Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы Рекомбинация плазмид с дрож жевыми хромосомами 9
Глава 2. Материалы и методы 20
2.1. ШтаММЫ дрожжей S. cerevisiae 20
2.2. Культуральные среды 20
2.3. Характеристика использованных плазмид . 20
2.4. Трансформация дрожжей 28
2.5. Методы генетического анализа 28
2.5.1. Анализ митотической стабильности трансформантов и интегрантов 28
2.5.2. Селекция /cirV трансформанта на высокую нестабильность и отбор интегрантов 29
2.5.3. Определение частоты хромосомной интеграции плазмиды (флуктуационный тест) 31
2.5.4. Эффективность споруляции гибридов . 32
2.5.5. Получение споровых сегрегантов и метод тетрадного анализа 33
2.5.6. Анализ митотической стабильности гибридов 36
2.5.7. Получение дрожжевых штаммов /cir/ генотипа 37
2.6. Методы биохимического анализа 39
2.6.1. Тест на бета-лактамазную активность 39
2.6.2. Определение 2 мкм ДНК 40
2.7. Анализ нуклеотидных последовательностей ДНК 40
Глава 3. Поведение эшсомной ш1азмиды в траншюрмантах и интегрантах 41
3.1. Стабильность трансформантов по плазмидному маркеру 41
3.2. Экстрахромосомяое наследование плазмиды pYP9i 45
3.3. Интеграция эписомнои плазмиды pYF9i в дрож жевые хромосомы 47
3.3.1. Эффективность интеграции эписомнои плазмиды 47
3.3.2. Специфичность хромосомной интеграции эписомнои плазмиды 48
3.3.2.1. Идентификация хромосом, в которые произошла интеграция плазмиды 49
3.3.2.2. Картирование сайтов интеграции плазмиды в химерных хромосомах 54
А. Картирование сайтов интеграции плазмиды в Ш химерной хромосоме 56
Б. Картирование сайтов интеграции плазмиды в других химерных хромосомах 59
3.3.3. Экспрессия и наследование бактериального гена в составе интегрированной плазмиды 63
3.3.4. Стабильность химерных хромосом в гаплоидных интегрантах 65
Глава 4. Мейотическая рекомбинация у диеловдов, содеиащих интегрированную ішазмиду 71
4.1. Выживаемость спор в тетрадах гибридов, содержащих интегрированную плазмиду 71
4.2. Нерегулярное расщепление по плазмидным и хромосомным маркерам 81
4.3. Влияние интегрированной плазмиды на мейотический кроссинговер 93
Глава 5. Митоїическая дестабилизация ш'лерных хромосом в дишюидах 100
5.1. Дестабилизация химерных хромосом в гибридах интегрантов по Ш хромосоме 101
5.2. Дестабилизация химерных хромосом в гибридах интегрантов по І, ІУ и У хромосомам 108
5.2.1. Дестабилизация I химерной хромосомы 108
5.2.2. Дестабилизация ІУ химерной хромосомы 115
5.2.3. Дестабилизация У химерной хромосомы 118
5.3. Дестабилизация неидентифицированных химерных хромосом 131
5.4. Дестабилизация химерных хромосом в Rad" диплоидах 135
Глава 6. Обсуждение 138
Выводы 167
Приложение Штаммы дрожжей, сконструированные в ходе работы 169
Использованная литература
- Анализ митотической стабильности трансформантов и интегрантов
- Стабильность трансформантов по плазмидному маркеру
- Выживаемость спор в тетрадах гибридов, содержащих интегрированную плазмиду
- Дестабилизация химерных хромосом в гибридах интегрантов по Ш хромосоме
Введение к работе
Актуальность проблемы
Достижения технологии рекомбинантных молекул ДНК открыли неограниченные возможности в конструировании векторов, содержащих фрагменты ДНК самого различного происхождения. Особый интерес вызывают химерные, челночные векторы, включающие ДНК про- и эукариотов. Это связано с тем, что с их помощью возможно введение в эукариотическую клетку чужеродной генетической информации, что позволяет конструировать химерные геномы и, в конечном счете, новые, не встречающиеся в природе организмы. Очевидно, что такие организмы с искусственно совмещенными свойствами могут оказаться полезными и с хозяйственной точки зрения.
