Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 10
1.1. В-хромосомы 10
1.1.1. Происхождение и эволюция В-хромосом 11
1.1.1.1. Происхождение В-хромосом 11
1.1.1.2. «Храповик Мюллера» в эволюции В-хромосом 14
1.1.2. В-хромосомы млекопитающих 15
1.1.3. В-хромосомы млекопитающих из отряда хищных 19
1.1.4. Молекулярный состав В-хромосом 21
1.1.4.1 Рибосомная ДНК 21
1.1.4.2 Транспозоны 22
1.1.4.3. Теломерные повторы 23
1.1.4.4. Другие виды повторенной ДНК 24
1.2. Структура и функции гена C-kit 27
1.2.1. Структура, экспрессия и локализация гена C-KIT 27
1.2.2. Структура тирозин-киназного рецептора Kit 29
1.2.3. ККлиганд 30
1.2.4. Сигнальные пути, активируемые рецептором Kit 31
1.2.5. Мутации гена C-KIT 33
1.2.6. Амплификация гена C-KIT 36
1.3. Кариотипические и филогенетические характеристики некоторых представителей семейства canidae 38
1.3.1. Кариотипические взаимоотношения в семействе Canidae 38
1.3.2. Филогенетические отношения в семействе Canidae 40
1.3.3. Геном собаки как один из базовых геномов в современных исследованиях 44
ГЛАВА 2. Материалы и методы 46
2.1. Материалы 46
2.2. Методы 48
2.2.1. Реамплификация библиотек в DOP-ПЦР 48
2.2.2. Мечение зондов в DOP-ПЦР 48
2.2.3. Полимеразная цепная реакция 48
2.2.4. Мечение ВАС в реакции NICK-трансляции 49
2.2.5. Получение Cot10 ДНК лисицы 49
2.2.6. Получение препаратов метафазных хромосом 50
2.2.7. Дифференциальная окраска хромосом 51
2.2.8. Флуоресцентная in situ гибридизация 51
2.2.9. Fiber-FISH 52
2.2.10. Саузерн-блот гибридизация 52
2.2.11. Дот-блот гибридизация интрона гена C-KIT с геномной ДНК разных видов 53
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение 54
3.1. Локализация гена c-kit на в-хромосомах различных видов 54
3.1.1. Локализация C-KIT на хромосомах лисицы 54
3.1.2. Локализация C-KIT на хромосомах енотовидной собаки 57
3.1.3. Локализация C-KIT на хромосомах собаки и песца 59
3.1.4. Оценка дозы гена C-KIT 59
3.2. Анализ структуры гена c-kit, локализованного в в-хромосомах 63
3.2.1. Анализ геномных блотов 63
3.2.2. Определение экзон-интронной структуры гена C-KIT, локализованного в В-хромосомах 65
3.3. Определение размера аутосомного фрагмента, встроенного в в-хромосому 69
3.3.1. Локализация генов, окружающих C-KIT, на хромосомах Canidae 69
3.3.2. Скрининг B-хромосомных библиотек с помощью ПЦР 76
3.4. Локализация различных видов повторов на В-хромосомах 79
3.4.1. Локализация генов рибосомных РНК 80
3.4.2. Локализация LINE 82
3.4.3. Локализация Bsp-повтора 84
ГЛАВА 4. Заключение 86
Выводы 90
Список литературы 91
- Происхождение и эволюция В-хромосом
- Кариотипические и филогенетические характеристики некоторых представителей семейства canidae
- Реамплификация библиотек в DOP-ПЦР
- Локализация гена c-kit на в-хромосомах различных видов
Введение к работе
Актуальность проблемы. Существует гипотеза, что быстрые темпы
кариотипической эволюции часто сопровождаются появлением добавочных или В-хромосом, которые характеризуются необязательностью для жизнеспособности организма. Число добавочных хромосом может варьировать как на внутри- так и на межиндивидуальном уровне. К настоящему времени сверхчисленные хромосомы тщательно исследованы с помощью цитогенетических методов. Сейчас добавочные хромосомы активно изучают с помощью молекулярных методов.
