образом, бактерии рода Rhizobium (клубеньковые бактерии или ризобии) являются одной из наиболее важных и перспективных групп PGPR, поскольку инокуляция ими бобовых и небобовых растений может широко применяться в сельском хозяйстве для повышения урожайности (Dangar, Basu, 1987; Sturtevant, Taller, 1989; Costacurta and Vanderleyden, 1995; Antoun et al., 1998; Maturi et al., 2005 a,b; Тихонович, Круглов, 2006; Pena, Reyes, 2007). По многим литературным данным ризобии обладают ростостимулирующим эффектом (Lemanceau, 1992), который обеспечивается путем синтеза веществ фитогормональной природы (ауксины, гиббереллины, цитокинины и другие), витаминов, веществ антибиотической и противогрибковой природы, фиксации молекулярного азота и ингибирования синтеза этилена растений, улучшая поглощение питательных веществ, повышенной стрессоустойчивости, растворения неорганического фосфата и минерализации органического фосфата. Кроме того, ризобии могут способствовать росту небобовых растений, косвенно взаимодействуя с другими полезными микроорганизмами (Цавкелова и др., 2005, 2006; Kao et al., 2005; Kang et. al., 2006).
Тем не менее, некоторые исследования показали, что инокуляция растений ризобиями также может оказывать и негативное влияние на рост и урожайность небобовых. Например, R. leguminosarum bv. trifolii, выделенный из клубеньков клевера, ингибирует развитие риса (Perrine et al., 2001). Аналогичным образом, Antoun и соавт. (1998) и Antoun и Prevost (2006) показали, что штаммы Rhizobium проявляют двойственный эффект воздействия на рост небобовых культур как положительный, так и негативный. В виду этого они пришли к выводу, что только конкретные штаммы Rhizobium и Bradyrhizobium могут обладать потенциалом для использования их в качестве PGPR небобовых растений (Antoun et al., 1998; Antoun, Prevost, 2006).
Составы использованных стандартных водных растворов и сред
Для выделения высокомолекулярной бактериальной ДНК ризобий использовали метод Грэхэма (Graham, 1978) с некоторыми модификациями. Культуры бактерий выращивали в колбах Эрленмейера объемом 250 мл в 100 мл питательного бульона TY при постоянном встряхивании для обеспечения достаточной аэрации при 28оС в течение ночи. Клетки осаждали центрифугированием в течение 10 мин при 4000g, 4оС, суспендировали в 10 мл буфера следующего состава: 100 мМ трис-HCl, pH 8,5, 20 мМ этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА), 15%-ная сахароза и 5 мг/мл лизоцима. После инкубации в течение 15 мин при 0оС, добавляли 10 мл лизирующего раствора (2%-ный додецилсульфат натрия) и 10 мг/мл протеиназы К) и инкубировали в течении 2 часов при 55оС. К полученному раствору добавляли равный объем смеси 80%-ного свежеперегнанного фенола (доведенного до pH8,0 с помощью трис-HCl, рН8,0), хлороформа и изоамилового спирта, взятых в соотношении 25:24:1, и проводили депротеинизацию и очистку ДНК как описано выше для ДНК растений. Для рутинных ПЦР анализов использовали также быстрый метод выделения ДНК из бактерий лизированием клеток в 1% TritonX100 и 1% суспензии Chelex100 (Баймиев и др., 2011). Для этого в 1.5 мл пробирки со 100 мкл 1% TritonX100 и 1% суспензии Chelex100 помещали небольшое количество бактериальной массы и после суспензирования инкубировали при температуре 95С 10 мин. Клеточный дебрис осаждали центрифугированием при 12000g в течение 3 мин. Надосадочную жидкость брали в качестве матрицы для ПЦР.
