Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы
1.1. Особенности генетического разнообразия населения Северной Евразии 14
1.2. История развития идентификации человека .16
1.3. Маркеры ДНК-идентификации
1.3.1. Микросателлиты .19
1.3.2. Однонуклеотидные замены (SNP) 23
1.4. Методы ДНК-идентификации 26
1.4.1. Детекция STR маркеров .26
1.4.2. Детекция SNP маркеров .27
1.5. Генетические особенности Х-хромосомы и использование
Х-маркеров в популяционной генетике и криминалистике 31
Глава 2. Материалы и методы
2.1. Материалы исследования .38
2.2. Маркеры
2.2.1. Характеристика используемых микросателлитных маркеров 41
2.2.2. Характеристика используемых SNP маркеров 52
2.3. Методы исследования .54
2.3.1. Выделение ДНК 54
2.3.2. Анализ STR-маркеров
2.3.2.1. Полимеразная цепная реакция 55
2.3.2.2. Генотипированием STR-маркеров 56
2.3.3.1. Секвенирование
2.3.3. Анализ SNP-маркеров 58
2.3.4. Статистические методы .67
Глава 3. Результаты и обсуждение
3.1. Частоты аллелей и генетическое разнообразие внутри популяций 70
3.1.1. Анализ STR-маркеров .70
3.1.2. Анализ SNP-маркеров
3.1.2.1. Отбор информативных SNP-маркеров .76
3.1.2.2. Анализ генетического разнообразия SNP-маркеров .81
3.2. Генетическая дифференциация популяций 84
3.2.1. Анализ STR-маркеров .84
3.2.2. Анализ SNP-маркеров .87
3.3. Генетические взаимоотношения между популяциями .89
3.3.1. Анализ STR-маркеров .89
3.3.2. Анализ SNP-маркеров .93
3.4. Корреляционный анализ генетических и географических расстояний .97
3.5. Анализ структуры неравновесия по сцеплению 100
3.5.1. Анализ STR-маркеров .100
3.5.2. Анализ SNP-маркеров .103
3.6. Криминалистические показатели 106
3.6.1. Идентификационный потенциал систем Х-хромосомных маркеров .106
3.6.1.1. Идентификационный потенциал систем Х-хромосомных маркеров в популяции русских (г. Кострома, г. Томск) . 110
3.6.1.2. Идентификационный потенциал систем Х-хромосомных маркеров в популяции тувинцев (Кызыл) .112
3.6.1.3. Идентификационный потенциал систем Х-хромосомных маркеров в популяции хантов (д. Русскинская, с. Казым) 115
3.6.1.4. Идентификационный потенциал систем Х-хромосомных маркеров в популяции казахов 116
3.6.1.5. Идентификационный потенциал систем Х-хромосомных маркеров в популяции бурят (с. Агинское, с. Курумкан) 118
3.6.1.6. Идентификационный потенциал систем Х-хромосомных маркеров в популяции сибирских татар (г. Томск) .120
3.6.1.7. Идентификационный потенциал систем Х-хромосомных маркеров в популяции хакасов (Аскизский район) .122
3.6.2. Сравнительный анализ идентификационной информативности Х-хромосомных и аутосомных систем
генетических маркеров .124
Заключение .129
Выводы 132
Список использованных источников и литературы
- История развития идентификации человека
- Характеристика используемых микросателлитных маркеров
- Отбор информативных SNP-маркеров
- Идентификационный потенциал систем Х-хромосомных маркеров в популяции русских (г. Кострома, г. Томск) .
Введение к работе
Актуальность проблемы.
Популяционно-генетические исследования населения России, выполненные с использованием различных систем генетических маркеров, выявили высокое внутри и межпопуляционную генетическую вариабельность, существенные генетические отличия между популяциями, принадлежащими к различным этническим и географическим регионам (Степанов В.А., 2002; Лавряшина М.Б., 2012; Харьков В.Н., 2005, 2012; Балановская Е.В. и др., 2007; Хитринская И.Ю., 2003 и др.). Структура генофонда населения Российской Федерации была исследована с помощью таких маркерных систем как «классический» белковый полиморфизм (Рычков Ю.Г., 1992; Балановская Е.В. и др., 2007 и др.), линий мтДНК (Голубенко М.В., 1998; Деренко М.В. и др., 2010; Батырова А.З., 2004; Грошева А.Н. и др., 2014; Балановский О.П., 2012 и др.), Y-хромосомы (Харьков В.Н. и др., 2007, 2011, 2013, 2014; Харьков В.Н., 2005, 2012; Балановский О.П., 2012; Схаляхо Р.А. и др., 2012; Балаганская О.А. и др., 2011; Лепендина И.Н. и др., 2010; Падюкова А.Д. и др., 2014 и др.), аутосомные Alu-повторы (Хитринская И.Ю., 2003; Хитринская И.Ю и др., 2001, 2014; Лепендина И.Н. и др., 2013 и др.), и другие отдельные аутосомные локусы (Лавряшина М.Б и др., 2010, 2011; Песик В.Ю. и др., 2014; Степанов и др., 2011; Zhivotovsky L.A. et al., 2009 и др.), широкогеномные панели аутосомных SNP (Kushniarevich A. et al., 2015; Степанов В.А. и др., 2010). В то же время данные о популяционной вариабельности Х-сцепленных маркеров в популяциях России очень ограничены (Хитринская И.Ю. и др., 2010).
