Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Изоферменты в изучении видов трибы triticeae 8
1.1. Изоферменты в генетических исследованиях 8
1.2. Эволюция и систематика Aegilops tauschii 9
1.3. Изучение генетического разнообразия мировых коллекций А е. tauschii с помощью молекулярных маркёров 12
1.4. Генетика изоферментов Ае. tauschii и его сородичей 13
1.5. Создание генетической карты генома D 16
1.6. Роль естественного отбора в формировании аллельного полиморфизма ферментных локусов в природных
популяциях 17
1.7. Изучение полиморфизма ферментных генов в популяциях диких злаков Triticum dicoccoides и Hordeum spontaneum 21
1.8. Генетический контроль типа развития у Ае. tauschii и его сородичей 22
1.9. Заключение 24
ГЛАВА II. Материалы и методы 26
2.1. Материал Ае. tauschii 26
2.2. Изоферментный анализ 28
2.3. Статистические методы 30
2.4. Анализ морфологии Ае. tauschii... 31
ГЛАВА III. Аллельныи полиморфизм изоферментов у aegilops tauschii 34
3.1. Ае. taushii в природе: фитоценотическая характеристика 34
3.2. Электрофоретические характеристики ферментов Ае. tauschii 35
3.3. Данные электрофоретического анализа популяционного материала и образцов мировых коллекций Ае. tauschii 35
3.4. Ае. tauschii: система размножения и общий уровень полиморфизма 50
3.5. Внутривидовая дивергенция Ае. tauschii 50
3.6. Биохимический систематический критерий для определения подвидов Ае. tauschii 59
3.7. Популяционно-генетическая структура Ае. tauschii 60
3.8. Биохимический полиморфизм и эволюционная история Ае. tauschii 61
3.9. Генетический обмен между подвидами Ае. tauschii 61
3.10. Дрейф генов в локальных популяциях Ае. tauschii 65
3.11. Ае. tauschii как объект популяционно-генетических исследований 66
3.12. Паттерны аллельного полиморфизма изоферментов у Ае.
tauschii 69
ГЛАВА IV. Изоферменты в частной генетике АЕ. Tauschii 85
4.1. Генетическое сцепление между ферментными локусами у Ае. tauschii. Локализация гена контролирующего тип развития ... 90
4.2. Хромосомная локализация у Т. aestivum генов Est-10, ортологичных Est5 Ае. tauschii 91
4.3. Генетическая локализация Acphl 97
4.4. Заключение 98
ГЛАВА V. Заключение 100
Выводы 104
Список литературы
- Изоферменты в генетических исследованиях
- Материал Ае. tauschii
- Ае. taushii в природе: фитоценотическая характеристика
- Генетическое сцепление между ферментными локусами у Ае. tauschii. Локализация гена контролирующего тип развития
Введение к работе
Для генетиков фермент-кодирующие гены представляют интерес с двух сторон: {\)per se - как гены, белковые продукты которых исключительно важны для жизнедеятельности организма, и (2) как инструмент для изучения разнообразных объектов (видов) в различных областях генетики (частной, популяционной и т. д.).
Одним из таких объектов, представляющих особый интерес, является диплоидный злак Aegilops tauschii Coss. Его геном (DD) последним вошел в состав генома (AABBDD) мягкой пшеницы, Triticum aestivum L., (Porceddu, Lafiandra, 1985). С Ае. tauschii связываются основные надежды на решение одной из самых серьёзных проблем в селекции мягкой пшеницы - крайне низким уровнем генетического полиморфизма этого аллогексаплоида: так кжАе. tauschii - это распространённый на обширном ареале высокополиморфный вид, он является важным потенциальным донором хозяйственно-ценных генов для переноса в мягкую пшеницу (Kimber, Feldman, 1987)
Использование изоферментов ("ферментные гены как инструмент") даёт возможность изучить популяционно-генетическую структуру вида Ае. tauschii и т. о. получить информацию, необходимую для эффективного сохранения и использования ценного генетического ресурса, каковым является этот вид.
Помимо практического интереса, изучение полиморфизма фермент-кодирующих генов в популяциях Ае. tauschii представляет интерес теоретический ("ферментные гены per se"). Ае. tauschii населяет обширный ареал - от Турции до Пакистана.). Популяция этого вида состоит из большого числа локальных популяций, и поскольку расселение Ае. tauschii произошло очень давно, в конце третичного периода (Жуковский, 1928), то, по-видимому, в настоящее время она является стохастически-равновесной
генетической системой (Dudnikov, 1998). Поэтому А е. tauschii может быть удобным модельным объектом для изучения роли естественного отбора в формировании аллельного полиморфизма различных классов генов, в частности - фермент-кодирующих (Dudnikov, 2003b).