Для амплификации ДНК был использован метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), приводящий за 25-30 последовательных циклов денатурации, отжига праймеров и их элонгации к многократному увеличению числа копий фрагмента ДНК, заключенного между сайтами отжига олигонуклеотидных затравок, подобранных с таким расчетом, чтобы после их отжига на разных цепях молекулы ДНК, синтез соответствующих комплементарных цепей был бы направлен навстречу друг другу. Для аналитической ПЦР использовался объем реакционной смеси 20 – 30 мкл, содержащей 67 мМ трис-HCl, 16,6 мМ (NH4)2SO4, 1,5 мМ MgCl2, 0,01% Tween-20, 0,1 мкг геномной ДНК, по 10 пМ каждого праймера, по 200 мкМ дАТФ, дЦТФ, дТТФ, дГТФ и 1 е.а. Taq-полимеразы. Во избежание испарения жидкости на поверхность каждой реакционной смеси наслаивали 30 мкл минерального масла. ПЦР проводили в амплификаторах МС2 «Терцик» компании «ДНК-технология» (Россия). На начальном этапе проводилась денатурация ДНК при 94С, после чего следовали 25 – 30 циклов амплификации, каждый из которых включал стадию денатурации ДНК в течение 40 сек при 94С, стадию отжига праймеров продолжительностью 1 мин 30 сек при 50С и стадию элонгации в течение 1 мин 30 сек при температуре 72С, которая оптимальна для активности Taq ДНК полимеразы. На заключительной стадии реакционная смесь выдерживалась при температуре 72С в течение 3 мин для завершения построения комплементарных цепей фрагментов ДНК и исключения копий, содержащих не полностью достроенные молекулы. В некоторых случаях, для оптимизации ПЦР и уменьшения количества неспецифичных продуктов амплификации использовалась специальная процедура, получившая название «горячего старта». При этой процедуре добавление Taq ДНК полимеразы, разбавленной в 10 мкл соответствующего 1-кратного буфера, в реакционную смесь осуществлялось только после нагрева последней до 94С, что исключало возможность неспецифичного отжига праймеров на нуклеотидных последовательностях с низкой гомологией. По завершении амплификации из реакционной смеси отбирали аликвоту объемом 10 мкл и анализировали в 1%-ном или 2%-ном агарозном геле, в зависимости от предполагаемого размера фрагмента ДНК.
Процесс электрофоретического фракционирования препаратов ДНК осуществляли в зависимости от размера разделяемых фрагментов ДНК и требуемого разрешения, используя 1-2,0 %-ные агарозные гели. Источниками питания служили приборы модели 250/2,5 фирмы Bio-Rad (США) или модели «Эльф – 4» фирмы ДНК-технология, Россия. Толщина используемых в различных экспериментах гелей варьировала незначительно от 2 до 4 мм. Гребенки для формирования колодцев имели толщину 1,5 мм и отличались шириной зубчиков (от 3 мм до 8 мм). В качестве буферной системы использовали ТАЕ-буфер.
При разделении фрагментов ДНК крупного и среднего размеров (от 13-15 тпн до 0,8 тпн) электрофорез проводили в 0,8-1,0 %-ных гелях агарозы, соответственно, при напряжении 2-3 В на см длины. При разделении мелких фрагментов ДНК (от 2 тпн до 200 пн) использовали 1-2 %-ные гели агарозы соответственно с градиентом напряжения 8-10В на см длины геля. Такой повышенный градиент напряжения способствовал сокращению времени электрофореза и уменьшения диффузии (Sealey, Southern, 1982).
При электрофоретическом фракционировании использовали 1 Kb ДНК маркер 250-10000 п.н. (СибЭнзим, Россия). После окончания электрофореза ДНК в гелях окрашивали бромистым этидием (5 мкг/мл) в течение 10 мин. Флуоресценцию нуклеиновых кислот наблюдали и регистрировали в ультрафиолетовом свете с длиной волны 302 нм при помощи специальной фотодокументационной системы фирмы UVP (США).
