Введение к работе
Актуальность проблемы. Основой успешной реализации потенций генотипа является способность к онтогенетической адаптации, которая проявляется в пределах нормы реакции т.е. способности организма формировать определенный фенотип в ответ на воздействие окружающей среди (Ватти,Тихомирова,1987).
Онтогенез высших растений протекает в прикрепленном состоянии, а способы защиты от повреждающих и уничтожающих факторов базируются на способности к регенерации, широко распространенной в растительном мире. У растений она может быть связана с восстановлением тех или иных тканей, органов и даже восстановлением целого организма. Регенерация осуществляется за счет активации апикальных меристем или вовлечения процессов дедифференцировки с последующей вторичной дифференцировкой (Кренке,1950).
Для повышения адаптационной способности у растений необходимо вычленение генов, определяющих возможность "начать все заново." В этом случае в полной мере реализуется уникальное сзойство растительной клетки - тотипотенткость.
Познание теоретической основы онтогенетической адаптации позволит использовать процессы дифференцировки как основу клеточной селекции для получения перспективных форм растений, надежно защииенных от вредителей сельского хозяйства биологическими барьерами.
Целью нашей работы явилось изучение генетического контроля признаков тотипотентности как фактора онтогенетической адаптации у высших растений методом культивирования клеток, тканей и органов в строго контролируемых условиях. Реализацив тотипотентности оценивали по признакам дедифференцировки - каллусообразование, и вторичной дифференцировки - корне- и побегообразование. Для характеристики в комплексе всей совокупности признаков, проявляющихся на изолированном органе in vitro: каллусо-, корне- и побегообразование,мы вводили в работе понятие "регенерационная способность".
Объектами изучения служили виды с разной биологией размножения: редис Raphanus sativum var. radicola Pers., (перекрестник), горох Pisum sativum L. (самоопылитель).
картофель Solanum tuberosum L., Solanum nigrum L. (способный к вегетативному размножению). В некоторых экспериментах in vitro использован табак Nicotiana tabacum L.
Дифференцирующим фоном для реализации признаков регенерационной способности служили среды с экзогенными фитогормонами и без них, что позволило выявить роль эндогенного баланса физиологически активных веществ в определении тотшютентности, а также роль экзогенных фитогормонов в становлении данного свойства. В качестве природного фактора, модифицирующего гормональный статус, использовали фитопа-тогенные бактерии A.tumefaciens и A.rhizogenes, которые в результате трансформации вносят в геном растения гены биосинтеза фитогормонов. Процессы дедифференцировки и дифференцировки оценивали как по морфофизиологическим признакам, так и на примере маркера стрессовых воздействий - фермента пероксидазы, экспрессию которого изучали в ответ на повреждение.
Выявленные в процессе работы формы с наибольшей способностью к регенерации были использованы в специальной модельной системе "растение - патогенный организм", позволяющей получать устойчивые формы растений к патогенам. Задачи исследования:
-
Изучение регенерационной способности высших растений как генетического признака, имеющего адаптивное значение, на примере видов с разной биологией размножения (редис, горох, картофель);
-
Изучение особенностей регенерации у редиса на фоне экзогенных фитогормонов: получение фенокопий, выявление спонтанных гормональных мутантов и их анализ;
-
Изучение дифференциальной экспрессии генов пероксидазы Рх-1 и Рх-2 в ходе нормального онтогенеза и при стрессовых воздействиях in vitro;
-
Изучение роли генотипа высшего растения при взаимодействии с фитопатогенной агробактерией - природным регулятором баланса фитогормонов;
-
На основе методов клеточной селекции получение растений, устойчивых к вредителям сельского хозяйства, которые зависят в своем развитии от. фитостеринов.
Научная новизна. В ходе исследования нами впервые изучен генетический контроль признаков тотипотентности в условиях культуры изолированных органов по признакам каллусообразования (де-дифференцировка), корне- и побегообразования (вторичная диффере-нцировка). Для видов с разной биологией размножения (редис, горох, картофель) описана генотипическая изменчивость по этим признакам; у редиса выявлено три гена, которые контролируют способность корне- и каллусообразования (R s , R 1 и С), связанных с функцией фитогормонов.
У редиса выявлен новый доминантный и моногенный цитокинин-чувствительный мутант, фенотипически проявляющийся как способность образовывать корнеплодоподобные структуры у эксплантов проростков.
Впервые показано изменение спектра пероксидаз при стрессовых воздействиях по экспрессии Рх-1 и Рх-2 генов, соответствующее определенному типу дифференцировки.
Показано, что характер взаимодействия растений с фитопато-геном определяется генотипом и зависит от гормонального статуса растения. Впервые на примере гороха и картофеля выявлена взаимосвязь между способностью к регенерации и трансформации.
Формы с интенсивной регенерацией были использованы в клеточной селекции в модели "растение- патогенные организмы", и результате чего получены растения, устойчивые к патогенам, зависящим в своем развитии от фитостеринов.
Практическое значение работы. Полученные в ходе работы данные, клеточные штаммы, формы растений имеют определенное прикладное значение:
-
Генотипичсские различия по признакам тотипотентности у гороха коррелируют со способностью к регенерации и клубенькооб-разованию, что может быть использовано в программах селекции на эффективность симбиотической азотфиксации.
-
Разложение свойства тотипотентности на отдельные признаки (каллусо-, корне- и побегообразование) дает возможность изменять ее в селекционной процессе и получать формы с повышенной адаптационной способностью к действиям биотических и абиотических факторов среды, включая патогены.
-
Для гороха и картофеля выявлены легко трансформируемые
генотипы, которые могут быть использованы для получения трансгенных растения.
Апробация работы. Результаты работы были представлены на Всесоюзном симпозиуме "Молекулярные механизмы генетических процессов" (Москва, 1973), на четырех ' Съездах Всесоюзного общества генетиков и селекционеров (Ленинград,1977;Кишинев,1982; Москва,1987;Минск, 1992); на Всесоюзных конференциях по генетике соматических клеток (Звенигород, 19G6, 1989); на республиканской конференции "Гаметная и зиготная селекция растении" (Кишинев, 1987); на Международном генетическом конгрессе (Москва, 1978); на Международном конгрессе по симбиозу (Иерусалим, Израиль, 1991); на Международном конгрессе по азотфиксации (Канкун-Мехи-ко, Мексика); на Российско-Германском совещании по молекулярной биологии (Москва, 1992); на Международном съезде по физиологии и биохимии растений (Санкт-Петербург, 1993) и др.
Публикации.. По материалам диссертации опубликовано 72 научные работы и получено 2 авторских свидетельства.
Объем и структура работы.. Диссертация изложена на 321 страницах машинописного текста, содержит 58 таблиц, иллюстрирована 23 рисунками и схемами, дополнена приложением о фотографиями. Диссертация состоит из 5-ти глав, построенных по одному плану: обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, заключение, выводы; имеется общее введение и заключение, список литературы.