Для разрешения подобной задачи важным условием является разработка методов стабилизации чужеродной ДНК в клетках используемого организма. Удобным объектом для исследования этой проблемы
МОГуТ СЛУЖИТЬ ДРОЖЖИ Saccharomyces cerevisiae, ЧТО Обусловлено
их хорошей генетической изученностью, особенностями биологии и использованием в производстве. Стабильное наследование чужеродной ДНК, вводимой в клетки дрожжей в составе векторов, может быть достигнуто в результате либо хромосомной интеграции вектора, либо его стабилизации в виде автономно реплицирующейся единицы. Нам представляется, что встраивание векторов в дрожжевой геном -более легкий и перспективный путь, чем разработка способов стабилизации автономных векторов. Однако, работы, в которых рассматривались бы генетические последствия рекомбинации между векторной (плазмидной) и хромосомной дрожжевой ДНК, малочисленны и до недавнего времени проводились с использованием плазмид лишь одного, интегративного типа. Автономно реплицирующиеся плазмиды в этом отношении практически не были изучены.
В связи с этим нам казалось своевременным исследовать возможность встраивания в дрожжевой геном автономно реплицирующихся химерных плазмид эписомного типа и, в случае успеха, изучить генетические последствия интеграции. Результаты исследования представлялись важными также и для разработки общей проблемы генетических последствий встраивания чужеродной ДЕК в эукариотические хромосомы.
2. Цель и задачи исследования
Целью работы было получение субклонов трансформантов, содержащих интегрированную в хромосомы эписомную химерную плазмиду PYP9I, т.е. интегрантов, и изучение генетических последствий такой интеграции. Конкретные задачи исследования предусматривали: I) разработку метода отбора интегрантов из штаммов, трансформированных плазмидой pYF9i; 2) определение частоты интеграции плазмиды pYF9i в дрожжевые хромосомы; 3) получение коллекции интегрантов при использовании нескольких трансформантов; 4) определение хромосом, в которые произошла интеграция плазмиды pYP9i, и картирование сайтов интеграции в этих хромосомах; 5) изучение стабильности химерных хромосом (хромосом, содержащих плазмиду) в гаплоидных иятегрантах и их гибридах.
3. Научная новизна и практическая ценность
Разработан метод отбора субклонов трансформантов, содержащих интегрированную в хромосомы эписомную плазмиду PYP9i. На основе этого метода впервые определена частота интеграции автономно реплицирующейся плазмиды в дрожжевой геном, которая оказалась не ниже чем 3,6 х 10"° на клетку на деление. Получена коллекция интегрантов, содержащих плазмиду pYF9i в различных хромосомах, причем интегранты по I и ІУ хромосомам выделены впервые. Показана стабильность химерных хромосом в гаплоидных иятегрантах (потеря ішазмидяого маркера с частотой менее 0,1$). Сохранение и стабильное наследование чужеродной бактериальной ДНК в составе интегрированной плазмиды продемонстрировано на примере интегран-та по Ш хромосоме. При этом бактериальный гея Арг экспрессировал-ся и сегрегировал в мейозе гибридов этого интегранта как менде-левский фактор.
Обнаружена нестабильность гибридов интегрантов в митозе. Изучены основные закономерности этого нового явления, названного дестабилизацией химерных хромосом. Показано, что дестабилизироваться может либо вся хромосома, либо только ее плечо, содержащее плазмиду. При этом обнаружено восстановление как плеча хромосомы в результате рекомбинационного механизма, так и всей хромосомы (восстановление эуплоидности) в результате митотического нерасхождеяия оставшейся гомологичной хромосомы.