Популяционно-генетические данные являются основополагающими для разработки методов ДНК-идентификации и их применения. Вероятностная оценка достоверности выводов генетической экспертизы проводится на основе данных о частотах аллелей генетических маркеров в референтной популяции (Степанов В.А., и др., 2011; Пименов М.Г. и др., 2001).
Существующие в настоящее время, генетические тест-системы, используемые в практике экспертно-криминалистических служб, как за рубежом, так и в России, разработаны на основании данных о генетическом разнообразии США и стран Европы. Наиболее информативными для генетической экспертизы в России являются те тест-системы, которые были адаптированы для использования на территории России или же разрабатывались на основе данных о генетическом разнообразии населения РФ. Использование генетических систем ДНК-идентификации без учета генетической специфичности популяции, из которой происходит исследуемый ДНК-профиль, снижает достоверность выводов (Степанов В.А. и др., 2011).
В практике ДНК-идентификации долгое время использовались тест-системы, основанные на микросателлитных локусах аутосом, однако ограниченность возможностей этих маркеров привела к внедрению систем, основанных на маркерах мтДНК, Y-хромосомы, Х-хромосомы (Jobling M.A. et al., 2004). При этом Х-хромосомные маркеры стали применяться в судебной медицине позднее (Szibor R., 2007).
Основными преимуществами Х-хромосомных маркеров являются особенности наследования и отсутствие рекомбинации у мужчин. За счет этого они являются удобным инструментом для сложных случаев экспертизы родства, например в случаях отсутствия ДНК предполагаемого отца или при генетическом анализе жертв катастроф, где необходимо установить семейные отношения.
Кроме того, данные о генетической структуре популяций по Х-хромосомным маркерам могут служить дополнительным инструментом для реконструирования путей расселения современного человека и филогеографии его генетического разнообразия, поскольку в отличие от Y-хромосомы и мтДНК, Х-хромосома несет информацию о комбинативной изменчивости и с отцовской, и с материнской стороны, и удобна в изучении за счет гемизиготности мужчин (Schaffner S.F., 2004).
В связи с небольшим объемом данных о генетическом разнообразии населения РФ и ближнего зарубежья по Х-хромосомным маркерам представляется актуальным изучение генетической структуры популяций по маркерам X-хромосомы, а также формирование базы данных содержащей информацию о частотах аллелей в России и сопредельных государствах.
Степень научной разработанности темы исследования. При работе над диссертацией были изучены коллективные труды и отдельные монографии российских и зарубежных ученых, посвященные изучению генетической структуры популяций по маркерам Х-хромосомы и их применимости для решения задач криминалистики и судебной медицины. В литературе описана генетическая структура по Х-хромосомным маркерам для широкого ряда этнических групп: алжирцы (Bekada A., et al., 2010), бразильцы (Cain L. et al., 2010, 2013; Ferreira da Silva H., et al., 2010; Ribeiro-Rodrigues E. et al., 2011), венгры (Horvth G. et al., 2012), ганцы (Becker В. et al., 2008; Poetsch M. et al., 2009), датчане (Tomas С. et al., 2012), дауры (Hou Q.F. et al., 2007), египтяне (Elakkary S. et al., 2014), испанцы (Zarrabeitia M.T. et al., 2006; Aler M. et al, 2007), итальянцы (Turrina S. et al., 2003; Robino C. et al., 2006), индийцы (Shrivastava P. et al., 2015), китайцы (Deng J.Q. et al., 2003, 2004; Shi M.S. et al., 2003; Ying B.W. et al., 2003; Jia Y. et al., 2004; Gao S. et al., 2007; Liu Q.L. et al., 2011, 2012, 2013; Luo H.B. et al., 2011; Sun R. et al., 2012; Uchigasaki S. et al., 2013; Huang D. X. et al., 2015), корейцы (Son J.Y. et al., 2002; Lee H.Y. et al., 2004; Shin K.J. et al., 2004; Shin S.H. et al., 2005; Lim E.J. et al., 2009;
Sim J.E. et al., 2010), португальцы (Pereira R. et al., 2007; Silva F. et al., 2010; Cain L. et al., 2013), поляки (Pepinski W. et al., 2005; uczak S. et al., 2011), турки (Asicioglu F. et al., 2011; Uchigasaki S. et al., 2013), уйгуры (Liu Q.L. et al., 2012), японцы (Koyama H. et al., 2002; Tabbada K.A. et al., 2005; Asamura H. et al., 2006; Becker D. et al., 2008; Tie J. et al., 2010; Samejima M. et al., 2011; Nishi T. et al., 2013; Uchigasaki S. et al., 2013) и др. Из стран СНГ маркеры Х-хромосомы широко изучаются в Республике Беларусь (Rbaa K. et al., 2015). В России данные о генетическом разнообразии популяций по различным типам маркеров Х-хромосомы немногочисленны и фрагментарны (Хитринская И.Ю., и др., 2010).
