Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы: биоразнообразие и применение молекулярно-генетических методов для его изучения 12
1.1. Определение понятия «биоразнообразие» 12
1.2. Разнообразие видов. криптические виды 13
1.2.1. Симпатрические криптические виды 14
1.2.2. Аллопатрические виды и виды-космополиты 15
1.2.3. Закономерности возникновения криптических видов 20
1.3. Внутривидовой генетический полиморфизм 22
1.4 Молекулярно-генетические методы, применяемые для изучения биоразнообразия 26
1.4.1 История применения молекулярно-генетических методов для изучения биоразнообразия 26
1.4.2. ДНК-штрихкодирование 29
1.4.4. Митохондриальные псевдогены 36
1.4.5. Митохондриальная интрогрессия 38
1.4.6. Ядерные гены, используемые в качестве генетических маркеров для рутинного молекулярного анализа 41
1.5.Изучение биоразнообразия арктики с применением молекулярно-генетических методов 46
2. Материалы и методы 48
2.1. Сбор материала и создание спиртовой коллекции 48
2.2. Выделение ДНК 48
2.3. Амплификация целевого фрагмента с помощью полимеразнои цепной реакции (ПЦР) 51
3. Результаты 55
3.1. Получение данных о последовательностях фрагментов генов сої, гистона 3 и транскрибируемого спейсера its ряда морских беспозвоночных кандалакшского залива 55
3.2 Анализ полученных последовательностей ядерных и митохондриальных маркеров. низкий внутривидовой полиморфизм изученных видов беспозновночных кандалакшского залива 56
3.3. Результаты анализа полученных последовательностей 57
3.3.1. Catablema vesicarium (Cnidaria, Hydrozoa, Panndeidae) 57
3.3.2. Cyanea capillata (Cnidaria, Scyphozoa) 57
3.3.3. Arenicola marina Annelida, Polychaeta, Arenicolidae) 60
3.3.4. Brada inhabilis (Rathke, 1843) (Annelida, Polychaeta, Flabelligeridae) 61
3.3.5. Eteone longa (Annelida, Polychaeta, Phyllodocidae) 62
3.3.6. Flabelligera affinis (Annelida, Polychaeta, Flabelligeridae) 64
3.3.7. Harmothoe imbricata (Annelida, Polychaeta, Polynoidae) 65
3.3.8. Lumbrineris fragilis (O.F. Miiller, 1776) (Annelida, Polychaeta, Lumbrineridae) 66
3.3.9 Marenzelleria arctica (Annelida, Polychaeta, Spionidae) 69
3.3.10. Micronephtys minuta (Theel, 1879) и Micronephtys neotena (Noyes, 1980) (Annelida, Polychaeta, Nephtyidae) 70
3.3.11. Owenia fusiformis (Annelida, Polychaeta, Oweniidae) и другие виды-карлики 71
3.3.12. Polycirrus medusa (Annelida, Polychaeta, Terebellidae) 73
3.3.13. Pygospio elegans Claparede, 1863, (Annelida, Polychaeta, Spionidae)... 74
3.3.14. Комплекс видов Scoloplos armiger (Annelida, Polychaeta, Orbiniidae). 75
3.3.15. Terebellides stroemi (Annelida, Polychaeta, Terebellidae) 80
3.3.16. Ophiopholis aculeate (Echinodermata, Ophiuroidea, Ophiactidae) 83
3.3.17. Psolusphantapus (Echinodermata, Holothuroidea) 84
3.3.18. Strongylocentrotuspallidus (Echinodermata, Echinoidea, Echinoida) 85
3.3.19. Dendronotus dalli = Dendronotus niveus (Mollusca, Gastropoda, Dendronotidae) 86
3.3.20. Nannopus palustris Brady, 1880 (Crustacea, Copepoda, Harpacticoid)... 88
3.4. Определение таксономического положения представителей класса tantulocarida (crustacea, maxillopoda) 92
4. Обсуждение результатов 95
4.1. Полученная база данных последовательностей фрагментов генов сої, гистона 3 и транскрибируемого спейсера its морских беспозвоночных кандалакшского залива белого моря 95
4.2. Сравнение результатов молекулярно-генетического анализа с морфологическими данным 97
4.2.1. Виды-двойники 98
4.2.2. Ошибки в таксономических определениях 101
4.3. Сравнение результатов анализа митохондриальных и ядерных маркеров 102
4.3.1. Различия между последовательностями СОЇ составляют 2% 103
4.3.2. Несовпадение топологий филогенетических деревьев, построенных по результатам анализа ядерных маркеров и маркеров митохондриальных (последовательности фрагментов НЗ и СОЇ) 104
4.4. Изучение полиморфизма ядерного генома 107
Заключение 110
Выводы 111
Список литературы
- Разнообразие видов. криптические виды
- Амплификация целевого фрагмента с помощью полимеразнои цепной реакции (ПЦР)
- Результаты анализа полученных последовательностей
- Сравнение результатов анализа митохондриальных и ядерных маркеров
Разнообразие видов. криптические виды