На основе обнаруженного явления дестабилизации химерных хромосом в гибридах интегрантов намечены новые подходы к решению ряда проблем генетики дрожжей-сахаромицетов: картирования мутаций по группам сцепления; изучение полного генного состава отдельных хромосом; исследование полиплоидии, системы типов спаривания; решения вопроса о возможности хромосомной интеграции 2 мкм ДНК и др.
4. Апробация работы
Материалы диссертации докладывались или представлялись на
Всесоюзной конференции "Метаболические плазмиды бактерий" (Таллин, 1982), Всесоюзной конференции "Рекомбинантные ДНК" (Цущино -на - Оке, 1982), У Всесоюзном симпозиуме "Молекулярные механизмы генетических процессов" (Москва, 1983), Рабочем совещании по генетической инженерии дрожжей (Гатчина, 1984), семинарах Ленинградского института ядерной физики АН СССР (Лаборатория молекулярной и радиационной биофизики) и Ленинградского государственного университета (Кафедра генетики и селекции).
Структура и объем работы диссертация состоит из введения; главы, в которой рассматриваются литературные данные по теме исследования; главы, посвященной описанию использованных материалов и методов; трех глав, содержащих экспериментальные данные; главы, посвященной обсуждению экспериментальных результатов и рассмотрению их прикладного значения; выводов.
Работа изложена на 189 стр., содержит 9 рисунков и 48 таблиц. Список использованной литературы включает 147 наименований.
Анализ митотической стабильности трансформантов и интегрантов
Первоначальные попытки выделить стабильные субклоны (интег-ранты), используя /сіг+/ трансформанты штамма 6-Д3005/рїР9і, окончились безрезультатно. В основном это объяснялось отсутствием системы отбора таких субклонов из культур трансформантов, стабильно поддерживающих плазмиду (гл.З). Для преодоления этого препятствия была проведена селекция одного трансформанта (Т П) на высокую нестабильность. Отбор вели на М ЗА среде по признаку "колония малой величины, дающая в рассевах крупные субклоны". В результате получили линию Т П-8, которая в селективных условиях с высокой частотой теряла плазмиду. По данным биохимического анализа (гл.З) выделенная нестабильная линия траясформанта не содержала эндогенную 2 мкм плазмиду.
Система отбора стабильных субклонов была разработана для нестабильных /cir/ трансформантов на основе разницы в скорости роста трансформантов и интегрантов. Траясформанты, выращенные в селективных условиях, рассевали на селективную среду из расчета 1Сг 10 клеток с плазмидой на чашку. Рассевы инкубировали 4 суток и более. Крупные колонии, обычно появлявшиеся на вторые сутки на фоне едва различимых остальных колоний, отделяли и переносили на YPD/2 среду. Для контроля отсевали также нормальной величины колонии. После инкубации рассевы переносили на селективную среду. В подавляющем большинстве случаев наблюдали два типа стабильности рассеянных колоний: полную стабильность крупных субклонов и высокую нестабильность (менее Wfo клеток с плазмидой) контрольных колоний. Крупные стабильные колонии рассматривали в качестве предполагаемых интегрантов.
Впоследствии методика отбора стабильных субклонов трансформантов была упрощена. Это оказалось возможным благодаря наблюдению, что в клонах трансформантов при старении на селективной среде происходило накопление клеток с интегрированной плазмидой. В крайнем случае такое накопление проявлялось в том, что весь клон трансформанта был представлен клетками с интегрированной плазмидой. Однако, чаще стареющий клон был представлен смесью клеток, содержащих плазмиду pYP9i либо в свободной форме, либо в интегрированном состоянии. Доля клеток с интегрированной плазмидой варьировала в каждом конкретном клоне и, по-видимому, определялась самим процессом "старения" клона. Подробнее это явление нами не исследовалось.