Цель исследования: Выявить структуру генофондов народов России и ближнего зарубежья по маркерам Х-хромосомы и оценить информативность X-хромосомных STR и SNP систем для целей идентификации личности в популяциях Северной Евразии.
Задачи исследования:
-
Описать генетическую вариабельность STR-маркеров Х-хромосомы в популяциях Северной Евразии.
-
На основании анализа генетического разнообразия Х-хромосомных SNP маркеров отобрать маркеры, наиболее информативные для целей ДНК-идентификации, и описать их вариабельность в популяциях Северной Евразии.
3.Охарактеризовать генетическую дифференциацию по STR и SNP Х-хромосомным маркерам, генетические внутри- и межэтнические взаимоотношения популяций Северной Евразии, а также провести сравнительный анализ генофонда мировых популяций по маркерам Х-хромосомы.
4.Оценить идентификационный потенциал систем, основанных на STR и SNP маркерах Х-хромосомы, в популяциях России и стран ближнего зарубежья.
5.Провести сравнительный анализ идентификационного потенциала маркерных систем на основе STR и SNP X-хромосомы и аутосом.
6.Создать референтную базу данных частот аллелей маркеров Х-хромосомы для популяций Северной Евразии.
Научная новизна: В работе впервые описана генетическая структура и генетическое разнообразие ряда популяций Сибири, Восточной Европы и Средней Азии по панелям Х-хромосомных локусов информативных для ДНК-идентификации.
На основе данных о генетической структуре и генетическом разнообразии исследуемых этносов впервые были отобраны наиболее информативные для ДНК-идентификации в России X-SNP маркеры. Оценен идентификационный потенциал систем основанных на однонуклеотидных полиморфных и микросателлитных маркерах Х-хромосомы. В ходе работы была сформирована база данных аллельных частот в популяциях. Для ряда этнических групп,
проживающих на территории РФ и ближнего зарубежья, разработаны индивидуальные панели генетических маркеров информативных в сложных случаях тестирования родства.
Теоретическая и практическая значимость работы: В работе получены данные о генетической структуре популяций Сибири, Восточной Европы и Средней Азии по ряду Х-SNP и X-STR маркеров. Полученные данные дополняют сведения о генофонде народов Евразии и могут быть использованы для построения генетических карт и геногеографических атласов.
В ходе работы разработана панель генетических маркеров (X-SNPid) и база данных по частотам аллелей для ДНК-идентификации в криминалистике и судебной медицине на территории России и ближнего зарубежья. Особенно полезна разработанная тест-система в случаях идентификации неопознанных тел и тестировании родства в осложненных случаях. Материалы работы также могут быть использованы в научно-образовательном процессе студентов биологических, медицинских и юридических специальностей.
Методология и методы диссертационного исследования:
Методологической основой диссертационного исследования послужили труды отечественных и зарубежных экспертов в области изучения генетической структуры и генетического разнообразия популяций, а также в области ДНК-идентификации. В работе применялись следующие методы: выделение ДНК, полимеразная цепная реакция, капиллярный гель-электрофорез, MALDI-TOF масс-спектрометрия, статистические методы.
Положения диссертации, выносимые на защиту:
1.Генетическое разнообразие популяций Северной Евразии по маркерам Х-хромосомы демонстрирует географическую структурированность. Для монголоидных популяций, проживающих на территории РФ и ближнего зарубежья, характерен спектр аллельных частот Х-хромосомных STR-маркеров, типичный для популяций Восточной Азии; для европеоидных – типичный для популяций Европы.
2.Уровень популяционной дифференциации по Х-хромосомным маркерам выше такового по аутосомным STR-маркерам. Наибольший уровень межпопуляционной дифференциации на фоне низкого уровня генетического разнообразия характерен для коренных популяций Сибири.
3.Идентификационный потенциал тест-системы основанной на X-SNP маркерах (X-SNPid), эквивалентен информативности традиционно используемого стандарта аутосомных маркеров и может быть использован для проведения экспертизы ДНК. Декаплекс Х-STR маркеров также показал высокий идентификационный потенциал, по информативности данная панель маркеров
уступает аутосомной системе, содержащей большее число микросателлитных локусов.
Степень достоверности и апробация результатов: Достоверность научных выводов и положений основана на достаточном объеме материала, современных методах исследования и статистической обработке данных.