Для разделяемых фрагментов белка, выделенных из бактерий и растений, использовали верхний (концентрирующий) 4% и нижний (разделяющий) 12% ПААГ. Источниками питания служили приборы модели 250/2.5 фирмы Bio-Rad (США) или модели «Эльф – 4» фирмы ДНК-технология, Россия. Электрофорез проводили в блоках полиакриламидного геля, используя прибор для электрофореза модели 250/2,5 фирмы Bio-Rad (США). Стеклянные пластины вставляли в устройство для заливки геля, прилагаемое к прибору для электрофореза. В просвет между стеклянными пластинами заливали раствор мелкопористого полиакриламидного геля, а после его полимеризации заливали крупнопористый гель. В последний погружали зубчатый шаблон для формирования карманов для нанесения белковых проб. Анализируемые белки растворяли в буфере с бромфеноловым синим и наносили на гель. Первые полчаса, когда образцы входили в гель, устанавливали силу тока 50 mA на блок. Далее электрофорез проводили при постоянной силе тока 80 mA два часа, пока свидетель (бромфеноловый синий) не доходил до конца гелевого блока.
Приготовление электрокомпетентных клеток Agrobacterium sp. и ризобактерий
Определение нитрогеназной активности клубеньков «ацетиленовым» методом показало повышение общей азотфиксирующей активности (рис. 10).
Сравнение показателей нитрогеназной активности подтвердили повышение фиксации азота примерно в 2 раза: 0,032 мкг N2/мл/час (растения, обработанные исходным штаммом) и 0,062 мкг N2/мл/час (растения, обработанные рекомбинантным штаммом), что, скорее всего, связано с увеличением количества клубеньков на корнях растений. Данные результаты подтверждают принципиальную возможность увеличения урожайности бобовых растений за счет обработки посевов/семян штаммами с повышенной адсорбционной активностью. Рисунок 10. Сравнение показателей нитрогеназной активности на корнях фасоли, обработанных исходным (1) и рекомбинантным штаммами ризобий (2).
Кроме того, было замечено, что контрольные растения развивались медленнее опытных, на них не отмечались завязи цветов, и они имели низкие ростовые параметры - 13±0,7см (рис. ПА). Опытные растения, обработанные штаммом R. leguminosamm PVu5, имели бутоны цветов и большие ростовые параметры - 16±2,3см (рис. ПБ), а растения фасоли, обработанные рекомбинантными ризобиями R. leguminosamm PVu5+RapAl, имели большее количество бутонов и, заметно, большие размеры - 25±3,1см (рис. 11В).
Полученные нами данные показывают, что обработка растений штаммами R. leguminosarum с повышенной экспрессией RapA1 увеличивает количество клубеньков и, соответственно, нитрогеназную активность, что, возможно, связано с лучшей адсорбцией ризобий на поверхности корней на начальных этапах симбиоза. Несомненно, улучшение ростовых параметров, сырой и сухой биомассы связано с улучшением азотного питания растений (табл. 9).
При этом рекомбинантный штамм ризобий оказал лучшее влияние на растения, показывая наибольший эффект на все параметры. Повышение числа клубеньков, сформировавшихся на корнях опытных растений, может свидетельствовать о связывании RарA1 с полисахаридными компонентами клеточной стенки корней фасоли. Таблица 9 - Влияние конститутивной экспрессии гена гарАІ в клетках микросимбионта на эффективность образования клубеньков, нитрогеназную активность, биомассу и ростовые параметры растений
Штаммыбактерий дляобработкирастений фасоли Количествоклубеньков (шт) Длинастебля(см) Сыраябиомасса (г) Сухаябиомасса(г) Нитрогеназная активность(мкг /мл/час) контроль — 13±0,7 3,6±0,4 0,72±0,15 — R. leguminosarum PVu5 7±2 16±2,3 5,8±0,8 0,92±0,12 0,03±0,003 R. leguminosarum PVu5+RapAl 15±3 25±3,1 8,1±0,5 2,8±0,17 0,062±0,018 Подобные эксперименты ранее проводились на клевере (Т. pratеnse), где повышенная конститутивная экспрессия гена гарАІ в плазмиде рНСбО положительно влияло на конкурентоспособность штаммов ризобий R. leguminosarum bv. trifolii и R. etli, а также было показано увеличение адсорбционной способности бактерий к корням растений в 2-5 раз. Однако авторы данной работы подсчета количества образовавшихся клубеньков не проводилось (Mongiardini et al., 2008, 2009). Также изучалась адсорбция данного штамма к корням люцерны и сои, которые не являются его природными макросимбионтами, однако клетки R. leguminosarum прикреплялись к корням растений, а повышенная экспрессия гарАІ увеличивала уровень адсорбции бактерий (Mongiardini et al, 2008). Таким образом, можно сделать вывод, что белок RарAl обладает более широкой специфичностью, а не только сродством исключительно к растению-хозяину из семейства бобовых. Существуют работы, описывающие другие ризобиальные адгезины, которые также могут неспецифически узнавать поверхность корней бобовых растений (Lodeiro, Favelukes, 1999). К ним относятся такие агглютинины, как a-L-фукоза-связывающий лектин Rhizobium lupini (Wisniewski et al., 1994) и белок BJ38 Bradyrhizobium japonicum (Ho et al., 1990). Существование таких неспецифических адгезинов повышает адаптивные возможности ризобий и позволяет им успешнее конкурировать с другими почвенными бактериями (Bogino et al., 2013).