Упрощенная методика отбора интегрантов заключалась в следующем. Отдельные колонии траонформанта рассевали с селективной среды на YPD/2 среду. Выросшие колонии переносили на селективную среду. При анализе отпечатков лишний раз удостоверялись, что в рассев взяли колонию трансформанта (меньше 10$ колоний с плазмидой). Затем чашки с отпечатками оставляли "стареть" при комнатной температуре не менее недели. Обычно для этих целей готовили среду, содержащую менее 15 г агара на I л среды. После старения каждую колонию-отпечаток суспендировали в воде и рассевали на YPD/2 среду. Выросшие колонии переносили на селективную среду для определения процента субклонов с плазмидой. Как правило, это значение было больше 10$ (что характерно для трансформантов), но меньше 100$ (что характерно для интегрантов). Если значение процента субклонов с плазмидой приближалось к 100$, то при повторном рассеве любой крупной колонии трансформанта (брали ее отпечаток с селективной среды) наблюдали полную стабильность по -плазмидному маркеру, т.е. выделяли предполагаемый интегрант. В иных случаях брали несколько крупных колоний и каждую анализировали на стабильность. Обычно одна или две из них оказывались стабильными по плазмидному маркеру.
Для уверенности в независимости событий интеграции плазмиды в дальнейший анализ брали, как правило, лишь одну из стабильных колоний, выделенных в рассеве данной колонии трансформанта.
Стабильность трансформантов по плазмидному маркеру
Преследуя главную цель - получение интегрантов и изучение их свойств, - мы прежде всего проанализировали стабильность полученных трансформантов штамма 6-Д3005 по плазмидному маркеру . Такой анализ был необходим в связи с тем, что давал представление о возможном методе отбора интегрантов. По-видимому, единственным способом отбора интегрантов мог быть лишь отбор по стабильности, ибо других фенотипических различий между интегранта-ми и трансформантами не существует. В связи с этим для решения поставленной задачи необходимы были нестабильные трансформанты, причем, чем выше была бы их нестабильность, тем лучше.
Известно, что стабильность трансформантов варьирует в широких пределах и в основном зависит от используемой плазмвды. В случае эписомных плазмид важно учитывать два момента: а) целую 2 мкм ДНК или ее фрагмент содержит данная плазмида и б) присутствует ли эндогенная 2 ;мкм "шшзмвда в трансформанте. Показано, -что эписомные плазмиды, содержащие фрагмент 2 мкм ДНК, к числу которых относится использованная нами pYP9i, относительно стабильны в /cir+/ трансформантах, но крайне нестабильны в отсутствии 2 мкм плазмиды (гл.1). Следовательно, плазмида pYP9i должна была часто теряться в трансформантах /cir/ генотипа. И действительно, в ходе проверки /cir/ и /cir+/ трансформантов на стабильность по плазмидному маркеру наиболее нестабильными оказались /cir/ трансформанты, теряя плазмиду с частотой более 90,0$ в селективных условиях после 10 генераций роста (около двух суток роста на плотной среде). /cirV трансформанты теряли эту же плазмиду с частотой не более 20,0$ в тех же условиях и за то же время культивирования (табл.4).
Трансформанты /cir/ генотипа, характеризующиеся столь высокой нестабильностью плазмиды pYF9i, были в дальнейшем использованы для отбора интегрантов. Однако, в начале работы мы имели лишь /cir+/ трансформанты. Попытки выделить интегранты в их рассевах окончились безрезультатно. В связи с этим была проведена селекция одного /cir+/ трансформанта на нестабильное поддержание плазмиды. Принципы такой селекции изложены в гл.2. В результате была отобрана высоко нестабильная линия трансформанта Т П-8, данные по стабильности которой также приведены в табл.4. Как видно, субклон Т П-8 практически не отличался по стабильности от /cir/ трансформантов, а его гибрид со штаммом 88А-Д3008 -от /cir+/ трансформантов. Это позволило высказать предположение, что в процессе селекции был отобран субклон, не содержащий 2 мкм плазмиду.