Апробация работы: Основные результаты работы были представлены на Межрегиональной научно-практической конференции «Современные молекулярно-биологические и генетические технологии в медицинской практике» (Симонова К.В., 2013); семинаре ЭКЦ МВД в г. Ростов-на-Дону; ежегодном областном семинаре следователей с приглашением сотрудников СК РФ из других регионов России; VIII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика – 2014» (Вагайцева К.В. и др., 2014); международной конференции «International Society for Applied Biological Sciences 2015» (Stepanov V.A., 2015); международной конференции «Humam Genome Meeting 2015» (Vagaitseva K.V., 2015); международной конференции «International Scientific Conference on Regenerative Medicine & Healthy Aging» (Berezina G. et al., 2012); молодежной конференции «Популяционная генетика и геногеография: наука и практика» (Вагайцева К.В., 2013); на X научной конференции «Генетика человека и патология: проблемы эволюционной медицины» (Вагайцева К.В. и др., 2014); научных семинарах НИИМГ. Работа выполнена при финансовой поддержке грантов ФЦП "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014-2020 годы" (соглашение 14.604.21.0019 от 17.06.2014); ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 2009-2013 годы» (государственный контракт № П321 от 07 мая 2010 г.).
По теме диссертации опубликовано 11 работ (2 статьи в журналах рекомендованных ВАК, 2 статьи в сборниках, 2 тезиса в отечественных материалах и 4 в зарубежных, 1 зарегистрированная база данных).
Диссертационная работа изложена на 223 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, глав «Материалы и методы» и «Результаты и обсуждения», заключения, выводов, списка литературы и приложения. Работа проиллюстрирована 37 таблицами (+ 39 таблиц в приложении) и 24 рисунками. Список литературы включает 251 источник, из них 37 на русском языке.
История развития идентификации человека
Первый метод идентификации человека по набору признаков был создан французским криминалистом Альфонсом Бертильоном в 1870 году. Набор антропологических измерений теоретически соответствовал только одному индивидууму и никому другому. Бертильон считал, что достаточно 14 параметров (рост, окружность головы, длина ступней, рук, ушей и т.д.), чтобы безошибочно отличить одного человека от другого без всяких портретов и особых примет. Он даже подсчитал, что при таком количестве параметров шанс их совпадения у двух разных людей по теории вероятности составляет 1 к 286 тысячам. Однако система себя не оправдала – она была чересчур сложной и непрактичной (Торвальд, 1974).
Вскоре ее вытеснила новая методика идентификации – дактилоскопия, автором которой был Фрэнсис Гальтон. Собственно, сам метод опознания преступников по отпечаткам пальцев был найден британским полицейским Уильямом Хершелом, служившим в колониальной Индии. Однако внедрению метода в полицейскую практику мешало отсутствие гарантий в том, что у двух людей не может быть одинаковых отпечатков. Гальтон, проанализировав множество отпечатков, математически обосновал невозможность совпадения отпечатков пальцев у разных людей (Stigler, 1995).
Проникновение гемоанализа (гемогенетики) в криминалистику связано с открытием Карлом Ландштейнером системы групп крови АВО. После успешного применения данного маркера для определения отцовства началась волна разработок маркеров групп крови и белков сыворотки крови. Их совместное использование давало довольно высокие дискриминационные профили, однако данный метод был ограничен во многих случаях. Во-первых, белок деградирует при воздействии внешней среды; во-вторых, для анализа требовались довольно большие по объему образцы биологического материала (Meer, 2002).
Со второй половины восьмидесятых годов в практику судебно-медицинской экспертизы начинают внедряться методы молекулярной генетики. Революционным событием, позволившим по-новому подойти к анализу биологического следа, стал метод ДНК-идентификации, предложенный Алексом Джеффрисом. Суть метода заключалась в разрезании молекулы ДНК определенными рестриктазами и последующей визуализацией длин фрагментов. Поскольку ДНК каждого человека обладает индивидуальными характеристиками, то не составляет особого труда выделить из нее набор фрагментов (VNTR, минисателлитов), который можно назвать генотипом индивида. И вероятность совпадения этого генотипа с генотипом другого человека близка к нулю. Как и отпечатки пальцев, отпечаток ДНК также сохраняется на протяжении всей жизни. По аналогии с отпечатками пальцев данный метод был назван ДНК-дактилоскопия (ДНК-фингерпринт) (Jeffreys et al., 1985).
Впервые предложенный метод ДНК-идентификации был применен в расследовании дел об убийстве с изнасилованием двух девушек, в 1983 и 1986 годах, в графстве Лестершир (Англия). Данные серологического анализа спермы найденной на телах жертв совпали, однако следуя лишь им можно было привлечь к уголовной ответственности около 10% мужского населения Британии. В связи с этим было принято решение использовать методику, предложенную Алексом Джеффрисом. Так ДНК-идентификация вошла в практику криминалистики исудебной-генетики (Wambaugh, 1989).
