Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 8
1.1. Основные этапы сперматогенеза человека 8
1.2. Эпигенетические механизмы регуляции экспрессии генов в сперматозоидах 13
1.3. Методы оценки состояния мужской фертильности 18
1.4. Генетические причины мужского бесплодия
1.4.1. Нарушения кариотипа 22
1.4.2. Микроделеции Y хромосомы 27
1.4.3. Микроделеции генов аутосомной локализации и генов хромосомы X 29
1.4.4. Нарушение расхождения хромосом в мейозе 31
1.5. Структурно-функциональные особенности генома сперматозоида 33
1.5.1. Нарушение компактизации хроматина созревающего сперматозоида 34
1.5.2. Повреждение ДНК сперматозоида в результате действия АФК 35
1.5.3. Апоптоз в процессе сперматогенеза 37
1.5.4. Влияние фрагментации ДНК сперматозоидов на оплодотворение, качество эмбрионов и наступление беременности в программах ВРТ 38
Глава 2. Материал и методы 42
2.1. Материал 42
2.2. Методы
2.2.1. Приготовление препаратов метафазных хромосом из лимфоцитов периферической крови 42
2.2.2. QFH - окрашивание препаратов метафазных хромосом 43
2.2.3. Флуоресцентная гибридизаця in situ 43
2.2.4. Спермиологический анализ 44
2.2.5. Методика приготовления препаратов из эякулята 45
2.2.6. Метод TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP Nick-End Labelling) 45
2.2.7. Предобработка препаратов из эякулята для иммунуцитохимической детекции 5-метилцитозина и 5-гидроксиметилцитозина с помощью антител 46
2.2.8. Иммунуцитохимическая детекция 5МеС и 5hMeC с помощью антител на препаратах из эякулята 47
2.2.9. Анализ препаратов 47
2.2.10. Статистический анализ з
3. Результаты 49
3.1. Анализ кариотипа пациентов с нарушением фертильности 49
3.2. Спермиологический анализ у пациентов с нарушением фертильности
3.2.1. Повторный спермиологический анализ у пациентов с нарушением фертильности 58
3.2.2. Спермиологический анализ для пациентов с аномалиями кариотипа 60
3.3. Оценка качества культивируемых in vitro эмбрионов и частоты появления эмбрионов с хромосомным дисбалансом у пациентов с аномалиями кариотипа 62
3.4. Анализ морфологии головок эякулированных сперматозоидов пациентов с нарушением фертильности 64
3.5. Анализ фрагментация днк сперматозоидов при нарушении фертильности 69
3.5.1. Анализ фрагментации ДНК сперматозоидов с учетом формы их головки 73
3.5.2. Влияние фрагментации ДНК сперматозоидов на эффективность оплодотворения и качество эмбрионов, культивируемых in vitro 75
3.6. Иммунодетекция 5-мес и 5-нмес в сперматозоидах из эякулята пациентов с нарушением фертильности 77
3.7. Сопоставление уровня фрагментации с уровнем гидроксилирования днк сперматозоидов в эякуляте пациентов с нарушением фертильности 79
4. Обсуждение 81
Заключение 91
Выводы 93
Список сокращений 94
Список литературы 95
- Методы оценки состояния мужской фертильности
- Методика приготовления препаратов из эякулята
- Спермиологический анализ для пациентов с аномалиями кариотипа
- Иммунодетекция 5-мес и 5-нмес в сперматозоидах из эякулята пациентов с нарушением фертильности
Методы оценки состояния мужской фертильности
Сперматогенез - важнейший процесс репродукции человека, в ходе которого из недифференцированных половых клеток с диплоидным набором хромосом - сперматогоний, в результате одного цикла репликации и двух последовательных митотических делений образуются гаплоидные высокоспециализированные клетки - сперматозоиды.