Для решения этого вопроса мы выделили экстрахромосомную ДНК трансформантов Т П и Т П-8 (брали клоны, потерявшие плазмиду pYP9D и провели ее идентификацию на предмет сравнения с 2 мкм шгазмидой методом электрофореза, В качестве контроля использовали ДНК, выделенную из штаммов известного /oir+/ и /cir/ генотипа. Полученные результаты в виде электрофореграммы приведены на рис.6. Очевидно, что субклон трансформанта Т П-8 не содержал какую-либо экстрахромосомную ДНК, идентичную по подвижности 2 мкм ДНК, и в этом отношении не отличался от штамма /с±г/ генотипа. Это подтверждало высказанное выше предположение, что в процессе отбора был выделен субклон трансформанта, потерявший
Биохимический анализ штаммов на содержание 2 мкм ДНК. Использованные штаммы: А - 88А-Д3008 /cir+/ генотипа; Б -А62-ІГ-Ш88 /cir/ генотипа; В - траяоформант Т П-8 Ьей- фенотипа (анализируемый /cir/ генотип); Г - трансформант Т П /ехг+/ генотипа, Ьеи" фенотипа. Область нахождения 2 мкм дрожжевой плаз-миды показана стрелкой. Очевидно, что на дорожках Б и В отсутст-вуют какие-либо полосы, Эяектрофореграмма любезно предоставлена сотрудником ЖРБ ЛИЯФ В.Т.Пешехояовым. 2 мкм плазмиду. И, следовательно, высокая нестабильность плазми--ды pYF9i в этом трансформанте определялась его /сіг/ генотипом. В связи с этим стало понятно, почему гибрид этого транеформанта (Д3020/р1Р91) и его споровые еегреганты сравнительно стабильно поддерживали эту плазмиду (табл.4 и 6). Очевидно, это было обусловлено привнесением в гибрид 2 мкм плазмиды, которую содержал штамм-партнер по скрещиванию 88А-Д3008.
Прежде, чем выделять стабильные по плазмидному маркеру субклоны трансформантов и изучать их свойства, необходимо было убедиться в том, что мы действительно имели дело с экстрахромосомным элементом - плазмидой pYP9i. Для этого были сконструированы гибриды трансформанта Т П-8 со штаммом 88А-Д3008 (Д3020/рїР9і) и изучено распределение копий эписомнои плазмиды в продуктах их мейоза. Результаты проведенного анализа (табл.5) указывали на то, что данная плазмида поддерживалась в /cir+/ диплоидах в небольшом числе копий (что характерно для аналогичных эписомных плазмид /116/), но при этом сегрегировала в споры достаточно равномерно.
Выживаемость спор в тетрадах гибридов, содержащих интегрированную плазмиду
В ходе картирования сайтов интеграции плазмиды в интегрантах по различным хромосомам был собран большой материал по выживаемости спор в полных тетрадах /cir+/ их гибридов. Эти данные приведены в табл.19, в которую для сравнения включены также данные по выживаемости спор в тетрадах гибрида трансформанта, содержащего автономную плазмиду. Анализ спор гибридов иятегрантов на жизнеспособность представлялся нам важным потому, что мог выявить возможную взаимосвязь между процессами дестабилизации и рекомбинации химерных хромосом в мейозе.