До последнего времени в В-хромосомах млекопитающих не было обнаружено уникальных генов. Необязательность добавочных элементов в кариотипе и варьирование их числа наводили на мысль об их функциональной инертности. При сравнительном картировании геномов собаки (Canis familiaris) и лисицы (Vulpes vulpes) с помощью ВАС-клонов не было получено ни одного сигнала на добавочных хромосомах лисицы (Switonski et al., 2004).
Работы по изучению добавочных хромосом и доместикации лисиц были начаты в Институте Цитологии и Генетики СО РАН академиком Д.К. Беляевым с коллегами (Беляев и др., 1974). В Лаборатории цитогенетики человека и животных ИЦиГ СО РАН проводятся работы по сравнительному картированию геномов собаки и лисицы, в рамках совместного проекта с Институтом Ветеринарии Корнельского университета (Нью-Йорк, США). В ходе этих работ, один из ВАС-клонов, содержащий последовательности онкогена С-КІТ собаки, кроме сигналов на аутосомах, дал дополнительные сигналы на В-хромосомах лисицы (В.Р. Беклемишева, Н.В. Воробьева, личное сообщение). Этот ген кодирует трансмембранную рецепторную тирозин-киназу, которая играет очень важную роль при дифференцировке и пролиферации гемопоэтических клеток, меланобластов и ранних половых клеток (Ashman, 1999). Известно, что мутации в гене C-KIT, а также изменение его копийности в геноме (например, дупликации) приводят к тяжелым для организма последствиям (нарушениям пигментации, различным видам рака). Район, гомологичный гену C-KIT, был обнаружен в средней части генома провируса саркомы кошек Харди-Зукермана 4, и назван, соответственно, v-kit. (Besmer et al., 1986; Marklund et al., 1998; Ashman, 1999; Heinrich et al., 2002a)
Поскольку В-хромосомы считаются генетически инертными элементами -возникает вопрос, почему такой важный ген, копийность которого является критической для нормального функционирования организма, локализован в добавочных хромосомах, число которых варьирует. Еще одна проблема - это происхождение В-хромосомной копии гена. Источником дополнительной копии С-KIT может быть аутосома (непроцессированный ген или копия тРНК) или геном провируса.
В-хромосомы млекопитающих еще интересны потому, что их частота встречаемости в этом классе минимальна среди всех групп организмов, несущих добавочные элементы, что вероятно, связано с низкой толерантностью млекопитающих к лишней ДНК. Тем не менее, у млекопитающих существует большое разнообразие систем добавочных элементов. Все это делает данный класс очень удобным объектом для исследования В-хромосом, как в плане анализа их структуры и молекулярного состава, так и в плане выяснения их функций.
Цели и задачи исследования. Целью данной работы является исследование структуры и возможных функций добавочных хромосом Canidae. В связи с этим были поставлены следующие задачи:
Локализовать ген C-KIT на метафазных хромосомах видов семейства Canidae, содержащих В-хромосомы, а так же на метафазных хромосомах близкородственных видов, не содержащих добавочные элементы.
Исследовать структуру В-хромосомной копии гена C-KIT и сравнить ее со структурой этого же гена, локализованного в аутосомах.
Провести исследование добавочных элементов на предмет присутствия в них других последовательностей, окружающих ген C-KIT, в аутосоме.
Проанализировать распределение повторенных последовательностей в В-хромосомах.
Научная новизна и практическая ценность. Впервые в добавочных хромосомах млекопитающих был локализован уникальный ген C-KIT, псевдоген Rpl23a и часть гена KDR. Проанализирована структура В-хромосомной копии гена C-KIT. Впервые определено, что добавочные хромосомы представителей Canidae содержат протяженный фрагмент гомологичный фрагменту Cfa13. Гены C-KIT, PDGFRA и KDR впервые локализованы на хромосомах собаки, лисицы, песца и
двух подвидов енотовидной собаки. Впервые предположено единое аутосомное происхождение В-хромосом лисицы и енотовидной собаки.