Сперматогонии берут начало т первичных половых клеток (ППК), которые появляются на ранних этапах эмбриогенеза. Клетки, потомки которых дают начало гаметам, называются примордиальными. ППК представляют собой диплоидные клетки, способные к митотическим делениям. Согласно экспериментальным данным (Surani et al., 1986). ППК формируются в проксимальной части эпибласта (первичной эктодермы) под влиянием сигнальных молекул внеэмбриональной эктодермы - продуктов генов Втр4 и Втр8Ъ. Первыми маркерными белками ППК являются трансмембранный белок fragilis и цитоплазматический белок stella. Основным геном, с которого начинается эпигенетическое становление ППК у мышей, оказался ген Blimp 1 (B-lymрhocyte maturation induced protein-1). На стадии ранней гаструлы ген Blimp 1 экспрессируется только в 4-6 клетках, которые находятся в непосредственном контакте с клетками эпибласта. Мутации в гене Blimp] ведут к остановке развития ППК. В ППК также активно экспрессируются плюрипотентные гены Sox2, Oct-4, Nanas3 и репрессированы гены семейства Нах (HaxJb, HaxJa), которые определяют соматическую судьбу клеток.
Начиная со стадии гаструлы в хромосомах ППК исчезает метильная метка гистона Н3К9me2, снижаются уровни HP 1 в эухроматиновых и перицентромерных гетерохроматиновых районах (ст.Е9.0). Происходит снижение общего уровня метилирования ДНК, которое коррелирует с репрессией ферментов Dnmt3a и Dnmt3b (Reik et al., 2001; Surani, 2007).
Миграция ППК в область зачатка гонад, формирующихся на вентральной стороне мезонефроса, или первичной почки, происходит в основном посредством хемотаксиса. Так, на модельных объектах показано, что в миграции ППК участвуют лиганд kit (Steel, stem cell factor) и рецептор kit (KIT), а также лиганд CXCL12 и рецептор хемокинов CXCR4 (Ara et al., 2003; Molyneaux et al., 2003). В период миграции численность популяции ППК возрастает примерно от ста клеток до пяти тысяч (Афанасьев, 2002). ППК, заселившие зачатки мужских гонад, называются гоноцитами. На 18-20 неделе эмбрионального развития гоноциты прекращают митотическую активность и вступают в G0 фазу клеточного цикла. Вскоре после рождения митотически делящиеся гоноциты начинают мигрировать к базальной мембране семенных канальцев, формируя к 12 неделе после рождения пул сперматогониев, возобновляющих активные деления после наступления полового созревания (Yoshida et al. 2006). В мигрирующих к базальной мембране семенных канальцев гоноцитах под действием транскрипционный фактор SRY, ген которого экспрессируется в соматических клетках пока еще индифферентной гонады, активируется экспрессия гена белка CYP26B1, который связывается с молекулами ретиноевой кислоты. Данное взаимодействие детерминирует мигрирующий гоноцит к развитию по пути сперматогенной клетки и препятствует преждевременному вступлению гониев в мейоз. В этом процессе также принимают участие факторы FGF9 и NANOS3 (Bowles et al., 2006; Wilhelm and Koopman, 2006).
Процесс сперматогенеза человека характеризуется строгой временной и пространственной упорядоченностью. Основные этапы сперматогенеза протекают в семенных канальцах яичек, откуда потом незрелые сперматозоиды выходят в просвет канальцев и в составе секрета мигрируют в придаток яичка, где и происходит их полное дозревание.
Сперматогенный эпителий лежит на базальной мембране и включает два типа клеток: эпителиальные, играющие вспомогательную роль, и сперматогенные клетки. Эпителиальные клетки представлены клетками Сертоли, каждая из которых простирается на всю длину эпителия от базальной мембраны до просвета канальца. На боковых поверхностях клеток Сертоли имеются бухтообразные углубления, в которых размещаются развивающиеся сперматогенные клетки. Каждая клетка Сертоли контактирует с пятью другими клетками такого же типа и сразу с 40 - 50 сперматогенными клетками на разных стадиях созревания. В процессе перемещения созревающих сперматогенных клеток изменяется и морфология клеток Сертоли: меняется контур и форма, а также перемещается ядро. Такие изменения цикличны и совпадают с созреванием очередной генерации сперматогенных клеток. Поэтому цикл - это время созревания очередной генерации сперматогенных клеток.