Дальнейшее развитие гегнетической экспертизы в криминалистике продвигалось семимильными шагами. Вот некоторые начальные этапы в развитии ДНК-идентификации. 1987г. – Введен строгий контроль качества проводимого анализа (Jobling et al., 2004). 1988г. – Создан первый коммерческий набор генетических маркеров для идентификации человека (Jobling et al., 2004). 1991г. – Охарактеризованы первые информативные микросателлитные локусы (STR) человека (Edwards et al., 1991; Jobling et al., 2004). 1992г. – Описаны первые информативные STR Y-хромосомы (Roewer et al., 1992; Jobling et al., 2004). 1992г. – Первое использование Y-STR маркеров в деле об изнасиловании (Roewer et al., 1992; Jobling et al., 2004). 1992г. – Первое использование маркеров мтДНК в гражданском деле ( National Research Council Committee on DNA Technology in Forensic Science) (Jobling et al., 2004). 1993г. – Первое использование генетических маркеров при идентификации человека примассовых катастрофах (Clayton et al., 1995, 1998; Jobling et al., 2004). 1994г. – Первый коммерческий набор на основе STR-маркеров (Butler, 2011; Jobling et al., 2004). 1995г. – Создана база данных STR profiles (Butler et al., 2011; Jobling et al., 2004). 1997г. – Получен ДНК-профиль из отпечатка пальца и одной клетки (van Oorschot et al., 1997; Findlay et al, 1997; Jobling et al., 2004). В результате дальнейшего развития технологий генетическая экспертиза в криминалистике стала способна дать ответ не только на вопрос об идентичности биологических образцов, но и о фенотипе индивида и даже о его вероятном этническом происхождении (см. 1.3.Маркеры ДНК-идентификации). В России развитие методов ДНК-идентификации началось с 1988 г., когда правительством было принято решение об организации лаборатории генотипоскопии на базе Всесоюзного научного криминалистического центра МВД СССР. В тот период перед экспертами встала задача разработки научно обоснованных методик для ДНК-идентификации. В 1990 г. была проведена первая генетическая экспертиза (Пименов и др., 2001). На настоящий момент в России активно используют зарубежные коммерческие наборы для проведения генетической экспертизы в криминалистике и судебной медицине. Их использование стало возможным за счет формирования референтных баз данных, в частности PP16-RUS, в состав которой входит информация о частотах 15 STR-маркеров в 12 этнических группах России и ближнего зарубежья (http://www.medgenetics.ru/web-resources/pp16-rus/). Более того, на 2016 год планируется запуск международного проекта в рамках «Союзного государства» в результате которой будут расширены референтные базы, а также сформированы новые панели генетических маркеров для ДНК-идентификации в России и Белоруссии (http://www.soyuz.by/).
Характеристика используемых микросателлитных маркеров
Материалом исследования являются образцы ДНК, выделенной из лейкоцитов крови людей принадлежащих к разным этническим группам. К каждому образцу прилагается анкета с краткой родословной индивида, указанием национальности, места рождения. В исследование были включены неродственные индивиды, неметисированные, по крайней мере, в трех поколениях.
В исследование вошли 18 популяционных выборок принадлежащих к этносам Сибири, Средней Азии и Восточной Европы (рис. 7).
в Комратском, Вулканештском районах АТО Гагаузии Республики Молдова. Жители Штефан-Водского (с. Карагасаны (Карахасань)) и Исследованные этнические группы относятся к трем расовым типам (европеоидный, монголоидный, смешанный). Популяции Сибири представлены русскими, тувинцами, бурятами, алтайцами, хантами, сибирскими татарами. Русские Сибири и сибирские татары представлены жителями г. Томска. В республике Тува обследована популяция из г. Кызыл, расположенного в Тувинской котловине. Буряты представлены двумя популяциями: пос. Курумкан (север Бурятии) и пос. Агинское (Агинский Бурятский автономный округ Читинской области). Южные алтайцы представлены двумя сельскими популяциями: Кулада и Бешпельтир. Ханты представлены двумя популяционными выборками: жителями сельскго поселения Казым, Белоярского района и деревни Русскинская, Сургутского района. Популяции восточной Европы представлены выборками русских, гагаузов, молдаван и марийцев. Русские восточной Европы представлены жителями г. Костормы. Выборка гагаузов представлена жителями г. Конгаз и селения Этулия (Етулия) расположенных Дрокиевского (с. София) районов Молдавии составили выборку Молдован. Выборка марийцев любезно предоставлена директором Института общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН чл.-корр. РАН, д-ром биол. наук, проф. Н.К. Янковским (Москва). Популяции средней Азии представлены выборками киргизов, казахов, и хакасов. Две выборки киргизов представляют население севера (г. Бишкек, п. Кегеты) и юга (г. Ош) Кыргызской республики. Выборки казахов представлены индивидами, принадлежащими к трем исторически сложившимся объединениям казахов – жузам (Старший жуз, Средний жуз и Младший жуз). Популяционная выборка хакасов сформирована из числа жителей Аскизского (села Усть-Есь, Еси-но (улус Полтаков), Усть-Чуль и Кызлас) района республики Хакасия.