Впервые Ausmees с соавт. (2001) высказали предположение, что белок RарA1 подобен лектину сои и трифолину А, и он узнает не только полисахариды бактерий, но и растений, играя немаловажную роль в формировании азотфиксирующего симбиоза (Ausmees et al., 2001).
Считается, что адгезия и специфическое узнавание при формировании азотфиксирующего симбиоза зависит от взаимодействия между производимыми ризобиями NF и LysM рецептор киназами макросимбионта (Oldroyd, Downie, 2008), но нельзя говорить о том, что данная система является единственным механизмом при узнавании симбиотических партнеров и адсорбции ризобий к поверхности корневых волосков растений. Возможно, она является основным звеном в сложном процессе, где также участвуют бактериальные белки RарA1. Кроме того, в специфических взаимодействиях между ризобиями и растением участвуют растительные лектины. Так, например, было показано участие лектинов, таких как PSL (лектин Pisum sativum (Diaz et al., 1989)), Le1 (лектин Glycine max (van Rhijn et al., 1998)), GS52 и DB46 (лектин Glycine soja и Dolichos biflorus, соответственно (Etzler et al., 1999; Day et al., 2000)) в процессах специфического узнавания ризобий в системе растение-хозяин. Возможно, адгезия с помощью белка RарA1 является одним из механизмов адсорбции и колонизации корней растений ризобиями, что, в случае бобовых связано с последующим формированием клубеньков. Несомненно, использование гена rapA1 в качестве трансгена может помочь в создании ассоциативных взаимодействий ризобий с небобовыми растениями, где данный белок, как и лектины бобовых растений (Vershinina et al., 2012), может оказаться хорошим инструментом для модификации симбиотических взаимодействий. А также биопрепараты на основе рекомбинантных ризобий могут найти свое применение в сельском хозяйстве в рамках перехода на экологическое земледелие.
В растениеводстве с успехом применяется метод инокуляции растений одновременно несколькими штаммами микроорганизмов, которые дополняют и усиливают эффект друг друга. Успешная агглютинация бактерий в бинарной системе сокультивирования, описанная выше, потенциально предполагает создание бинарных биоудобрений, в которых кроме специфичного штамма ризобий присутствует усиливающий адгезию ризобий к корням растений штамм-продуцент RарA1.
Агглютинация бактерий, рекомбинантных по гену rapA1, в бинарной системе сокультивирования
Полученные результаты подтверждают, что белок RapA1 принимает участие в процессах узнавания и прикрепления бактерий к корням растений, однако данное взаимодействие носит малоспецифичный характер в отличие от ряда растительных агглютининов-лектинов, в частности лектина PSL гороха, который способен узнавать и избирательно связывать полисахариды на клеточных стенках строго определенных штаммов ризобий (Vershinina et al., 2012). Ранее в нашей лаборатории подобное неспецифическое взаимодействие наблюдалось при использовании в качестве трансгена лектина козлятника восточного GORL. Исследование адгезии флуоресцентно меченых бактерий R. galegae (микросимбионтов козлятника восточного) и E. coli (модельный объект) к корням трансгенных по гену GORL растений табака показало, что на корнях опытных растений сорбировалось в 4 раза больше бактерий R. galegae и в 13 раз больше E. coli по сравнению с контрольными растениями (Чубукова и др., 2015; неопубликованные данные). Данные результаты говорят о том, что лектин козлятника, как и белок RapA1, не является строго специфичным адгезином. Вероятно, неожиданно высокая адгезия бактерий E. coli на корнях трансгенных растений табака вызвана большим сродством углеводсвязывающего центра GORL (что, в общем, можно предположить и для адгезина RapA1) к полисахаридам клеточной стенки вышеуказанных бактерий в сравнении с ризобиями R. leguminosarum.