Между клетками Сертоли существуют плотные контакты, которые создают особый гематотестикулярный барьер. Он изолирует клетки сперматогенного ряда от контакта с клетками иммунной системы и поддерживает специфическую среду для прохождения всех этапов сперматогенеза. Кроме того, клетки Сертоли фагоцитируют сперматогенные клетки, которые погибают в процессе сперматогенеза, а также цитоплазматические капельки, отшнуровывающиеся от поздних сперматид. Также клетки Сертоли секретируют в просвет канальца жидкость, в которой окажутся сперматозоиды после потери связи со сперматогенным эпителием. На поверхности клеток Сертоли расположены рецепторы фолликулостимулирующего гормона, лютеинизирующего гормона и тестостерона. Клетки Сертоли координируют процесс развития сперматогенных клеток и их перемещение к просвету канальца, а также контролируют прохождение волны инициации сперматогенеза вдоль семенного канальца (Zini and Agarwal et al., 2011).
Сперматогонии составляют всего 0,03% от общего количества клеток сперматогенного ряда сперматогенного эпителия (Meistrich and Van Beek, 1993). Пул сперматогониев разделяют на три функционально различных типа в зависимости от морфологических характеристик их ядра: тип Ad (dark - «темный»), тип Ap (pale «светлый») и тип В (Clermont, 1966). Сперматогонии типа Ad способны к митотическому делению с образованием как двух идентичных Ad сперматогониев, так и двух идентичных Ap сперматогониев. Сперматогонии типа Ad непосредственного участия в образовании сперматозоидов не принимают. Их основной функцией является поддержание численности популяции сперматогониев. Сперматогонии типа Ap повторно делятся митотически, при этом между клонами остаются контакты, так называемые цитоплазматические мостики, и формируется плазмодиум, обеспечивающий синхронизацию последующих обытий происходящих с клетками. После завершения деления эти клетки дифференцируются в сперматогонии типа В. Они в свою очередь также делятся митозом с образованием двух идентичных клеток, называемых сперматоцитами первого порядка, или сперматоцитами I.
Сразу после рождения собственно эпителиальными клетками сперматогенного эпителия - клетками Сертоли - начинают синтезироваться особые факторы, обеспечивающие поддержание сперматогоний в недифференцированном состоянии. Так, ключевыми в данном процессе являются белки GDNF (glialcellline-derived neurotrophic factor) и фактор роста фибробластов (bFGF, basic fibroblast growth factor) (Hofmann et al., 2005). Следует отметить, что мутация в гене фактора GDNF и его рецептора у самцов мыши летальна (Sanchez et al., 1996). Дифференцировка сперматогоний определяется активацией транскрипции гена клеточного рецептора c-kit (Dolci et al., 2001). Связывание лиганда, продуцируемого клетками Сертоли, с рецептором с-kit обеспечивает запуск транскрипции многих генов, в том числе тех, продукты которых обеспечивают вступление клетки в мейоз (Rossi et al., 2008).
В ходе первого этапа сперматогенеза - сперматоцитогенеза - происходит митотическое деление сперматогоний с образованием сперматоцитов I порядка, которые затем вступают в первое деление мейоза, завершающееся образованием сперматоцитов II порядка. Важным этапом, предшествующим любому клеточному делению, является возникновение тесной связи (когезии) между сестринскими хроматидами. Когезия необходима для удержания сестринских хроматид во время метафазы, а также для правильной ориентации и расхождения хромосом (Valdeolmillos et al., 2007). Когезия сестринских хроматид происходит с участием мультипротеиновых комплексов - когезинов (Гришаева с соавт., 2010). В установлении когезии участвуют белки семейства SMC (structuralmaintenanceofchromosome) (SMC3, SMC l, SMCi) и SCC (sisterchromatidecohesion) (SCC1, SCC3) (Costa and Cooke, 2007). В профазе мейоза I белки когезии служат опорой для белков рекомбинации и белков синаптонемного комплекса (Hagstrom and Meyer, 2003).
