Введение к работе
Актуальность проблемы. Появление современных методов физического
картирования генома человека, позроляющих локализовьшагь и выделять искомые гены, не только расширяет возможности фундаментальных исследовании, связанных с изучением структуры, функции и регуляции экспрессии этих генов, но, не в меньшей степени, играет существенную роль в разработке новых средств диагносіики заболеваний, связанных с изменениями генома человека, и создания исходного материала для коррекции таких заболеваний (гет'отерэпяч), в тех случаях, где wio ноірсиусіся.
Общепринятым подходом к построению физической карты генома и его отдельных областей является создание контигов - наборов клонированных фрагментов ДНК, перекрывающих в известном порядке участки генома. Построение контигов начинают обычно с анализа крупных фрагментов ДНК, клонированных в составе искусственных хромосом дрожжей ( так называемые YAC-клоны). Этот метод облегчает задачу выделения генов, несущих мутации, приводящие к различным заболеваниям человека. На основе YAC-клонотек составлена физическая карта первого поколения генома человека, однако эта карта содержит пока большое количество брешей.
Ключевую роль при построении физической карты генома человека играют STS-маркеры (от scquensed tagged site) - относительно короткие последовательности ДНК с известной локализацией, представленные в геноме в виде уникальных копий. Такие маркеры создаются в настоящее время, как правило, на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР) и служат ориентирами при анализе огромного числа хосмидкых- и YAC-клонов. Более того, полиморфные STS-маркеры могут быть использованы для решения попу-ляционных задач, а также для создания на их основе диагностических средств к наследственным заболеваниям человека.
К участкам генома, представляющим наибольший интерес для физического картирования, на 13-й хромосоме человека можно отнести область 13q 14.3, расположенную в конце первой трети длинного плеча хромосомы и область 13q34. В первой из них локализован целый ряд генов, дефекты в которых приводят к наследственным заболеваниям человека ( ген рети-нобластомы - RBI (I3ql4.2) и ген болезни Вильсона-Коновалова - WD (13q!4.3-13q21). Недавно было показано, что область, расположенная между
локусами этих двух генов, подвержена множественным делециям и транслокациям, происхождение которых связывают с еще одним геном супрессии опухолевого роста. Потеря этого гена сопряжена с болезнью В-клеточной хронической лимфоцитарной лейкемии (B-CLL), являющейся одним из наиболее часто встречающихся заболеваний крови. Необходимость "насыщения" данной области хромосомы 13 человека STS-маркерами очевидна для создания физической карты, которая составит материальную основу тонкой локализации и выделения искомого супрессорного гена.
Другая, не менее важная область хромосомы 13 - область 13q34 - характеризуется тем, что в ней расположен целый ряд генов, выполняющих важную функцию в организме человека: среди них гены факторов VII и X свертываемости крови, гены коллагенов 4А1 и 4А2. Активированный фактор VII является витамин К-зависимой плазматической серииовой протеазой ( проконвертин), которая участвует в каскаде реакций, приводящих к свертыванию крови. Известно, что дефекты в структуре гена могут приводить к серьезным нарушениям процессов свертывания крови, а именно различным наследственным типам гемофилии. Кроме того, показана связь этого гена с развитием ишемической болезни сердца. Выявление и анализ полиморфизма гена фактора VII свертываемости крови позволит проводить медико-генетические исследования в различных популяциях человека и использовать созданные зонды для диагностики наследственных заболеваний человека, связанных с нарушением структуры данного гена.
В свете вышеизложенного, поиск и разработка молекулярно-генетических маркеров к данным областям хромосомы 13 человека, представляются весьма актуальными и перспективными в теоретическом и практическом плане. Все это определило цель и задачи настоящего исследования.
Цель и задачи работы. Целью работы было методом ПЦР получить ДНК-маркеры для хромосомы 13 человека, пригодные как для скрининга YAC и космидных библиотек, так и для проведения понуляционных и медико-генетических исследований.
Были поставлены следующие задачи:
1. На основе нуклеотидных последовательностей из области 13q 14.3 методом ПЦР получить STS-маркеры, пригодные для построения физической карты данной области.
2. Провести ПЦР-анализ YAC-клонотек для выявления клонов, несущих вставки хромосомы 13 человека из области 13ql4, с использованием полученных и уже известных STS-маркеров.
3. Построение контига фрагментов геномной ДНК на основе мега- и миди-УАС-клонов, перекрывающих район 13ql4.3.
4. Получение полиморфных STS-маркеров на основе минисателлитных повторов гена фактора VII свертываемости крови и изучение полиморфизма по этим маркерам в различных популяциях человека.
Научная новизна п практическая значимость работы. В настоящем исследовании методом ПЦР созданы и охарактеризованы С hucua. STS-;.iapK;puu а области I3ql4.3 хромосомы 13 человека. При использовании вновь созданных и ранее описанных STS-маркеров проведен анализ двух геномных YAC-клонотек, выявлен порядок мега- и минн-УАС-клоиов, перекрывающих область 13ql4.3, часто утрачиваемую при B-CLL и определен размер минимальной области делеций при B-CLL (680 тыс. п. н.). Полученные STS-маркеры используются для создания физической карты области 13ql4.3 хромосомы 13 человека такого вида ( на основе космид и кДНК), который обеспечивает доступность каждого участка ДНК для исчерпывающего структурного анализа, что важно как для фундаментальных исследований генома человека, так и для создания средств диагностики хронической лимфоцитариой лейкемии.
При ПЦР-ПДРФ-анализе локуса D13S25 на образцах ДНК из московской и талышской популяций человека обнаружено несколько мелких делеций в области пробы рН2-42 ( которая служила источником STS-маркеров для данного локуса) но сравнению с соответствующими последовательностями геномных ДНК, что позволило уточнить первичную структуру данной области генома человека.
Впервые изучен полиморфігзм гипервариабельной области гена факто-pa VII свертывав*' крови в образцах ДНК московской, талышской популяций человека и у представителей семей, полученных из Центра по исследованию полиморфизма человека (СЕРН, Франция). Описана вариабельность структуры данного гена как внутри отдельных популяций, так и на межпопу-ляционном уровне.
Полиморфные ДНК-маркеры гена фактора VII свертываемости крови могут быть рекомендованы для проведения популяционных и медико-генетических исследований человека.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы; экспериментальной части, включающей описание материалов и методов, изложение и обсуждение экспериментальных результатов, выводов и списка цитируемой литературы. Работа содержит ^7 стр. машинописного текста, включает/^рисунков, ^таблиц.