Апробация работы. Результаты исследования были доложены на следующих конференциях:
Международное рабочее совещание «Происхождение и эволюция биосферы» (Новосибирск, 26-29 июня 2005 г.);
XV Всероссийское совещание "Структура и функции клеточного ядра" (Санкт-Петербург, 18-20 октября 2005 г.);
Отчетная сессия Института Цитологии и Генетики (2005 г.);
Конференция «Современные проблемы генетики, радиобиологии, радиоэкологии и эволюции» им. Н.В.Тимофеева-Ресовского (Ереван, Армения, 8-12 сентября 2005 года), где работа получила приз «Генетического Общества Америки»;
2-ой Конгресс Международного Цитогенетического Общества (Университет Кента, Великобритания, 25-29 июня 2006г.)
Вклад автора. Автором выполнены все работы по локализациям с помощью FISH, а также скрининг В-хромосомных библиотек с помощью ПЦР. Саузерн-блот гибридизация и секвенирование проведены совместно с А.В. Кукековой (Корнельский университет, Нью-Йорк, США).
Структура и объем диссертации. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, содержащего 195 ссылок. Диссертация изложена на 110 страницах машинописного текста, содержит 5 таблиц и 19 рисунков.
Происхождение и эволюция В-хромосом
В последнее время идет очень интенсивное изучение последовательностей, входящих в состав добавочных хромосом. Первые данные, полученные в 70-х годах, показали, что В-хромосомы содержат последовательности, сходные с таковыми в А-хромосомах. Исследования, проведенные в 90-х годах, основывались на выделении, клонировании и секвенировании ряда повторяющихся последовательностей из В-хромосом различных видов. Некоторые из них оказались специфичными для добавочных хромосом, некоторые же оказались сходными с таковыми в аутосомах (Camacho et al., 2000).
Существует несколько гипотез, объясняющих происхождение добавочных хромосом.
Первая гипотеза - происхождение В-хромосом из аутосом. Считается, что добавочные хромосомы - это побочный продукт эволюции стандартного кариотипа. Например, они могли произойти самостоятельно из полисомных аутосом, из центрических фрагментов после слияния А-хромосом или после амплификации парацентромерных фрагментов А-хромосом (Camacho et al., 2000). Первые факты, свидетельствующие в пользу этой гипотезы, были обнаружены при исследовании добавочных хромосом комара Chironomus plumosis. Было показано, что бендинг политенных В-хромосом соответствует бендингу прицентромерного района хромосомы IV (Keyl, Hagele, 1971).
При изучении В-хромосом двух видов рыб из рода Pimelodus было показано, что они сходны по размеру и морфологии. Межвидовые отличия были показаны по С-бендингу. Предполагалось, что добавочные хромосомы этих видов имеют общее происхождение, а различие по бендингу является следствием дивергенции в ходе эволюции. Было показано, что структура гетерохроматина В-хромосом близка к таковой аутосом с низким содержанием GC пар (Borin, Martins-Santos, 2004).
Наличие последовательностей общих для А- и В-хромосом также может свидетельствовать о внутривидовом происхождении от одной из А-хромосом. Например, все повторенные последовательности, выделенные с помощью микродиссекции из В-хромосом Crepis capillars, присутствуют в А-хромосомах, хотя остается неясным, из какой конкретно хромосомы они произошли (Jamilena etal.,1995).
Второй сценарий происхождения В-хромосом - происхождение из половых хромосом. Например, Вг хромосома саранчи Eyprepocnemis plorans содержит два вида последовательностей (180 п.н. тандемный повтор и рибосомная ДНК), которые совпадают с последовательностями прицентромерного района Х-хромосомы (Lopez-Leon et al., 1994). Это свидетельствует о том, что В-хромосомы Е. plorans произошли из прицентромерного района Х-хромосомы с последующей амплификацией последовательностей, содержащихся там. Еще одним примером происхождения В-хромосом из половых хромосом являются добавочные хромосомы новозеландской лягушки Leiopelma hochstetteri. Саузерн-блот гибридизация В-специфичного зонда показала высокую гомологию между В-хромосомой и половой W-хромосомой этой лягушки (Green, 2004). Для двух видов листоблошек Rhinocola aceris и Psylla foersteri было показано появление В-хромосом у самцов из Х-хромосомы во время метафазы 2 мейоза. Появляющиеся В-хромосомы сохраняли митотическую стабильность и наблюдались регулярно в 4-х географически удаленных популяциях (Nokkala et al., 2000).