На стадии зиготены профазы первого деления мейоза начинается конъюгация сначала на отдельных участках хромосом, а потом и по всей их длине, что приводит к образованию бивалента. Кроме двух сконъюгированных хромосом в состав бивалента входит структура синаптонемного комплекса, состоящая из рех белковых единиц: двух латеральных элементов, соединенных трансверсальными филаментами, и одного центрального. В состав латеральных элементов синаптонемного комплекса входят белки SCP2 и SCP3, трансверсальных филаментов - белок SCP1, центрального филамента - SYCE1 и SYCE2 (Hermo et al., 2010). У человека в отсутствии данных белковых продуктов нарушается формирование синаптонемного комплекса и синапсис хромосом, наблюдается блокирование сперматогенеза на стадии зиготены (Costa et al., 2005; Hamer et al., 2006; Bolcun-Filas et al., 2007). Важную роль в формировании синаптонемного комлекса также играет РНК-связывающий белок СРЕВ (Cytoplasmic polyadenylation element binding protein). У мышей СреЪ-/- наблюдается блокирование сперматогенеза на стадии пахитены (Тау and Richter, 2001).
Методика приготовления препаратов из эякулята
Апоптоз является основным механизмом клеточной гибели в процессе сперматогенеза. В норме в 75% мужских половых клеток на стадии сперматогоний запускается процесс апоптоза (Milligan and Schwartz, 1997).
Апоптоз, как генетически запрограммированная клеточная гибель, характеризуется рядом морфологических и биохимических изменений, включающих: уменьшение объема клетки, вздутие цитоплазматической мембраны, конденсацию и преимущественную локализацию хроматина на внутренней поверхности ядерной мембраны, так называемую маргинацию, а также формирование апоптотических телец. Воспалительный процесс при апоптозе не развивается, поскольку происходит быстрый фагоцитоз клеток. Характерной чертой апоптоза является экстернализация фосфатидилсерина с внутреннего на внешний листок плазматической мембраны клетки, результатом чего является её повышенная проницаемость. Изменяется и трансмембранный потенциал митохондрий. В результате изменения проницаемости мембран митохондрий открываются ионные каналы, в цитоплазму клетки выходят такие факторы индукции апоптоза, как AIF (apoptosis-inducing factor). Изменение мембранного потенциала митохондрий приводит к появлению АФК в клетке (Zini and Agarwal, 2011).
В апоптоз могут вступать как сперматогонии, так и сперматоциты и сперматиды, однако чаще апоптозу подвержены половые клетки на стадии сперматогоний и круглых сперматид. Зрелые сперматозоиды также могут иметь признаки, характерные для клетки, вступившей в апоптоз (Zini and Agarwal, 2011).
Погибшие в результате апоптоза клетки или фагоцитируются клетками Сертоли, или выходят в просвет семенных канальцев. При нарушении сперматогенеза число половых клеток, вступающих в апоптоз, увеличивается (Gandini et al., 2000).
В регуляции апоптоза принимают участие белки семейства Вс1-2 как проапоптатические (Вах, Bak, Bcl-xs, Bad), так и антиапоптотические (Bcl-2, Bcl-xL). Соотношение про- и антиапоптотических белков определяет судьбу клетки. Так, при сверхэкспресии генов белков Bax и Bak наблюдается инактивация белка Bcl-2 и клетки вступают в апоптоз (Kane et al., 1993). Каспазы или сериновые протеазы клетки обеспечивают расщепление внутриклеточных белков. Инактивация каспаз приводит к подавлению апоптоза (Pentikainen et al., 1999). В регуляции апоптоза половых клеток человека участвуют и другие белки. Запуск апоптоза при повреждении ДНК клетки индуцируется деградацией белка PARP (Zini and Agarwal, 2011).
К запуску апоптоза в половых клетках может привести ряд факторов, таких как нарушение баланса гормонов, факторов роста, цитокинов и регуляторных факторов, а также некоторые внешние воздействия, например, радиация, травмы, инфекции (Zini and Agarwal, 2011).