При изучении видового состава с использованием только морфологических критериев во многих случаях сложно или практически невозможно оказывается разделить, так называемые «криптические виды» [Bickford, 2006]. В таком случае применение молекулярно-генетических методов оказывается абсолютно необходимым. Критическими называются два и более видов, ошибочно описываемые как один вид (имеющие одно название) и, по крайней мере, внешне морфологически неразличимые. [Bicford, 2007]. Впервые, впрочем, подобные виды были обнаружены задолго до возникновения молекулярно-генетических методов, более того, они были обнаружены раньше, чем была принята система классификации Линнея. По данным [Winker, 2005] впервые подобное явление было обнаружено у настоящих пеночек, род Phylloscopus F. Boie, 1835 Уильямом Дерхемом. Он выделил два вида Phylloscopus trochilus Linnaeus 1758 и Phylloscopus collybita Vieilott, 1817 вместо одного вида P. trochilus, что сообщается в письмах Джона Роя (1718 год).
Криптические виды называют еще видами-двойниками или видами-близнецами. Впервые термин «виды-близнецы» ввел [Майер, 1963]. Термин «криптические виды» возник позднее [Henry, 1985], но считается более правильным, так как некоторые авторы считают возможным употребление термина «виды-близнецы» только для сестринских видов, произошедших непосредственно от одного общего предка. Поскольку криптические виды действительно довольно часто являются сестринскими видами, то в этом случае термины можно считать синонимами, однако, многие авторы все же предпочитают термин «криптические виды» [Knowlton, 1986]. Кроме того, некоторые авторы разделяют понятия «криптические виды» и «псевдокриптические виды», так как часто обнаружение диагностических морфологических признаков следует за разделением криптических видов с помощью молекулярно-генетических методов. В этом случае виды называют псевдокриптическими» [Saez, 2003].
Количество обнаруженных криптических и псевдокриптических видов возросло экспоненциально за последние три десятилетия, что связано с применением молекулярно-генетических методов, основанных на анализе последовательностей ДНК [Сагг, 2010]. Применение этих методов стало возможным с возникновением методов амплификации, основанных на применении ПНР (Полимеразной Цепной Реакции) и развитием и значительным удешевлением технологий секвенирования. Это легко объяснимо, если принять, что видообразование не всегда сопровождается морфологическими изменениями и, в этом случае, действительное число видов должно быть значительно большим, чем можно предполагать, исходя только из морфологических наблюдений. Однако иногда применение генетических методов позволяет не увеличить, а уменьшить количество описываемых видов. Некоторые виды отличаются значительным морфологическим разнообразием и в некоторых случаях систематиков вводит в заблуждение большое число морф, в частности, вариации окраски [Knowlton, 1987]. В этом случае может происходить неоправданное дробление таксона на несколько видов или подвидов, тогда как проведенный генетический анализ показывает отсутствие генетической изоляции между несколькими различными морфами [Nygren, 2011]. В истории изучения некоторых таксонов можно проследить дробление одного вида на несколько отдельных и затем, после произведенной ревизии, снова сведение нескольких морфотипов в один вид. [Linnaeus, 1746, 1758; Agassiz, 1862; Haeckel, 1879; Mayer, 1910; Kramp, 1961]. Очевидно, что выявление криптических симпатрических видов чрезвычайно важно для учета биоразнообразия, изучения популяционной структуры и динамики, а также изучения экологии сообществ [De Leon, 2010]. Популяционная динамика многих (особенно морских) сообществ до сих пор плохо изучена и одной из причин является наличие большого количества криптических видов [Eckert, 2003]. Однако при отсутствии морфологических данных и данных о биологии вида встает вопрос о том, какие генетические дистанции можно принять как межвидовые, а какие могут соответствовать внутривидовому генетическому полиморфизму. Согласно биологической концепции вида [Мауг, 1970] основным критерием выделения в отдельный вид является наличие его репродуктивной изоляции в сочетании со свободным скрещиванием организмов внутри вида. В случае симпатрических криптических видов наличие молекулярно-генетических различий, показывающих отсутствие скрещивания между ними, безусловно, является доказательством существования комплекса видов, ошибочно объединяемых в один.