Для характеристики разнообразия населения Сибири, Восточной Европы и Средней Азии использовали 10 микросателлитных локусов X-хромосомы наиболее изученных в мировых популяциях на момент планирования работы: DXS8378, GATA172D05, DXS7132, DXS9898, DXS7423, DXS8377, DXS101, DXS6809, DXS6789, HPRTB. Расположение локусов на хромосоме представлено на рисунке 8. Структура первичной нуклеотидной последовательности амплифицируемого участка Х-хромосомы, содержащего маркер DXS8378, выглядит следующим образом: ttaggcaacccggtggtcccctgctcctggcaggtca[CTATCTATCTATCTATCTATCTATC TATCTATCTATCTAT]attttatttatttattttttgagttggagtttcgctcttgt Или схематично: праймер F-N18-(CTAT)n-N20-R праймер. Локус DXS9898, известный также как, CHLC x GATA 126G01, расположен в перицентромерной области q-плеча X-хромосомы (q 21.31), представляет собой тетрануклеотидный тандемный повтор сложной структуры (Hering et al., 2000). Структура первичной нуклеотидной последовательности амплифицируемого участка Х-хромосомы, содержащего маркер DXS9898, выглядит следующим образом: cgagcacacctacaaaagctgagatatatacctctg[TATCTATC]atc[TATCTATCTATCTAT CTATCTATCTATCTATC]taatctgtcatctatctatctatctctatttatcaatctattgatctgtctatctggatgctca gtgaggtgagccta
Или схематично: праймер F-N15-(TATC)2-atc-(TATC)n-N58-R праймер. Рис.8. Локализация исследуемых микросателлитных локусов на Х хромосоме (Hwa et al., 2009) Локус DXS8378 расположен на p-плече X-хромосомы (p 22.31), состоит в первой группе сцепления и представляет собой простой тандемный повтор (Edelman et al., 2001). По литературным данным число повторов может варьировать от 7 до 17 (http://www.chrx-str.org/). Помимо полных тандемных повторов данный локус содержит аллели с неполными повторами, образованными за счет выпадения тимина из стандартной последовательности (таблица 7).
Отбор информативных SNP-маркеров
Анализ частот аллелей в связи с особенностями X-хромосомы, проводился отдельно для мужчин и женщин, аналогично подобным исследованиям (Wiegand et al, 2003; Turrina et al., 2007; Bobillo et al., 2011). Оценка генетического разнообразия популяций проводилась на основании данных о среднем числе аллелей, среднем значении разброса числа повторов, ожидаемой гетерозиготности, информационном содержании полиморфизма (PIC). Проведено попарное сравнение популяций, в пределах этнических групп, путем анализа степени популяционной дифференциации (FST). Анализ в пределах одной популяции (сравнение подвыборок мужчин и женщин) статистически значимых, при применении поправки на множественное сравнение, отличий не показал. Отсутствие статистически значимых отличий между частотами аллелей исследуемых локусов мужчин и женщин позволило объединить подвыборки. Также были объеденены выборки субпопуляций киргизов, казахов, бурят и русских (Таблица 21).
Внутриэтнические сравнения выборок алтайцев и хакасов показал наличие значимых различий между выборками этих этносов. Однако в случае сравнения подвыборок хантов-мужчин значимость различий не сохранялась (p = 0.347 ± 0.005). Анализ генетической дифференциации с помощью метода AMOVA также не показал значимых различий между выборками хантов (Fst = -0,002, p = 0,584±0,005) (подробнее анализ популяционной дифференциации AMOVA описан в разделе 3.2.). В связи с этим, в расчетах, где для анализа привлекались только данные по мужчинам, выборки хантов были объединены.
Все включенные в исследования локусы оказались полиморфны во всех прогенотипированных выборках. Число аллелей различных локусов варьирует от 7 до 19, наибольшее число аллелей обнаружено в локусе DXS8377 (19), наименьшее – DXS9898 (7). Наибольшим числом аллелей и разбросом числа повторов характеризуются тринуклеотидные микросателлитные повторы DXS8377 и DXS101.
Частоты аллелей представлены в приложении (таблица 3-12). Модальные аллели совпали для большинства локусов в популяциях различной этнической принадлежности, однако есть локусы, в которых распределение частот отличается в популяциях, принадлежащих к европеоидному и монголоидному расовым типам. Аллель 8,3 локуса DXS9898 обладает высокой частотой в отдельных европеоидных популяциях и низкой у отдельных монголоидных популяций (таблица 2). Аллели локуса DXS6789, содержащие 15 и 16 повторов, чаще представлены в популяциях монголоидного типа (таблица 3). В целом, для исследованных нами европеоидных популяций, в России, характерен спектр аллельных частот типичный для популяций Европы, монголоидных – типичный для Восточной Азии (таблицы 22-23).
Выборки женщин были проанализированы на соответствие равновесию Харди-Вайнберга (таблица 13 приложения). Из 90 распределений (10 локусов в 8 выборках), 24 теста показали значимое отклонение наблюдаемого распределения от ожидаемого. Во всех случаях отклонение от равновесия было связано с недостатком гетерозигот. В случае случайных статистических колебаний следовало бы ожидать равного соотношения случаев отклонения от равновесия, связанных с их недостатком и избытком (Степанов, 2002). При введении поправки на множественность сравнений (Бонферрони) отклонение от равновесия сохранилось в 9 выборках, при этом накопление отклонений отмечается для трех популяций: сибирские татары Томска, ханты д. Русскинская, ханты с. Казым. Данные о достоверном отклонении от равновесия Харди-Вайнберга могут отражать как специфику популяционно-генетических процессов в этих популяциях, так и подразделенность этих популяций.