При нарушении сперматогенеза и блокировании данного процесса на одной из стадий развития половой клетки запускается апоптоз. Доля сперматоцитов и сперматид с фрагментированной ДНК у пациентов с нарушениями сперматогенеза выше, чем у пациентов с нормальным сперматогенезом. При нарушении сперматогенеза и блока на стадии круглых сперматид доля сперматоцитов I порядка и сперматид с фрагментированной в результате апоптоза ДНК выше, чем у пациентов, для которых характерен блок сперматогенеза на стадии удлиненных сперматид. Показано, что уменьшение концентрации сперматозоидов в эякуляте связано не столько со снижением пролиферативной активности сперматогенного эпителия, сколько с активацией апоптотических процессов и деградацией сперматогенных клеток во время профазы мейоза (Кулаков и др., 2005).
Хотя, окислительный стресс считается основной причиной повреждения ДНК, несомненно, что все процессы, приводящие к фрагментации ДНК сперматозоида, взаимосвязаны.
Влияние фрагментации ДНК сперматозоидов на оплодотворение, качество эмбрионов и наступление беременности в программах ВРТ Разработка и внедрение вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) позволили не только диагностировать причины мужского и женского бесплодия, но и кардинально повысить эффективность его лечения, понять механизмы, лежащие в основе нарушения репродуктивной функции. Тем не менее, только 30% попыток экстракорпорального оплодотворения заканчиваются наступлением беременности и рождением ребенка (Zini and Agarwal, 2011).
При применении ВРТ выбор метода оплодотворения зависит т показателей спермиологического анализа. Несомненно, что три основных параметра спермограммы (концентрация, доля подвижных и морфологически нормальных форм сперматозоидов) являются основными для оценки сперматогенеза, однако, их количественное выражение не является строгим диагностическим критерием бесплодия, и пациенты с аномальными параметрами спермограммы могут иметь детей без использования вспомогательных репродуктивных технологий (Lewis, 2007). Таким образом, мужское бесплодие не всегда определяется нарушениями параметров спермограммы.
Одним из наиболее простых методов ВРТ является внутриматочная инсеминация, которая представляет собой процедуру введения предварительно обработанного эякулята в полость матки в близкое к овуляции время. Частота наступления беременности после проведения внутриматочной инсеминации составляет 10-20% (Bungum et al., 2007). Так, было показано, что при увеличении доли сперматозоидов с фрагментированной ДНК в эякуляте частота наступления клинической беременности после внутриматочной инсеминации снижается (Bungum et al., 2007; Duran et al., 2002).
Классическая методика ЭКО, или оплодотворение in vitro, предполагает осуществление оплодотворения вне женского организма. При определенных формах мужского бесплодия, связанных со снижением концентрации, подвижности и некоторыми формами тератозооспермии, используется метод внутрицитоплазматической инъекции сперматозоида в ооцит (ICSI - IntraCytoplasmic Sperm Injection), предложенный в 1992 году профессором Van Steirteghem (Palermo et al., 1992). С помощью данного метода генетический материал сперматозоида доставляется непосредственно в цитоплазму ооцита, минуя естественные биологически барьеры, что может привести к оплодотворению яйцеклетки сперматозоидом с генетическими или эпигенетическими аномалиями.
В литературе не существует единого мнения влиянии увеличения доли
сперматозоидов с фрагментированной ДНК в эякуляте на частоту наступления беременности при ЭКО или ЭКО с ICSI. Показано, что при низком содержании сперматозоидов с фрагментированной ДНК в эякуляте частота беременности после процедуры ЭКО не отличается т частоты наступления беременности после ЭКО с ICSI. Однако, при увеличении доли сперматозоидов с фрагментированной ДНК в эякуляте частота биохимической и клинической беременностей после ЭКО значительно ниже, чем при ЭКО с ICSI (Host et al., 2000; Payne et al., 2005).