Третий возможный путь происхождения В-хромосом - происхождение из аутосом близкого вида (Battaglia, 1964). Пример такого происхождения добавочных хромосом был обнаружен у партеногенетического вида рыб РоесШа formosa, которому необходимы молоки другого вида, чтобы стимулировать развитие яйца; при этом отцовские хромосомы элиминируются в ходе развития. При неполной элиминации отцовских хромосом возникают добавочные хромосомы. Они несут гены, отвечающие за пигментацию (Shartl et al., 1995).
Один из доказанных случаев гибридного происхождения добавочных хромосом - это PSR (paternal sex ratio) В-хромосома осы рода Nasonia. Анализ последовательностей ретротранспозонов показал, что копии, локализованные в PSR сходны с копиями, найденными в геноме у близкого рода Trichomalopsis (McAllister, Werren, 1997).
Известны примеры различного происхождения добавочных хромосом в различных популяциях одного вида. При изучении молекулярного состава В-хромосом саранчи Е plorans из западных (Испания, Марокко) и восточных (Кавказ) популяций было показано, что они содержат различные последовательности и, вероятно, имеют различное происхождение. Западные популяции не содержали последовательностей 5S рибосомной РНК в В-хромосомах, в то время как в добавочных хромосомах восточных популяций наблюдались большие кластеры этих последовательностей. Кроме того, кавказские популяции отличаются от марокканских пониженным содержанием сателлитной ДНК и повышенным содержанием 18S-5.8S-28S рибосомной ДНК. Было предположено, что В-хромосомы в этих популяциях произошли независимо. Вероятно, добавочные хромосомы западных популяций произошли от X-хромосомы, в то время как В-хромосомы восточных популяций произошли из хромосомы Sn (Cabrero et al., 2003).
Аналогичный пример различного происхождения В-хромосом был показан для восточно-азиатской лесной мыши. Так, добавочные хромосомы дальневосточных популяций этого вида, вероятно, произошли из половых хромосом, в то время как добавочные хромосомы западносибирских популяций произошли из аутосом (Rubtsov et al., 2004).
Кариотипические и филогенетические характеристики некоторых представителей семейства canidae
Семейство собачьих представляет собой группу хищных с сильно перестроенными кариотипами (по сравнению, например, с другими семействами - куньих, виверровых). Более перестроенные кариотипы встречаются только в семействе мышиные (Muridae, Rodentia). Число хромосом в семействе собачьих варьирует от 2п=34+0-8В у лисицы (Vulpes wipes) до 2п=78 у домашней собаки (Canis familiaris) и волка (Canis lupus) (Wurster, Benirschke, 1969; Графодатский, Раджабли, 1988).
По общепринятой сейчас гипотезе, подтвержденной данными хромосомного пэинтинга представителей всех семейств хищных, предковыи кариотип отряда хищных состоит из 20 аутосом (Murphy et al., 2001). В тоже время, кариотип предка современных собачьих произошел из кариотипа с высоким диплоидным числом. На пути к формированию предкового кариотипа собачьих произошло основное число перестроек - более 40 разделений предковых элементов кариотипа. При этом сформировался кариотип, состоящий из 38 - 40 аутосомных элементов, большинство которых идентичны акроцентрическим хромосомам собаки, а остальные представляют собой отдельные сегменты хромосом собаки или их слияния (Yang et al., 1999;
Graphodatsky et al., 2001; Nash et al., 2001). Нэш с соавторами предложили обозначить его аббревиатурой АКЕС (ancestral karyotype of extant canids) (Nash et al. 2001).