Как видно из приведенных данных (табл.19), гибриды иятегрантов по І, ІУ и У химерным хромосомам не отличались по жизнеспо Примечание. - было учтено лишь число тетрад с четырьмя жизнеспособными спорами; ш - в этих колонках приведено число тетрад. собности спор от контроля - диплоидного траясформанта. В то же время гибриды иятегрантов по Ш хромосоме давали достоверно меньше тетрад с четырьмя жизнеспособными спорами и больше тетрад с двумя и тремя спорами. Отметим, что гибриды интегрантов разных классов по Ш хромосоме, различающиеся по типу митотической нестабильности (гл.5), не отличались друг от друга по анализируемому признаку, за исключением гибрида Д3020-8, дававшего высокий процент тетрад с двумя жизнеспособными спорами. На основании этого было высказано предположение, что дестабилизация химерных хромосом в мейозе в общем не сказывается на жизнеспособности гаплоидных продуктов мейоза, что, возможно, связано с высокой "самоизлечивающейся" способностью дестабилизированных хромосом. Тогда пониженная жизнеспособность спор гибридов интегрантов по Ш хромосоме могла быть обусловлена тем, что Ш химерная хромосома при дестабилизации не могла эффективно восстанавливаться путем рекомбинации с гомологом или сестринской недестабилизированной хроматидой. Для проверки этого предположения мы попытались выяснить, не связана ли жизнеспособность спор, содержащих химерную Ш хромосому, с рекомбинацией в этой хромосоме. Для этого были проанализированы тетрады с двумя и тремя жизнеспособными спорами.
Данные по расщеплению плазмидного маркера в полутетрадах гибрида Д3020-8 приведены в табл.20. Как видно, подавляющее большинство полутетрад содержали споры с нехимерной Ш хромосомой, т.е. были Leu" фенотипа. Если к ним добавить также полутетрады с нестабильными Leu+ сегрегантами, т.е. спорами lеи2 генотипа, содержащими некий автономный Leu+ фактор, то общее число спор с нормальной (без плазмиды) Ш хромосомой составит 82 из 86. Следовательно, у гибрида Д3020-8 предпочтительно гибли споры с химерной Ш хромосомой. Наиболее вероятно, что их гибель была вызвана инактивацией химерной хромосомы в процессе дестабилизации. Продукты такой дестабилизации (возможно, связанной с эксцизией интегрированной плазмиды) могли сообщать некоторым спорам нестабильный Leu+ фенотип. Подробнее природу Ьеи+ фактора не изучали. Заметим, что так как гибли обе споры с химерной хромосомой, то эта хромосома скорее всего дестабилизировалась еще в митозе, до стадии двух хроматид.
Так как гибрид Д3020-8 содержал химерную хромосому с плаз-мидой, встроенной в область 1еи2 гена, фланкированного his4 геном, расположенным дистальнее в том же плече Ш хромосомы, и МАТ локусом, расположенным в другом плече этой хромосомы, то мы смогли проанализировать рекомбинацию го этим маркерам в полутетрадах этого гибрида. Генотипы спор рекомбинантных полутетрад приведены в табл.21.
Однако, для решения вопроса о возможной связи между жизнеспособностью спор и рекомбинацией хроматид Ш хромосомы необходимо было провести сравнение частоты рекомбинантных хроматид в полутетрадах гибрида Д3020-8 с соответствующими значениями для полных тетрад этого гибрида.
Дестабилизация химерных хромосом в гибридах интегрантов по Ш хромосоме
В главе 3 были приведены данные по идентификации хромосом штамма 6-Д3005, в которые произошла интеграция плазмиды pYF9i. Как показано, большинство интегрантов содержали эту плазмиду в Ш хромосоме. Гибриды таких интегрантов (серии Д3020) были проверены на митотическуто стабильность. Большинство гибридов оказались нестабильными, выщепляя субклоны Leu- фенотипа с частотой от 3,8 до 30$ после 20 генераций роста в селективных условиях. При этом проявлялись также маркеры гомологичной Ш хромосомы. Исключение составили /cir+/ гибриды трех интегрантов (Т ЇЇ-8-28, То ІУ-І0 и То ІУ-І4А), которые показывали полную стабильность по плазмидному и иным маркерам. Интеграяты таких стабильных гибридов были выделены в особый класс интегрантов по Ш хромосоме (класс 4). Интегранты нестабильных гибридов были разбиты на три класса в зависимости от того, в каких комбинациях проявлялись маркеры гомологичной хромосомы (табл.31). -нестабильности гибридов интегрантов первых двух классов, в которых, как показано в главе 3, плазмида встроилась в область 1еи2 гена. Гибриды интегрантов класса I выщепляли субклоны Leu- His" фенотипа, которые часто оказывались способными спариваться, тогда как гибриды интегрантов класса 2 наряду с субклонами такого же фенотипа выщепляли также колонии только His" фенотипа, которые в свою очередь часто проявляли половую активность. Отметим, что принципиальным отличием His" субклонов от субклонов Leu" His"" фенотипа было сохранение в первых субклонах плазмидного LEU2 маркера. Причиной наблюдаемого различия в нестабильности гибридов интегрантов двух классов могли быть разные способы встраивания плазмиды в область 1еи2 гена (гл.6).