Спермиологический анализ для пациентов с аномалиями кариотипа
По данным статистического анализа показатели доли сперматозоидов с фрагментированной ДНК всех групп пациентов, за исключением группы ОАТ, А, ОА и ОТ имели нормальное распределение (критерий Колмогорова-Смирнова). С помощью дисперсионного анализа (ANOVA, критерий Краскела-Уоллиса) было показано достоверно значимое отличие средних значений в исследуемых группах (р0,05). Доля сперматозоидов с фрагментированной ДНК у пациентов с нормозооспермией не отличалась от таковой в контрольной группе доноров спермы. Достоверно значимые отличия обнаружены при сравнении доли сперматозоидов с фрагментированной ДНК в группе пациентов с тератозооспермией и контрольной группы, и в группе с тератозооспермией и нормозооспермией. В остальных случаях при попарном сравнении средних исследуемых групп достоверных отличай обнаружено не было.
Принимая во внимание нормативы ВОЗ 2010 года (WHO, 2010) долю сперматозоидов с фрагментированной ДНК также сравнивали в 5 группах: контрольная группа доноров спермы, нормозооспермия (по нормам ВОЗ 1999 г.), нормозооспермия (по нормам ВОЗ 2010 г.), тератозооспермия (по нормам ВОЗ 1999 г.), тератозооспермия (по нормам ВОЗ 2010 г.). Результаты представлены в таблице 9.
Интересно отметить, что наименьшая доля сперматозоидов с фрагментированной ДНК (0,39±0,12%) выявлена у пациентов с нормозооспермией по норам ВОЗ 1999 года. Доли сперматозоидов с фрагментированной ДНК у пациентов с нормозооспермией и тератозооспермией по данным ВОЗ 2010 года не отличались (p 0,05) (U-критерий Манна-Уитни).
С помощью дисперсионного анализа (ANOVA, критерий Краскела-Уоллиса) было показано достоверно значимое отличие средних значений в исследуемых группах (p0,005). Доля сперматозоидов с фрагментированной ДНК у пациентов с нормозооспермией по нормам ВОЗ 2010 года достоверно отличалась от таковой в контрольной группе и у пациентов с нормозооспермией по нормам 1999 года, о днако не отличалась от таковой у пациентов с тератозооспермией по нормам ВОЗ 1999 года. В то же время доля сперматозоидов с фрагментированной ДНК среди пациентов с тератозооспермией по нормам ВОЗ 2010 года достоверно отличалась от таковой в контрольной группе и при нормозооспермии по нормам ВОЗ 1999 года, но не отличалась от таковой у пациентов с тератозооспермией по нормам ВОЗ 1999 года.
У пациентов с аномалиями кариотипа доля сперматозоидов с фрагментированной ДНК составила 0,66±0,21 и была достоверно выше соответствующих показателей в контроле (p0,05).
Следует отметить, что доля сперматозоидов с фрагментированной ДНК значительно варьировала в зависимости от типа аномалии кариотипа (таблица 10). Таблица 10. Фрагментация ДНК сперматозоидов пациентов с аномалиями кариотипа
Наибольшая доля сперматозоидов с фрагментированной ДНК наблюдалась при наличии инверсии хромосомы 7, а также робертсоновских транслокаций между хромосомами 13 и 14 (таблица 10).
Наименьшие доли сперматозоидов с фрагментированной ДНК наблюдались у пациентов с реципрокной транслокацией между хромосомами 1 и 7, а также у пациента с дополнительным материалом на хромосоме 22.
Доли сперматозоидов с фрагментированной ДНК у пациентов с робертсоновскими транслокациями между хромосомами 13 и 14 достоверно не отличались (р=0,4763). При этом доля сперматозоидов с фрагментированной ДНК у пациента с робертсоновской транслокацией между хромосомами 14 и 21 была достоверно ниже, чем у пациентов с робертсоновскими транслокациями между хромосомами 13 и 14 (р=0,0483).
Доли сперматозоидов с фрагментированной ДНК у пациентов с робертсоновскими транслокациями в кариотипе и реципрокными транслокациями достоверно не отличались (р=0,2532).