Значения ожидаемой гетерозиготности приведены в приложении. Из 10 X-STR маркеров наибольшую вариабельность показали локусы DXS8377, DXS101, DXS6809, DXS6789. Максимальный уровень ожидаемой гетерозиготности (0,78) показан для популяций Восточной Европы (марийцы, молдаване, русские), исключение составила выборка гагаузов (0,75). Наименьший уровень средней ожидаемой гетерозиготности, по 10 STR локусам, зафиксирован у популяций коренных этносов Сибири (Ханты, Алтайцы, Тувинцы, Буряты) (рис. 14). Низкое генетическое разнообразие коренных сибирских этносов показано и по ряду других генетических маркеров:Y-хромосомным маркерам (Харьков, 2005, 2012; Харьков и др., 2007, 2011, 2013, 2014), аутосомным микросателлитам (Zhivotovsky et al., 2009; Степанов и др., 2011), классическим генетическим маркерам (Рычков, 1992), мтДНК (Деренко, Малярчук, 2010; Голубенко, 1998; Батырова, 2004).
Наибольший уровень ожидаемой гетерозиготности, среди сибирских популяций, был показан для сибирских татар (Томск) (0,779). За исключением единичных популяций, в целом сохраняется тенденция снижения уровня гетерозиготности в направлении с юго-запада на северо-восток, показанная на классических генетических и аутосомных STR-маркерах (Балановская и др., 2007; Zhivotovsky et al., 2009; Степанов и др., 2011). Вероятно, причиной такого снижения гетерозиготности, является более интенсивный дрейф генов у малочисленных и изолированных популяций Сибири, тогда как в Европе действие дрейфа генов уменьшается за счет миграций населения.
По совокупности показателей (ожидаемая гетерозиготность, PIC, среднее число аллелей, разброс числа повторов) наибольшим генетическим разнообразием обладают популяции русских, казахов и сибирских татар (Томск). На этих же выборках сибирских татар и русских ранее уже было показано наличие высокого генетического разнообразия по Y-хромосомным маркерам (Харьков, 2012), что, видимо, отражает результат формирования этих этносов на основе предковых групп, разнородных по происхождению.
Идентификационный потенциал систем Х-хромосомных маркеров в популяции русских (г. Кострома, г. Томск) .
В популяционной выборке тувинцев наличие сцепления показали три пары локусов: GATA172D05-DXS9898, DXS9898-6809, DXS7132-DXS6789.Также как в остальных случая значимое сцепление при введение поправки показала только одна пара – DXS9898-DXS6809 (р = 0,000).
В выборках бурят и алтайцев Бешпельтира введение поправки отсеяло все показанные сцепленные пары микросателлитных маркеров, при этом в выборке бурят только одна пара локусов расположилась на расстоянии менее 5Mb: DXS6809-DXS6789. Эта же пара локусов показала значимое сцепление (при введении поправки) (р = 0,000) в популяционной выборке алтайцев Кулады. Наличие сцепления этих локусов также было показано на немецкой популяции (Szibor, 2005). Введение поправки также отсеяло сцепление между маркерами DXS7423-DXS8377 в популяции алтайцев Бешпельтира (р = 0,020).
В популяционной выборке хантов в парах, показавших значимое сцепление, локусы расположились на большой дистанции (от 6 до 120Mb), а также наблюдалось отсутствие сцепления с промежуточными маркерами. Такая же картина наблюдалась в выборке киргизов. В выборках казахов, марийцев и татар значимое сцепление показали локусы DXS7423-DXS8377 (p =0,000, p =0,027, p = 0,002 соответственно). В целом, маркеры, входящие в четвертую группу сцепления (DXS7423-DXS8377) показали наличие сцепления в шести популяционных выборках: хакасы, гагаузы, алтайцы (Бешпельтир), сибирские татары, марийцы, казахи. При этом при введении поправки, значимость сцепления осталась в выборках хакасов и казахов. Также было показано наличие сцепления между маркерами расположенными на расстоянии 3,38 Mb (DXS9898-6809). Такое сцепление отмечалось в выборке гагаузов, молдаван, тувинцев и алтайцев Бешпельтира. При введение поправки сцепление данной пары локусов было показано только для тувинцев. Маркеры DXS6809-DXS6789, расположенные на дистанции в 0,5 Mb, показали сцепление в популяции бурят и алтайцев Кулада, сцепление данных маркеров ранее отмечалось в популяции немцев (Szibor et al., 2005). Оставшиеся 41 пары сцепленных локусов были отнесены к эффекту выборки за счет большого расстояния между локусами и отсутствия сцепления с промежуточными маркерами.