Далее формирование кариотипов современных собачьих шло двумя путями:
1) кариотипы с высокими диплоидными числами (характерные для рода Canis и южноамериканских собачьих) сформировались из предкового кариотипа семейства собачьих путем немногочисленных перестроек типа слияние разделение.
2) метацентрические кариотипы с низким диплоидным числом (характерные для рода Vulpes, Alopex, Nyctereutes) сформировались путем слияний и реципрокных транслокаций предковых элементов. Причем слияния предковых элементов происходили в различных комбинациях даже у очень близких видов (Graphodatsky et al., 2001; Nash et al. 2001; Nie et al., 2003).
Исследование кариотипов собаки, лисицы и песца с помощью пэйнтинг-проб всех хромосом собаки показало, что геномы этих трех видов содержат 42 консервативных аутосомных сегмента, 34 из которых соответствуют целым хромосомам собаки. Кариотипы лисицы и песца сформированы путем слияния этих 42 сегментов. Вероятно, они образовались путем тандемных и центрических слияний предковых хромосом в различных комбинациях в линиях Vulpes и Alopex. Большинство хромосом песца показало гомологию целым плечам хромосом лисицы (Graphodatsky et al., 2000).
Было показано, что кариотип лисицы отличается от кариотипа собаки 26 слияниями хромосом и 4 разделениями (Yang et al., 1999).
Китайская (Nyctereutes procyonoides procyonoides) (2n=54+2-3B) и японская (Л/, p. viverrinus) енотовидные собаки - два подвида одного вида. Японская енотовидная собака (Nyctereutes procyonoides viverrinus) имеет кариотип 2п=38+1-5В. Часто встречаются гетерозиготные центрические разделения 5, 8 и 11 с диплоидными числами 2п=39, 40 и 41+1-5В. С помощью пэйнтинг-проб собаки, на хромосомах обоих подвидов был выявлен 41 консервативный сегмент (Graphodatsky et al. 2001, Nie et al., 2003). 16 акроцентрических хромосом китайской енотовидной собаки были гомологичны плечам 8 метацентрических хромосом японской енотовидной собаки. Все остальные хромосомы этих двух подвидов полностью гомологичны. Эти данные подтверждают, что кариотипы енотовидных собак различаются восемью Робертсоновскими транслокациями (Nie et al., 2003). Большинство хромосом японской енотовидной собаки показывают гомологию с полными плечами хромосомам лисицы и песца {Alopex lagopus) (Graphodatsky et al. 2001).
В семействе собачьих пять видов несут добавочные хромосомы: енотовидная собака, лисица, бенгальская лисица, африканская лисица и малая лисица (Makinen, Fredga, 1980; Ward, 1984; Moore, Elder, 1965; Bhatnagar, 1973; Chiarelli, 1975; Hsu, Benirschke, 1970). С помощью пэйнтинга были исследованы добавочные хромосомы только двух видов: лисицы и енотовидной собаки. Результат показал, что В-хромосомные пэйнтинг-пробы обоих видов дают сигналы только на В-хромосомах своего вида (Trifonov et al., 2000).
Семейство Canidae - это наиболее филогенетически определенное семейство, виды которого достаточно схожи между собой, но сильно отличаются от видов других семейств отряда хищных. По палеонтологическим данным первый представитель семейства собачьих (Hesperocyon) появился 32-35 млн. лет назад, а линия лисицеподобных собачьих {Leptocyon) отделилась от общего древа 9-12 млн. лет назад. Находки первых енотовидных собак (Nyctereutes donnezani) имеют возраст 4 млн. лет (Wayne et al., 1991). На основе комбинирования молекулярных и палеонтологических данных было предположено, что дивергенция от единого предка началась около 12,5 млн. лет назад (Bininda-Emonds et al., 1999). Все существующие сейчас виды разделяют на три четкие группы - лисицеподобные собачьи (fox-like canids), волкоподобные собачьи (wolf-like canids) и южноамериканские лисицы (South American foxes), /fcepyto лисицу (Urocyon), большеухую лисицу (Otocyon) и енотовидную собаку (Nyctereutes) сложно отнести к какой-либо группе и их положение на филогенетическом древе собачьих остается неясным (Wayne, Ostrander, 1999).