У пациентов с числовыми аномалиями кариотипа доля сперматозоидов с фрагментированной ДНК в среднем составила 0,29±0,09 и достоверно не отличалась от доли в контрольной группе (р=0,4913). 3.5.1. Анализ фрагментации ДНК сперматозоидов с учетом формы их головки
Проведена оценка доли сперматозоидов с фрагментированной ДНК у пациентов, сгруппированных по преобладанию той или иной формы головки сперматозоидов (таблица 11).
По данным статистического анализа показатели доли сперматозоидов с фрагментированной ДНК в исследуемых группах имели нормальное распределение (критерий Колмогорова-Смирнова). С помощью дисперсионного анализа (ANOVA) было показано достоверно значимое отличие средних значений в исследуемых группах (р0,05). Установлено, что при преобладании вакуолизированной формы головки сперматозоидов, доля сперматозоидов с фрагментированной ДНК достоверно выше, чем при преобладании аморфных, грушевидных или головок с патологией акросомы.
Иммунодетекция 5-мес и 5-нмес в сперматозоидах из эякулята пациентов с нарушением фертильности
Исходя из вышеизложенного, мы проанализировали уровень фрагментации ДНК у пациентов, в эякуляте которых преобладали аморфные, грушевидные, вакуолизированные или сперматозоиды с патологией акросомы. Наибольшая доля сперматозоидов с фрагментированной ДНК была выявлена при доминировании вакуолизированной формы головки и между данными показателями была выявлена взаимосвязь. Кроме этого из нативных образцов эякулята при помощи микроманипуляционного оборудования были отобраны индивидуальные сперматозоиды с вакуолизированной и нормальной головками, для которых впоследствии был проведен анализ фрагментации ДНК, в результате которого было выявлено, что уровень фрагментации ДНК сперматозоидов с вакуолизированной головкой выше такового сперматозоидов с нормальной головкой. О происхождении вакуолей нет единого мнения. Вакуоли могут быть образованы такими мембранными структурами головки как ядро или акросома (Gatimel et al., 2013; Fekonja et al., 2014). По мнению ряда авторов, вакуоли являются результатом нарушения компактизации хроматина.
Такая вакуоль представляет собой полость, или место скопления деконденсированного хроматина. наличием вакуолей в головке сперматозоида связывают нарушение соотношения гистонов и протаминов (Chemes and Rawe, 2003; Bartoov, 2003; Boitrelle, 2011).
Таким образом, было показано, что вакуолизированная форма головки сперматозоида является морфологическим маркером нарушения целостности его ДНК. Также исходя из полученных данных можно предположить, что нарушения генома сперматозоида сказываются на его морфологии. И, возможно, преобладание в эякуляте тех или иных редко встречающихся в норме форм головок будет связано с какими-либо нарушениями генома или эпигенома сперматозоида. Дальнейшей перспективой могут стать исследования динамических изменений как уровня фрагментации ДНК, так и его морфологического маркера в ответ на внешние воздействия, например, прием витаминов и антиоксидантов. Известно, что прием антиоксидантов снижет уровень фрагментации ДНК сперматозоидов (Greco et al., 2005).
Вопрос о влиянии фрагментации ДНК сперматозоидов на ключевые этапы раннего эмбрионального развития остается открытым. Большинство исследователей сходится во мнении, что фрагментация ДНК сперматозоидов не снижает эффективности оплодотворения (Tomlinson et al., 2001; Henkel et al., 2003; Henkel et al., 2004; Velez de la Calle et al., 2008) . Другие, напротив, считают, что при повышении уровня фрагментации ДНК сперматозоидов эффективность оплодотворения снижается (Hst et al., 2000; Huang et al., 2005). В настоящей работе было показано, что при увеличении уровня фрагментации ДНК сперматозоидов эффективность оплодотворения не снижается. При этом, мы учитывали эффективность не только в группах пациентов, различающихся по уровню фрагментации ДНК сперматозоидов, но в зависимости т способа оплодотворения. Так, можно предположить, что при оплодотворении методом ЭКО, максимально приближенному к условиям оплодотворения in vivo, эффективность должна быть ниже, поскольку сперматозоиды с фрагментированной ДНК, при условии, что фрагментация обусловлена действием АФК, должны двигаться медленнее вследствие перекисного окисления липидов плазматической мембраны. Вместе с тем при оплодотворении методом ICSI, или внутрицитоплазматической инъекции сперматозоида, эффективность должна быть выше. Тем не менее в нашем исследовании было показано, что при увеличении уровня фрагментации ДНК сперматозоидов эффективность оплодотворения, вне зависимости от его метода, не снижается.