В случае аллопатрических, разделенных географически вариантов не существует строгого доказательства их неспособности к скрещиванию в случае отсутствия географической изоляции. Некоторые авторы предлагают ввести некоторое контрольное значение для дивергенции между аллопатрическими группами, который составляет от 3 до 5% нуклеотидных замен. Многие авторы большей или меньшей степенью уверенности утверждают, что 5%-ные различия по синонимическим позициям в ядерном геноме делают скрещивание между двумя организмами очень маловероятным. Некоторые авторы [Кау, 2006] считают, что для ответа на этот вопрос необходимо провести сравнительное изучение степеней репродуктивной изоляции в зависимости от значений дивергенции между сестринскими видами в разных таксонах. Однако степень полиморфизма генома варьирует не только между таксонами, но и между относительно близкими видами внутри одного и того же таксона (см. ниже), вследствие чего эти оценки носят очень приблизительный характер. Благодаря большому количеству работ, посвященных изучению связи между степенью репродуктивной изоляции и генетической дистанцией, достоверно установлено, что такая связь, безусловно, есть, и чем больше генетическое расстояние (и, тем самым, время расхождения видов), тем больше репродуктивный барьер между ними [Coyne, Orr, 1989, 1997; Sasa, Chippindale, Johnson, 1998; Presgraves, 2002; Mendelson, 2003]. При этом очевидно, [Coyne, Orr, 2004], что у животных (по крайней мере, у представителей рода Drosophila репродуктивный барьер у симпатрических видов возникает при меньшей степени дивергенции, чем у аллопатрических, и презиготическая изоляция возникает быстрее, чем постзиготическая (невыживаемость или стерильность гибридов [Coyne, Orr, 1989, 1997; Howard, 1993; Butlin, 1995; Hostert, 1997]. Было показано, что стерильность гибридов развивается постепенно, в результате постепенного накопления вредных эпистатических взаимодействий между видами [Coyne, Orr, 1989, 1997; Sasaet, 1998; Opp, Turelli, 2001] что позволяет говорить о так называемых «часах видообразования».
Амплификация целевого фрагмента с помощью полимеразнои цепной реакции (ПЦР)
Метод выделения зависел от размера животного. Для выделения из одиночных животных мелкого размера была разработана модификация методики, позволяющая выделять ДНК из животных, чьи размеры достигают несколько сот микрон. Этот метод позволил изучить генетику некоторых представителей мейобентоса и планктонных организмов.