Реамплификация библиотек в DOP-ПЦР
Для реамплификации отсортированных или диссектированных хромосом использовали ПЦР с частично вырожденным праймером. 50 мкл реакционной смеси содержали 67 мМ трис-НСІ рН 9.4, 18 мМ (NH4)2S04, 0,01% твин-20, 2,5 мМ MgCI2, по 0,25 мМ d(ATP, GTP, СТР, ТТР), 1 мкМ 6М\А/-праймер (5 -CCGACTCGAGNNNNNNATGTGG-3 ), 5 ед.акт. Taq ДНК-полимеразы, 0,25 мкг DOP-библиотеки. После начальной денатурации 96С - 4 мин, проводили 18 циклов (94С - 30 сек, 53С - 58С по 30 сек на каждый градус, 72С - 2 мин). Количество продукта оценивали электрофоретически в 1,5% агарозном геле в ТАЕ буфере.
Мечение зондов для флуоресцентной in situ гибридизации проводили с использованием аналогов нуклеотидов: биотин-11-dUTP или дигоксигенин-11-dUTP. 25 мкл реакционной смеси содержали 67 мМ трис-НСІ рН 9.4, 18 мМ (NH4)2S04, 0,01% твин-20, 2,5 мМ MgCI2, по 0,25 мМ d(ATP, GTP, СТР), 0,1 мМ dTTP, 0,05 мМ биотин-11-dUTP или дигоксигенин-11-dUTP, 1 мкМ 6ІШ-праймер (5 -CCGACTCGAGNNNNNNATGTGG-3 ), 2 ед.акт. Taq ДНК-полимеразы, 0,25 мкг DOP-библиотеки. После начальной денатурации 96С - 4 мин, проводили 18 циклов (94С - 30 сек, 54С - 58С по 30 сек на каждый градус, 72С - 2 мин). Количество продукта анализировали электрофоретически.
Для подбора праймеров и температур отжига мы использовали программу "OLIGO", которая определяет теоретическую температуру при данной концентрации соли в реакционной смеси. Полученные теоретические данные служили отправной точкой в экспериментальном подборе температур и количества циклов.
ПЦР проводили в 25 мкл смеси следующего состава: 10 мМ Трис-НСІ (рН 9), 50 мМ KCI, 0,1% тритон Х-100 (или 67 мМ трис-НСІ рН 9.4, 18 мМ (NH4)2S04, 0,01% твин-20), 0.4мМ каждого праймера, по 250 мкМ каждого из dNTP, ЗмМ МдСІг, Юнг ДНК, 0.025-0.1 ед/мкл Taq ДНК-полимеразы. Реакцию проводили по следующей схеме: 1. 96С-3 мин; 2. 94С-30 сек; 3. ХС-1 мин; 4. 72С-2 мин, шаги 2-4 повторяли 24-34 раза, где ХС - подобранная температура отжига для каждой пары праймеров. Количество и размер продукта анализировали электрофоретически в 1 % агарозном геле.
Для получения биотинилированных зондов проводили ПЦР по аналогичной схеме за исключением состава dNTP (по 250 мкМ каждого из dATP, dGTP, dCTP, 0,1 мМ dTTP, 0,05 мМ биотин-11-dUTP).
Мечение ВАС проводили в реакции NICK-трансляции. Реакционная смесь содержала в 50 мкл: dCTP, dGTP, dTTP по 0,055 мМ dATP 0,0275мМ Биотин-14-dATP 0,0275мМ Трис-НСІ (рН 7,8) 138мМ MgCI2 14мМ /?-меркаптоэтанола 27,8 мМ BSA 27,5мг/мл ДНК-полимеразы I 5 ед/мкл ДНКазы I 0,075 ед/мкл ДНК пробы 1 мкг Смесь выдерживали в течение одного часа при 16С. После этого готовый зонд очищали на колонке JETquik (Qiagen) и осаждали.