Таким образом, возможно использование бактериального адгезина RapA1 R.leguminosarum в качестве инструмента для улучшения эффективности формирования существующих симбиотических систем (что было наглядно показано на фасоли), создания бинарных удобрений (показано на фасоли и козлятнике) и создания бактериально-растительных ассоциаций de novo (показано на табаке). Полученные результаты подтверждают, что белок RapA1 принимает участие в процессах узнавания и прикрепления бактерий к корням растений, однако данное взаимодействие не является строго избирательным и специфичным, что делает этот адгезин достаточно лабильным инструментом для формирования новых симбиотических систем.
Одним из перспективных методов развития экологически-ориентированного земледелия является использование PGPR микроорганизмов. Они могут выступать в качестве эффективного стимулятора роста и, как следствие, урожайности растений путем улучшения минерального питания и защиты от фитопатогенов. Благодаря этому применение PGPR в сельском хозяйстве позволяет снизить уровень использования химических удобрений и пестицидов. Одной из наиболее важных и перспективных групп PGPR являются клубеньковые бактерии рода Rhizobium – основные микросимбионты бобовых растений, которые, тем не менее, могут широко применяться в сельском хозяйстве в качестве ассоциативных микросимбионтов для небобовых экономически значимых культур.
Прикрепление ризобий к корням растений является очень важным этапом в формировании растительно-микробных взаимодействий. Для успешной колонизации корневых волосков штаммы ризобий должны иметь высокую конкурентоспособность среди множеств различных микроорганизмов, обитающих в ризосфере. Перспективными инструментами для модификации и усиления адгезионных процессов на ранних этапах становления симбиотических взаимоотношений, несомненно, являются бактериальные поверхностные полисахариды, растительные лектины и бактериальные адгезины – все эти вещества являются молекулами-посредниками для прикрепления клубеньковых бактерий к корням бобовых растений.
Нами была поставлена цель – исследовать возможность использования бактериального адгезина RapA1 R. leguminosarum в качестве инструмента для создания искусственных ассоциаций культурных растений с PGPR микроорганизмами. В качестве объектов исследования были выбраны растения фасоли и козлятника, как важные сельскохозяйственные культуры, и табак, как модельное растение.
Для выполнения поставленной цели были получены рекомбинантные штаммы ризобий R. leguminosarum с повышенной продукцией белка RарA1, а также штаммы R. galegae и E. coli, в которых данный белок синтезируется de novo. Секреция целевого белка рекомбинантными штаммами была доказана путем белкового иммуноблота. Исследования показали усиление способности модифицированных штаммов к аутоагглютинации, что свидетельствует о повышении адгезивных свойств.
Обработка растений симбиотическими для них видами микроорганизмов (моноинокуляция) давно показала свою эффективность, но такая обработка не всегда является стабильной, так как, например, бактерии могут иметь низкую конкурентоспособность в среде с естественной микробиотой. Поэтому в настоящее время все большую популярность приобретает двойная инокуляция растений несколькими видами или штаммами микроорганизмов. Наши исследования по совместной инокуляции растений фасоли и козлятника, в которой кроме специфичного штамма ризобий присутствовал штамм-продуцент RарA1, показали, что подобный подход может быть использован для усиления колонизации основного микросимбионта, с последующим увеличением числа клубеньков, повышением нитрогеназной активности, и, соответственно, с увеличением биомассы растений.