Однонуклеотидные полиморфные маркеры отбирали исходя из равномерного распределения по хромосоме и отсутствия сцепления. Физическая дистанция между соседними маркерами варьирует от 993 тыс. до 8,9 млн. п.о. (среднее расстояние между двумя соседними SNP – 2,252 тыс. п.о.). Анализ неравновесия по сцеплению проводился в программном пакете
Arlequin, с использование алгоритма цепей Маркова. Оценка 14305 пар локусов SNP показала наличие сцепления для 946 пар маркеров. Большая часть локусов в вероятно сцепленных парах оказались широко дистанцированны друг от друга, при этом сцепления с промежуточно расположенными локусами не наблюдается. Введение поправки на множественность сравнений Бенджамина-Хочберга (FDR) сократило число пар сцепленных локусов до 25.
В популяционной выборке русских первоначальные расчеты выделили 136 пар вероятно сцепленных однонуклеотидных полиморфных локуса Х-хромосомы. Из них только четыре пары маркеров расположены в непосредственной близости друг от друга: rs4131729-rs11799030 (р = 0,043), rs4898334-rs5945770 (р = 0,0005), rs5977571-rs5974708 (р = 0,044), rs5974708-rs4830049 (р = 0,024). Модификация значения уровня р с учетом поправки Бенджамина-Хочберга, с помощью программного пакета WinPepi (Abramson, 2011), выделила три пары сцепленных локусов: rs5968597-rs4825002 (р = 0,001), rs5909923-rs4825213 (р = 0,044), rs5934683-rs2504169 (р = 0,033). Во всех трех представленных парах маркеров локусы расположились на большом расстоянии (55 Mb, 21Mb, 136Mb соответственно) и физическое сцепление между ними в отсутствие сцепления с промежуточными маркерами, вероятно, является эффектом выборки. В популяционной выборке татар изначально было выделено 129 вероятно сцепленных пар Х-хромосомных SNP. В пяти парах вероятно сцепленных маркеров локусы расположились на расстоянии 1 Mb:rs1351260-rs1389433 (р =0,034), rs6609159-rs205847 (р = 0,021), rs4826609-rs6624701 (р =0,013), rs471205-rs5919529 (р =0,0003), rs222108-rs1474970 (р =0,002). Введение поправки выделило 2 значимых сцепления: rs1351260-rs5922869, rs1351260-rs5977991. Однако, как и в популяции русских, локусы в выделенных при введении поправки, вероятно сцепленных, парах маркеров расположены на большом расстоянии друг от друга. Вероятно, гаметическое неравновесие между этими парами Х-SNP маркеров объясняется особенностями выборки.
Такая же ситуация, а именно, большая дистанция между парами вероятно сцепленных маркеров, показанных с применением поправки Бенджамина-Хочберга, наблюдается в популяционных выборках тувинцев, казахов и хантов. При этом в популяции тувинцев 10 пар X-хромосомных SNP-маркеров показавших вероятное сцепление без применения поправки расположены в непосредственной
близости друг от друга: rs2694742-rs1405303 (р =0,027), rs6609159-rs205847 (р =0,022), rs5969528-rs5922869 (р =0,003), rs5968597-rs222108 (р = 0,025), rs222108-rs1474970 (р =0,009), rs5941047-rs5949581 (р =0,007), rs4898334-rs5945770 (р = 0,008), rs9329406-rs217937 (р =0,025), rs926640-rs2797125 (р = 0,004), rs2504169-rs614511 (р =0,002). В популяции казахов – 3 пары маркеров: rs4454452-rs3005641
(р =0,016), rs5963641-rs5917990 (р =0,009), rs5921682-rs4898334 (р =0,023). В популяции хантов – 12 пар маркеров: rs5962008-rs2130835 (р =0,001), rs5934683-rs7888207 (р =0,036), rs1351260-rs1389433 (р =0,009), rs5915291-rs4131729 (р =0,005), rs4826609-rs6624701 (р =0,009), rs5922869-rs5968597 (р =0,003), rs5973840-rs5974348 (р =0,005), rs5909923-rs5977571 (р =0,015), rs916208-rs926640 (р =0,009), rs2797125-rs17391 (р = 0,019), rs4825002-rs2869922 (р =0,045), rs4825213-rs1781486 (р =0,002).
Сто двадцать четыре пары Х-хромосомных однонуклеотидных полиморфных локусов показали вероятное сцепление в популяции хакасов. Из них две пары показали сцепление при применении поправки на множественное сравнение: rs11799030-rs5909923 (р = 0,037), rs5974708-rs4830049 (р = 0,0001), при этом маркеры rs5974708 и rs4830049 расположены в непосредственной близости друг от друга. Так же в 8 парах из 124 пар маркеров показавших вероятное сцепление без применения поправки Бенджамина-Хочберга, локусы расположены на расстоянии 1 Mb: rs1405303-rs4826682 (р = 0,045), rs2404797-rs5934683 (р = 0,037), rs5953326-rs5915291 (р = 0,007), rs4131729-rs11799030 (р = 0,001), rs6624701-rs471205 (р = 0,012), rs5949581-rs5921682 (р = 0,032), rs5977571-rs5974708 (р = 0,008), rs4830049-rs916208 (р = 0,035).