Выделение ДНК из ядер. 40 г замороженной ткани (плацента, селезенка, почки или печень) измельчали и гомогенизировали в гомогенизаторе Поттера в 300 мл буфера А (0,35 М сахарозы, 0,05 М Трис-НСІ рН 7,5, 0,066 М ЭДТА, 0,003 М СаСЬ, 0,025 М КСІ). К гомогенату добавляли тритон Х-100 до 1%, фильтровали через капрон и центрифугировали при 500-800 g (2,5 тыс. об/мин, JA-21-ротор центрифуги G-21 "Beckman") в течение 10 мин. Осевшие ядра дважды промывали 100 мл буфера А, суспендировали в 100 мл буфера Б (0,05 М Трис-НСІ рН 7,5, 0,066 М ЭДТА, 0,1 М NaCI), добавляли РНКазу А до концентрации 10 мкг/мл и равный объем буфера Б, содержащего 0,4% SDS и 0,1 мг/мл протеиназы К. Протеиназную обработку проводили в течение двух часов при 60С, затем доводили концентрацию NaCI до 0,4 М и, добавив 1 объем этанола, наматывали ДНК на стеклянную палочку. ДНК промывали 70% этанолом, растворяли в 100 мл ТЕ-буфера и сегментировали ультразвуком (УЗДН, 22кГц, 1,5-2мин) до среднего размера 500 п.н. Затем раствор дважды экстрагировали смесью фенол/хлороформ, осаждали ДНК двумя с половиной объемами этанола с 0,4 М NaCI, растворяли в ТЕ-буфере и еще раз переосаждали.
Реассоциация ДНК. ДНК растворяли в ТЕ-буфере, спектрофотометрически определяли концентрацию и проводили реакцию реассоциации до желаемой величины C0t. Значению Cot=10 (Cot10) соответствует реассоциация в течение 1 часа при концентрации ДНК 830 мкг/мл в растворе 1,2 SSC при 60С.
Гидролиз однонитчатой ДНК 81-нуклеазой. По окончании реакции реассоциации раствор быстро охлаждали во льду, добавляли буфер (0,5 М NaAc рН 5,5, 0,045 М ZnS04) и 81-нуклеазу до концентрации 100 ед.акт./мг исходной ДНК. Через 1-1,5 часа инкубации при 42С двунитчатую ДНК осаждали 0,7 объемами изопропанола, центрифугировали, растворяли осадок в ТЕ-буфере и определяли концентрацию ДНК спектрофотометрически. Выход Cot10 ДНК составлял около 20% от общего количества ДНК.
Локализация гена c-kit на в-хромосомах различных видов
В Лаборатории цитогенетики человека и животных проводятся работы по сравнительному картированию геномов собаки и лисицы. В ходе этих работ при локализации ВАС библиотеки RPC181 (http://www.chori.org/bacpac/mcanine81.htm), содержащей различные гены собаки, на хромосомах лисицы один из клонов, несущий часть гена С-КІТ дал сигналы на В-хромосомах лисицы (В.Р. Беклемишева, Н.В. Воробьева, личное сообщение). Поскольку на добавочных хромосомах млекопитающих до сих пор не локализовано ни одного уникального гена, возникает вопрос, что дает сигнал на В-хромосомах? Это может быть как фрагмент гена, так и любая другая последовательность, присутствующая в ВАС. В связи с этим возникает необходимость локализовать на добавочных хромосомах полную копию гена С-КІТ. Если сигнал дает именно ген, то необходимо проанализировать структуру В-хромосомной копии.
Для локализации гена С-КІТ на хромосомах лисицы использовали ВАС 265L-22 (АС142093), содержащий полную копию гена.