Гибриды интегрантов класса 3 в отличие от первых двух групп сегрегировали многочисленные Leu" клетки, в основном способные к спариванию (табл.31). Такой тип нестабильности можно было объяснить только с точки зрения предпочтительной дестабилизации правого плеча Ш химерной хромосомы, что указывало на расположение в этом плече интегрированной плазмиды. Об этом также свидетельствовали данные картирования плазмидного маркера в гибриде Д3020-22С (гл.З). Кроме того, о предпочтительной дестабилизации правого плеча химерной хромосомы говорили данные анализа митоти-ческой стабильности гибридов интегрантов этого класса серии М896 (табл.32).
Таким образом, гибриды выделенных нами интегрантов по Ш хромосоме (за исключением интегрантов класса 4) проявляли мито-тическую нестабильность по плазмидному маркеру и маркерам гомологичной хромосомы. Потеря плазмидного LEU2 маркера не всегда сопровождалась гомозиготизацией хромосомного маркера, тогда как "проявление" хромосомного маркера либо строго коррелировало с потерей плазмидного маркера (гибриды интегрантов классов I и 3), либо не коррелировало с этим событием (гибриды интегрантов класса 2). Частота гомозиготизацин определенных хромосомных маркеров зависела от того, в каком плече химерной хромосомы располагалась интегрированная плазмида. Чаще "проявлялись" маркеры, расположенные в том же плече хромосомы, в которое интегрировалась плазмида. Отметим также, что нестабильность была свойственна лишь /cir+/ гибридам интегрантов. Полная стабильность /cir/ гибрида интегранта Т П-8-22А (табл.31) указывала на то, что фактором, определяющим нестабильность, действительно была 2 мкм плазмида дрожжей.
Кроме отмеченных закономерностей использование гибридов интегрантов по Ш хромосоме позволило обнаружить явление восстановления плеча дестабилизированной в митозе химерной хромосомы. На это указывало появление выше упомянутых Leu " His- тетрад гибридов интегрантов первых двух классов по Ш хромосоме. В каждой такой тетраде, содержащей все четыре споры одинакового генотипа (за исключением МАТ локуса), две споры имели Ш хромосому, явно происходящую от химерной хромосомы, ибо были МАТа генотипа. В то же время в левом плече этой хромосомы вместо прототрофного находился мутантний аллель his4 гена, ранее присутствовавший в гомологичной хромосоме. Следовательно, в случае этих спор имело место перемещение Ms4 гена из гомологичной в химерную хромосому одновременно с потерей плазмидного маркера в химерной хромосоме. Однако, эти события могли быть лишь результатом дестабилизации левого плеча химерной хромосомы в митозе (совместная потеря плазмидного LEU2 И хромосомного HIS4 генов) и его последующего рекомбинационного восстановления за счет нормальной гомологичной хромосомы. При чем, такое восстановление, рассматриваемое в главе 6, должно было быть правильным и полным, иначе две споры были бы нежизнеспособными.
Восстановление только правого плеча (в митозе гибридов интегрантов класса 3) или всей химерной хромосомы, т.е. замещение ее целой гомологичной хромосомой (в митозе гибридов интегрантов всех классов по Ш хромосоме) мы не смогли доказать, ибо клетки oCLeiT и otLeu- His" фенотипов не спорулировали.