Метод выделения ДНК выбирали исходя из размера образца и наличия полисахаридной оболочки. Во всех случаях для выделения ДНК использовали твердофазные методы (выделение с сорбентом или выделение с применением адсобционной колонки). Если размеры образца позволяли, для выделения использовали фрагмент ткани объемом 2-3 мм3, оставшуюся часть образца сохраняли в коллекции. В случае, если размеры образца не превышали 2 мм в каждом измерении, то образец использовали для выделения целиком. Если для выделения использовали фрагмент ткани вышеуказанного размера, то тотальную ДНК выделяли на сорбенте, состоящем из очищенных оболочек диатомовых водорослей с использованием набора «Диатом» фирмы «Изоген» согласно протоколу производителя. Образец ткани помещали в лизирующий раствор (400 мкл) и гомогенизировали в ручную с помощью пестика для гомогенизации в микропробирках. Затем проводили лизис при 65С от одного часа до 12-18 ч в зависимости от типа ткани и (или) оболочки животного. Затем при необходимости проводили центрифугирование в течение 5 мин при 5000 мин"1 для отделения от лизата нелизировавшихся фрагментов (например, хитиновых образований). Затем в лизат добавляли сорбент (20 мкл суспензии сорбента) и инкубировали при тщательном перемешивании в течение 10 мин для обеспечения сорбции ДНК на поверхности очищенных оболочек диатомовых водорослей. Затем проводили центрифугирование суспензии при 5000 мин"1 в течение 10 с. Осадок ресуспендировали в 200 мкл лизирующего буфера с помощью активного перемешивания на вортексе. Далее к суспензии добавляли 500 мкл спиртового солевого раствора, приготовленного согласно прописи производителя. Далее проводили центрифугирование при тех же параметрах. Супернатант тщательно отбирали с применением вакуумного медицинского отсасывателя, стараясь оставить минимальное количество жидкости. Затем процедуру повторяли дважды, промывая сорбент спиртовым солевым раствором. После второй промывки сорбент высушивали 5-10 мин при 65 С, затем проводили элюцию ДНК, инкубируя сорбент с раствором элюента (50-75 мкл) в течение 10 мин при 65 С, с периодическим тщательным перемешиванием суспензии на вортексе. После 10-минутной инкубации пробирки центрифугировали 1 мин при 10000 мин"1. Отобранный супернатант представлял собой раствор очищенной тотальной ДНК и впоследствии использовался при постановке полимеразной цепной реакции (ПЦР). Этот набор использовали во всех случаях, если у животного присутствовала сильно выраженная полисахаридная оболочка.
В случае, если размер образца был менее 2 мм, ДНК выделяли на колонке Wizard Genome Purification Kit («Promega») согласно модифицированному нами протоколу производителя (Genomic DNA purification, 2000). Модификации метода были разработаны для выделения ДНК из отдельных животных, чьи размеры составляют от 1 мм до нескольких сот микрон (Temereva, 2014). Этот же метод, но без модификаций, использовали для выделения ДНК из ракообразных, поскольку метод исключает механическое разрушение образца, и поэтому после лизиса возможно было сохранить полностью хитиновую оболочку животного, которую можно было использовать в случае необходимости для дальнейших морфологических исследований. В случае выделения ДНК этим методом использовали лизис клеток с протеиназой К. Образец, как правило, не гомогенизировали, а помещали в свежеприготовленный согласно протоколу производителя лизирующий раствор (объем 270 мкл), содержавший ЭДТА и протеиназу К. Лизис проводили в большинстве случаев в течение 16-18 ч. Исключение составляли образцы размером менее 2 мм, для которых применялась модифицированная нами методика. В этом случае лизис проводили менее 1 ч, и для лизиса использовалась Уг объема раствора, рекомендованного производителем. После инкубации к лизату согласно протоколу производителя (в случае применения стандартной методики) добавляли так называемый Lysis solution (250 мкл), обеспечивающий условия, при которых происходит сорбция ДНК на колонке. В случае модифицированной методики объем добавляемого раствора, соответственно, уменьшался в два раза. Полученный раствор тщательно перемешивали, затем наносили на колонку, вставленную в специальный держатель (картридж). Далее проводили центрифугирование при максимальных оборотах в течение 3 мин. В случае модифицированной методики этому предшествовала 10-15 мин инкубация колонки с нанесенным на нее лизатом. После центрифугирования сливали жидкость, прошедшую через колонку. Далее колонку промывали спиртовым солевым раствором, (Promega Wash Solution), приготовленным из смеси стокового раствора с 96%-ным этанолом, согласно протоколу прооизводителя. Промывку осуществляли от двух до четырех раз в случае стандартного протокола и один раз в случае модифицированной методики. Затем после удаления остатков жидкости из колонки с помощью центрифугирования в течение 2 мин в колонку для элюции ДНК добавляли 50-100 (в зависимости от размера образца) стерильной, свободной от ДНКаз деионизированной воды. В случае модифицированного протокола воду предварительно прогревали до 55С, ее объем составлял 20-30 мкл. Согласно стандартному протоколу после трехминутной инкубации проводили центрифугирование, и собранный раствор использовали для ПЦР. В случае модифицированной методики время инкубации составляло 15-20 мин.