Сигнал был получен на всех добавочных хромосомах. Число В-хромосом у лисицы варьирует от 0 до 8 в разных клетках, по морфологии они все мелкие точечные элементы (Графодатский, Раджабли, 1988). В нашей работе использовались суспензии метафазных хромосом полученных от 38 зверей с числом добавочных хромосом в различных клетках от 0 до 7. Среди них не было ни одной лисицы, у которой бы отсутствовали добавочные элементы. ВАС, использованный в данной работе, давал одинаковые сигналы на аутосомах и всех добавочных хромосомах всех исследованных зверей (Рис. 5). Кроме того, ВАС локализовался в районе 2р12 аутосом (Рис. 5).
Известно, что ген С-КІТ играет важную роль в регуляции пролиферации и дифференцировки ранних меланоцитов и, таким образом участвует в формировании окраски, а также отвечает за развитие ранних половых клеток. Для доместицированных лисиц известен такой морфологический признак как "звезда" - пятно из светлой шерсти на голове животного.
Этот признак связывают с мутациями в локусе star (S). Звезда появляется de novo с высокой частотой и только в потомстве доместицированных самок. Кроме того, у животных с хорошо выраженной звездой наблюдаются белые пятна на нижней челюсти, груди и брюхе. Лисицы, гомозиготные по мутации S, имеют нарушения слуха и вестибулярного аппарата, а самцы часто стерильны (Belyaev etal.,1981).
Принимая во внимание эти факты можно предположить, что локус star связан с геном C-KIT. Поэтому, с целью выявить какие-либо отличия в локализациях этого гена мы использовали в работе суспензии метафазных хромосом лисиц, имеющих различные окраски (красные, серебристо-черные, платиновые, со звездой и без звезды).
Но, независимо от окраски, ВАС давал сигнал на паре аутосом 2 и на всех добавочных хромосомах. Таким образом связи между фенотипом лисиц и локализацией C-KIT в добавочных хромосомах не было выявлено.
Второй вид семейства Canidae, несущий добавочные хромосомы, это енотовидная собака. В Лаборатории цитогенетики человека и животных имеются суспензии метафазных хромосом двух подвидов енотовидной собаки - китайской и японской. Кариотипы этих двух подвидов отличаются восемью Робертсоновскими транслокациями (Nie et al., 2003). В-хромосомы енотовидной собаки акроцентрические и встречаются в количестве 1-8 у японской и 2-4 у китайской (Makinen, Fredga, 1980; Ward, 1984; Ward et al., 1987; Wurster-Hill et al., 1988).
При локализации ВАС, содержащего ген С-КІТ, на метафазных хромосомах японской енотовидной собаки сигнал был получен в дистальной части всех добавочных хромосом (Рис. 6). Двухцветная FISH с микродиссекционной пэйнтинг-пробой В-хромосомы енотовидной собаки подтвердила локализацию этого ВАС на добавочных элементах. Кроме того, сигналы были получены в прицентромерной области q-плеча хромосомы 2.
На добавочных хромосомах китайской енотовидной собаки сигнал был получен в дистальной части, также как и в случае японской енотовидной собаки (Рис. 6). Но следует отметить, что на некоторых В-хромосомах китайской енотовидной собаки сигнал был множественный, в отличие он хромосом японской енотовидной собаки, где сигнал всегда был одиночный. Известно, что любые изменения в копийности гена С-КІТ приводят к различным заболеваниям. Поэтому факт присутствия различного количества копий этого гена в различных клетках одного организма (в зависимости от количества В-хромосом) вызывает большой интерес. Возникает вопрос, сколько копий гена С-КІТ представлено в геномах видов, близких к лисице и енотовидной собаке, но не имеющих добавочных хромосом.
Для анализа нами были взяты суспензии метафазных хромосом собаки (2п=78) и песца (2п=48-50). В результате сигнал был получен в районе 13q22-23 хромосом собаки и в районе 11 р13 хромосом песца (Рис. 7). Каких-либо дополнительных мест локализации этого гена на хромосомах данных видов не обнаружено.
Данные сравнительного пэйнтинга (Graphodatsky et al., 2000) (Рис. 7) показывают, что все районы аутосом, в которых локализован ген C-KIT, являются гомологичными между собой. Кроме того, они гомологичны району 4q11-12 хромосом человека, где этот ген был локализован ранее (Yarden et al., 1987).