Нет единого мнения и о влиянии фрагментации ДНК сперматозоидов на развитие эмбрионов. Так, считается, что при увеличении уровня фрагментации ДНК сперматозоидов качество эмбрионов, культивируемых in vitro, снижается (Gandini et al., 2004; Seli et al., 2004; Velez de la Calle et al., 2008). Однако существует и альтернативное мнение по данному вопросу (Henkel et al., 2004; Bakos et al., 2008). Полученные в настоящем исследовании данные свидетельствуют в пользу первого. Так, было показано, что между уровнем фрагментации ДНК сперматозоидов в эякуляте пациентов, направленных на процедуру ЭКО или ЭКО с ICSI, и качеством эмбрионов, полученных в данных протоколах, существует взаимосвязь. При этом, чем больше доля сперматозоидов с фрагментированной ДНК в эякуляте, тем хуже качество культивируемых in vitro эмбрионов. Вероятнее всего, что часть разрывов ДНК сперматозоида репарируется ферментами ооцита вскоре после оплодотворения до стадии 4-8 клеток, когда происходит зиготическая трансформация (MZT, maternal to zygotic transformation) (Braude et al., 1988; Mnzo et al., 2010). В то время как нерепарированные разрывы ДНК сперматозоида приведут к нарушению работы генома эмбриона и остановке развития на ранних этапах эмбриогенеза.
Окислительный стресс также является причиной нарушения эпигенома сперматозоида. Показано, что в результате действия АФК уровень метилирования ДНК сперматозоида меняется (Tunc and Tremellen, 2009). Так, результатом окислительного стресса является активное деметилирование ДНК, в ходе которого происходит превращение 5-метилцитозина в цитозин (Aitken et al., 2013). При этом, в ходе последовательных биохимических реакций образуются кислородсодержащие соединения, в том числе 5-гидроксиметилцитозин (Doshi et al., 2011). Открытым остается вопрос роли 5-гидроксиметилцитозина в сперматогенезе (Tahiliani et al., 2009; Ito et al., 2010). Некоторые исследователи отмечают неслучайное распределение данного оединение в геноме сперматозоида, что связывают с активностью генов, необходимых для раннего эмбрионального развития (Gan et al., 2013). Следовательно 5-гидроксиметилцитозин должен присутствовать во всех или в большинстве сперматозоидов. Интересно отметить, что в настоящем исследовании было показано, что, в отличие т 5-метилцитозина, 5-гидроксиметилцитозин содержался лишь в единичных сперматозоидах. При этом доля сперматозоидов, содержащих 5-гидроксиметилцитозин, варьировала как в эякуляте доноров спермы, так и в эякуляте пациентов с аномалиями кариотипа. Что вероятнее всего обусловлено действием экзогенных факторов. Поэтому, мы проанализировали соотношение уровня фрагментации ДНК и уровня ее гидроксиметилирования в сперматозоидах пациентов с нарушением фертильности и выявили корреляцию между данными параметрами. Так, возможно, причиной появления 5-гидроксиметилцитозина является действие АФК, образующихся в результате окислительного стресса в ответ на действие неблагоприятных факторов окружающей среды. В свою очередь, появление 5-гидроксиметилцитозина в результате активного деметилирования 5-метилцитозина приводит к деконденсации хроматина сперматозоида, что делает его ДНК более доступной для атаки АФК. Таким образом, высокий уровень фрагментации ДНК ассоциирован с высоким уровнем гидроксиметилирования ДНК. И, можно предположить, что нарушение целостности генома сперматозоида отражает нарушение эпигенома.