Результаты анализа полученных последовательностей
В Белом море известны два представителя рода Micronephtys: М. minuta и М. neotena (новые названия Bipalponephtys minuta и Bipalponephtys neotena). Проведенный молекулярно-генетический анализ показал следующее (рис. 9): по результатам анализа последовательностей фрагмента СОЇ особи, определяемые как В. minuta и В. neotena, из Кандалакшского и Онежского заливов Белого моря, а также особи из Карского моря формируют одну общую кладу, в которую входят также особи, определяемые различными авторами как В. neotena по данным GenBank. Все представители вида В. minuta, последовательности которых находятся в базе данных GenBank, формируют другую, отдельную кладу (рис. 11).
Филогенетическое дерево, построенное по результатам анализа последовательностей фрагментов COl Bipalponephtys minuta и Bipalponephtys neotena с использованием метода ближайшего соседа. Длина фрагмента составила 626 п.н. для СОЇ. Статистическая поддержка, подсчитанная по результатам бутстреп-теста (1000 реплик), указана рядом с ветвями. Метод изображения деревьев позволяет рассчитывать генетические расстояния по длине ветвей. Эволюционные расстояния рассчитывали согласно методу Tamura-Nei. Таким образом, по данным молекулярно-генетического анализа в Белом море отсутствует В. minuta. Более того, последовательности СОЇ и НЗ В. neotena особей из Карского (WS1514, WS1529 и WS1532) и Белого морей (все остальные номера с аббревиатурой WS) идентичны. Последовательности гистона 3 для представителей этого рода в базе данных GenBank отсутствуют, поэтому мы не можем быть окончательно уверены, что в данном случае мы не имеем дело с митохондриальной интрогрессией. Косвенным подтверждением, но не доказательством, может служить в данном случае идентичность последовательностей и ядерного и митохондриального маркеров беломорских особей и особей из Карского моря. Но для окончательной уверенности, безусловно, нужно исследовать особь, имеющую гаплотип В. minuta.
Для нескольких массовых видов беспозвоночных Белого моря характерна карликовость: максимальный размер этих животных существенно меньше, чем максимальный размер животных того же вида в Баренцевом море и других районах Арктики [Дерюгин, 1928; Зенкевич, 1947; Кузнецов, 1960]. К ним, в частности, относится Owenia fusiformis. Хотя эта особенность беломорской фауны отмечалась неоднократно, молекулярно-генетические методы для ее изучения до сих пор не применялись. Поэтому в данном случае были получены последовательности трех генов (СОЇ, 28S и НЗ) для пяти представителей О. fusiformis. и проведено их сравнение с последовательностями этого же вида, представленными в базе данных GenBank. Различия по последовательностям фрагмента гистона 3 составило 2% (при полном отсутствии полиморфизма по этому гену внутри беломорской популяции) (см табл. 2, Приложения). Можно видеть, однако, что такой же процент замен существует между другими представителями этого вида. Последовательности фрагмента гена 28S рРНК беломорских представителей О. fusiformis отличаются на три нуклеотидные замены от О. fusiformis, обитающего в норвежском море и не являющегося карликом. Анализ последовательностей фрагмента СОЇ (рис. 12) показывает значительные различия между беломорскими О. fusiformis и всеми другими представителями этого вида (последовательности СОЇ которых аннотированы в базу данных GenBank). Таким образом, этот вопрос остается открытым и требует дальнейшего изучения. 100iWS1492 WS1493
Филогенетические деревья, построенные по результатам анализа последовательностей фрагментов СОЇ (сверху) и НЗ (снизу) Owenia fusiformis с использованием метода ближайшего соседа. Длина фрагмента составила 510 п.н. для СО J и 299 п.н. для НЗ. Статистическая поддержка, подсчитанная по результатам бутстреп-теста (1000 реплик), указана рядом с ветвями. Метод изображения деревьев позволяет рассчитывать генетические расстояния по длине ветвей. Эволюционные расстояния рассчитывали согласно методу Tamura-Nei.
Необходимо отметить, что это единственный вид-карлик для которого найдены различия между последовательностями беломорских видов и видов, не являющихся карликами из других мест обитания.
Для многих из них подобное сравнение удалось провести только для последовательностей фрагмента СОЇ, так как в базе данных Genbank последовательности ядерных генов отсутствовали. Во многих случаях (табл 2. Приложение) наблюдалась полная идентичность последовательностей фрагмента СОЇ, а в случае, если в базе данных можно было найти последовательности фрагмента гистона НЗ, различий между «карликами» и «нормальными» представителями соответствующего вида практически не обнаруживалось.
