Введение к работе
Актуальность темы, пуриновые нуклеозид-5'-фосфаты играют сушествен-ш-ю-роль в метаболизме клеток В. subtllls. являясь субстратами для биосинтеза нуклеиновых кислот. NAD . KADPH. FAD. Фолиевой кислоты, тиамина и вовлечены в регуляцию большого числа Ферментативных реакций. Модифицированные 3'.5'-циклическая-АИР. ppGpp принимают непосредственное участие в споруляпии в. subtllls.
Исследование генетического механизма биосинтеза пуриновых нуклеоти-дов имеет важное теоретическое и практическое значение, что объясняется не только особой ролью пуринов в процессах жизнедеятельности клеток но и расширением их применения в медицине, пишевой и химической промышленности, а также в экспериментальной биологии. Пуриновые соединения,и в частности, инозин являются известными лекарственными средствами (фармацевтические синонимы: инозие F - в Японии и рибоксин - в СССР) эффективно применяемыми в терапии сердечно-сосудистых и других заболеваниях. Кроме того, инозин является сырьем для синтеза инозиновой кислоты для пишевой промышленности и других препаратов.
Цель работы и задачи исследования: Имеющиеся на сегодняшний день сведения хотя и дают довольно полную картину биосинтеза пуринов и его регуляции у В. subtllls, однако имеются определенные неясности в отношении механизма сверхпродукции инозина. Цель работы - исследование генетических основ и механизма сверхпродукции инозина у В. subtllls путем выделения и исследования мутантов с регуляторними изменениями в биосинтезе пуринов de novo. В соответствии с этим задачами работы являлось: 1) конструирование штамма с дефектами Ферментов взаимопревращения пуринов, то есть, введение мутаций по Ad-дезаминазе (adeC) и GHP-редуктазе (guaC); 2) исследование бактериостатического действия естественных пуринов в условиях отсутствия их взаимопревращений в клетке; 3) получение мутантов с дерепрессированным синтезом Ферментов pur-оперона и вы-
- г -яснение роли этих мутаций в накоплении инозина; 4) разработка методов селективного отбора мутантов В. subtil is. способных к сверхпродукции инозина и их Физиолого-биохимическое исследование; 5) локализация на хромосоме В. subtil is мутаций, обуславливающих свєрхпродукшш инозина.
Научная новизна работы. Показано, что введение мутации adec в геном В. subtilis (put guao приводит к возникновению чувствительности к адениловым производным, бактериостатический эффект которых снимается только при добавлением в среду природных 6-оксипуринов. Последовательное введение мутаций, усиливающих биосинтез пуринов de novo, также приводит к устранению ингибирования роста адениловими производными.
Выделены и картированы на хромосоме В. subtilis мутация аденинрезис-тентности (Ad ) с дерепрессированной экспрессией генов, кодирующих Ферменты биосинтеза пуринов, и мутация по Ad-дезаминазе. показано, что эти мутации несущественны для накопления инозина. Разработана система селективных Факторов для выделения класса мутантов - продуцентов инозина. Эта мутация, обозначенная срш. локализована на хромосоме В. subti-lls вне pur-оперона в районе spooa (215*).
Установлено, что мутация срш приводит к аденинзависимости, не обусловленной инактивацией sAHP-синтетазы (ген ригА). а также к потребности в ароматических аминокислотах и другим плейотрошшм эффектам.
Научно-практическая значимость работы. В научной и патентной литературе в настояшее время существуют представления о механизме сверхпродукции и способах получения продуцентов пуринов, в том числе инозина. В основе этих представлений лежит, во-первых, получение нутации в гене контролирующем синтез sAHP-синтетазы (приводящей к ауксотрофности по аденину. ген ригА). Во-вторых, последовательное введение мутаций: ауксотрофности по ароматическим аминокислотам и гуанину, увеличению 5'-нуклеотидазной активности и дефекту Ферментов катаболизма нуклеозидов. В-третьих, введение мутации устойчивости к аналогам пуринов, приводя-
шей к дерепрессии синтеза Ферментов pur-оперона.
В настояшей работе показано, что сверхпродукция инозина у В. subtl-1 is находится под контролем гена сргп. При конструировании штаммов-продуцентов пиримидинов у коринебактерий и бацилл (АС N923186, 1981; Nud-1ег А.. 1991) нутация срш и ей подобные имеют решающее значение при селекции продуцентов IMP. уридина, UMP. тимидина и других соединений нук-леотидной ПРИРОДЫ.
Структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов экспериментов и их обсуждения, выводов и списка литературы. Рисунков 23, таблиц 16. библиография -261 литературный источник.