Так, были получены данные для видов, беломорские представители которых отличаются «карликовостью»: Mollusca (Testudinalia testudinalis, , L. littorea, Elliptica elliptica, Macoma baltica, M. calcarea, Modiolus modiolus, Ciliatocardium ciliatum ciliate) Echinodermata (Solaster endeca. Henricia sp., Ophiopholis aculeate, Gorgonocephalus arcticus, Strongylocentrotus droebachiensis); Crustacea (Balanus balanus).
Poly cirrus medusa (Annelida, Polychaeta, Terebellidae) Были получены последовательности фрагментов СОЇ и ИЗ пяти особей вида Poly cirrus medusa. При сравнении полученных последовательностей С01-фрагментов с данными, представленными в GenBank (к сожалению, сравнение последовательностей гистона 3 было невозможно, так как в базе данных GenBank на настоящий момент находятся только последовательности беломорских представителей этого вида), было обнаружено, что наименьшее расстояние по гену СОЇ между беломорскими P. medusa и теми особями, последовательности СОЇ которых представлены в базе данных GenBank, составляет 5% (рис. 13) (североатлантическое побережье Канады).
Филогенетическое дерево, построенное по результатам анализа последовательностей фрагмента СО J Polycirrus medusa с использованием метода ближайшего соседа. Длина фрагмента составила 649 п.н. Статистическая поддержка, подсчитанная по результатам бутстреп-теста (1000 реплик), указана рядом с ветвями. Метод изображения деревьев позволяет рассчитывать генетические расстояния по длине ветвей. Эволюционные расстояния рассчитывали согласно методу Tamura-Nei. Без дополнительных данных трудно сделать какие-либо выводы. Возможно, мы имеем дело с ошибкой определения в случае образцов, последовательности фрагмента гена СОЇ которых представлены в базе данных GenBank, возможно, что этоаллопатрические виды или вид, пришедший в Белое море не из Атлантического, а из Тихого океана. Этот вопрос требует дополнительного изучения и, в первую очередь, сбора материала из других арктических морей.
В случае Pygospio elegans Claparede, 1863, типовой экземпляр этого вида был впервые описан в Нормандии (Франция), позже было показано его широкое распространение в бореальных водах северного полушария, в частности, в Белом море. Стандартное исследование с использованием двух генетических маркеров (СОЇ и НЗ) показало отсутствие внутрипопуляционного полиморфизма у Р. elegans в Белом море (рис. 14).
Сравнение результатов анализа митохондриальных и ядерных маркеров
Как уже говорилось выше, полиморфизм мтДНК не имеет прямой связи с полиморфизмом ядерного генома. Хорошим примером этого могут служить некоторые из объектов настоящего исследования, а именно, представители отряда Harpocticoidae, у которых различия в митохондриальных генах могут составлять более 50% нуклеотидных замен, тогда как различия по ядерной ДНК соответствуют нескольким процентам. Для того, чтобы иметь представление о скрытом биоразнообразии, а именно о генетическом полиморфизме ядерной ДНК, выражающемся в числе синонимических нуклеотидных замен у представителей одной популяции, необходимо было провести скрининг ядерных маркеров. В качестве подобных маркеров были использованы, как правило, фрагмент гистона НЗ и ITS (ITS1 и ITS2). Выбор фрагмента гистона был связан, главным образом, с отсутствием у него интронов. При этом гистон - белоккодирующий ген, поэтому в нем возможно появление синонимичных мутаций, которые на затрагивают аминокислотный состав белка, следовательно, могут считаться более или менее нейтральными. Использование рибосомальных генов для изучения внутри- и межпопуляционного полиморфизма также представлялось бессмысленным из-за высокой их консервативности. Далеко не всегда удавалось получить последовательности и фрагмент гистона НЗ и ITS, поэтому приходилось делать выводы, сравнивая последовательности только одного из этих ядерных маркеров, что, безусловно, могло несколько исказить получаемые результаты. Еще одна проблема, связанная с изучением полиморфизма ядерных маркеров связана с малой представленностью последовательностей ядерных генов в базе данных GenBank (табл. 2, Приложение). Таким образом, при изучении полиморфизма приходилось во многих случаях опираться только на собственные данные.
Современные исследования показывают, что уровень внутрипопуляционного разнообразия - это важнейший популяционно-генетический параметр, характеризующий долгосрочную эффективную численность популяции. С одной стороны, морские виды нередко характеризуются огромными размерами популяций и, соответственно, высокой изменчивостью: так, рекордсмен по значению виртуальной гетерозиготности п среди многоклеточных животных - морская асцидия dona savignyi (к = 0,08). С другой стороны, имеющиеся отрывочные данные свидетельствуют об общем низком уровне внутри- и межпопуляционного полиморфизма многих арктических видов. Поэтому чрезвычайно интересным представлялось изучение генетического полиморфизма широкого разнообразия видов беспозвоночных, а также сравнение генетического полиморфизма конспецифичных популяций Баренцева, Карского и, особенно, Белого морей.
Белое море является одним из характерных районов Северного Ледовитого океана с однолетним льдом и экстремальными для многих своих обитателей условиями. Условия в Белом море отличаются от условий в Северной Атлантике и основной части Арктики более низкой среднегодовой температурой (-1,2С зимой и +4,2С летом), меньшей соленостью (24-25%о) и малой концентрацией фитопланктона, обусловленной полярной ночью и долгим ледовым периодом [Бергер 2007; Ильяш и др. 2003]; все эти различия могут влиять на эффективную численность и, соответственно, на уровень изменчивости популяций беспозвоночных, причем направление этого влияния может быть разным у разных видов в зависимости от деталей их экологии и физиологии. Предварительные данные, полученные нами, показывают, что беломорские популяции различаются низким уровнем внутрипопуляционной изменчивости (л;«0,01;). Возможно, что история формирования и заселения Белого моря, а также условия в настоящем проводят к низкой равновесной численности и/или к частым «бутылочным горлышкам» в жизни популяций и, как следствие, низкому внутрипопуляционному полиморфизму. Ответ на этот вопрос требует больших и широкомасштабных исследований, а именно, проведения систематического анализа популяций одних и тех же видов в Белом и в других арктических морях. Это позволит узнать уровень генетической изменчивости для большого числа различных таксонов, а также прояснить эколого-физиологические факторы, влияющие на этот уровень.
Получены последовательности митохондриального (фрагмента гена СОЇ) и ядерного (фрагмента гистона 3) маркеров для 244 видов, из них 86 видов Polyhaeta, 4 вида Briozoa, 16 видов Cnidaria, 6 видов Cheatognata, 5 видов Chordata, 40 видов Crustacea, 16 видов Echinodermata и 65 видов Mollusca. На обширном материале показана необходимость применения ядерных маркеров для молекулярно-генетического анализа биоразнообразия.
Впервые проведен анализ внутрипопуляционной изменчивости ядерной ДНК по фрагментам двух ядерных генов. Показан чрезвычайно низкий уровень геномного полиморфизма в популяциях беспозвоночных Кандалакшского залива.
При изучении 244 видов с применением молекулярно-генетических методов обнаружено семь случаев, когда под одним видовым названием объединялись комплексы видов: Cyanea capillata (Cnidaria, Scyphozoa), Skoloplos armiger (Annelida, Polychaeta, Orbiniidae), Eteone longa (Annelida, Polychaeta, Phyllodocidae) Terebellidas stroeme (Annelida, Polychaeta, Terebellidae), Harmothoe imbricata (Annelida, Polychaeta, Polynoidae), Psolus phantarus (Echinodermata, Holothuroidea), Dendronotus dalli (Mollusca, Gastropoda, Dendronotidae). Ha основании генетических данных и впервые обнаруженных значительных морфологических различий описан новый вид рода Cyanea, С. tzetlinisp. nov. Kolbasova, Neretina. Показано наличие митохондриальной интрогрессии для видов Lumbrineris fragilis (Annelida, Polychaeta, Lumbrineridae) и Brada inhabilis (Annelida, Polychaeta, Flabelligeridae), что свидетельствует о необходимости использовать ядерные маркеры для изучения биоразнообразия. Был подтвержден статус вида-космополита для Pygospio elegans (Annelida, Polychaeta, Spionidae) и, в противоположность этому, показано, что вид гарпактикоид Nannopus palustris (Crustacea, Copepoda, Harpacticoid), считавшийся ранее видом-космополитом, представляет из себя комплекс видов, причем вид, обитающий в Белом море, наиболее сильно отличается от всех других.