Проведение популяционно-генетических и гено-географических исследований неизбежно связано с изучением большого количества материала Ае. tauschii по целому ряду фермент-кодирующих локусов. Получаемые при этом данные дают возможность для решения задач систематики и частной генетики Ае. tauschii:
В области частной генетики - выявить ранее неизвестный у Ае. tauschii полиморфизм по ряду ферментных локусов, а также обнаружить новые ферментные локусы, ранее не описанные не только у Ае. tauschii, но и вообще у представителей трибы Triticeae. Провести генетическое картирование (или хромосомную локализацию) этих генов. Использовать изоферменты как маркёры для изучения генетики признака(ов) представляющего особый интерес. В данной работе в качестве такого признака был выбран "тип развития" (яровой либо озимый).
Внутривидовая систематика Ае. tauschii была постоянным камнем преткновения на протяжении более чем 150-ти летней истории изучения этого вопроса разными авторами (van Slageren, 1994). Используемый в данной работе материал Ае. tauschii и методы изоферментного анализа позволяют решить эту проблему.
Цели и задачи работы
Целью данной работы было изучение полиморфизма и частной генетики изоферментов у Ае. tauschii. Соответственно, конкретные задачи, связанные с изучением аллельной вариабельности ферментных генов в природных популяциях Ае. tauschii; характеристик Єє. tauschii как объекта
популяционно-генетических исследований и локализацией ферментных локусов на генетической карте, были следующими:
Изучить внутривидовую дивергенцию и популяционно-генетическую структуру Ае. tauschii.
Выявить пространственные паттерны аллельной вариабельности ферментных генов у Ае. tauschii.
Выявить "новые" полиморфные фермент-кодирующие гены и провести их локализацию.
Используя изоферменты как генетические маркёры, выявить главный ген(ы) контролирующий тип развития у Ае. tauschii.
5'. Выявить генетические сцепления между фермент-кодирующими локусами у Ае. tauschii.
Научная новизна и практическая ценность
Впервые проведено систематическое изучение полиморфизма ферментных генов у Ае. tauschii с использованием подходов, принятых в популяционной генетике. Для анализа были взяты образцы из мировых генетических коллекций, представляющие весь ареал вида; а также, был использован материал собственных сборов, проведённых в Закавказье. Весь материал (744 индивидуальных растений) был проанализирован по широкому набору ферментных локусов (от 21 до 27).
Впервые изучена популяцинно-генетическая структура Ае. tauschii и показана высокая степень генетической дифференциации локальных популяций вида.
Впервые выработан морфологический критерий (подвидовой индекс "SI"), объективно отражающий внутривидовую дифференциацию Ае. tauschii. Проведение многомерного статистического анализа биохимического полиморфизма, совместно с изучением морфологии Ае. tauschii, позволило решить проблему подвидового состава этого вида. Впервые было выявлено
чёткое разделение А е. tauschii на два подвида и найден простой биохимический критерий ("быстрая" кислая фосфатаза, АСРН1) для их таксономического определения.
У Ае. tauschii описаны неизвестные ранее в трибе Triticeae т^шл Acphl и Est5. Проведена локализация на генетической карте гена Acphl и хромосомная локализация гена Est5.
Впервые у Ае. tauschii выявлен полиморфизм по следующим ферментным генам: Асо2, Acphl, Acph4, Ак, Cat2, Est5, Lap, Mdhl, Mdh2, Nadhdl, Nadhd2, Pgm.
Впервые выявлено, что тип развития у Ае. tauschii контролируется одним кодоминантным главным геном. Показано, что этот ген принадлежит к ортологичной группе генов Vm-2. Таким образом, впервые был описан ген Vrn-2 в геноме D.
Впервые выявлены генетические сцепления между генами: Est5 -Nadhd2 в хромосоме 3; Vrn-D2 - Асо2 - Cat2 - Pgm - Nadhdl в хромосоме 4; Est2 - Got2 в хромосоме 6; определены соответствующие значения частот рекомбинации.
В практическом плане, полученные данные по генетической структуре популяций Ае. tauschii и пространственной структуре генетического полиморфизма на ареале вида существенны для сохранения генетического ресурса вида и его использования в селекции возделываемых пшениц.
Локализация у Ае. tauschii гена Vrn-D2 дает возможность использовать этот ген в селекции возделываемых пшениц, а также в создании тестерных линий Т. aestivum.
Аппробация работы
Материалы диссертации были доложены на 11-й международной конференции EWAC, 24 -28 июля 2000 г., Новосибирск; а также на отчётных сессиях Института цитологии и генетики СО РАН.
Изоферменты в генетических исследованиях
Широкое использование изоферентов в генетических исследованиях обусловлено особенностями метода, созданного Р. Хантером и К. Маркертом (Hunter, Markert, 1957), в котором они объединили технику электрофореза с методиками гистохимической окраски. Принципиальные особенности этого метода (по сравнению с обычной процедурой разделения аллельных вариантов белков) - следующие.
Обычный подход требует провести биохимическую процедуру (как правило, достаточно сложную) выделения достаточного количества требуемого белка (для чего необходимо большое количество материала). Далее выделенные образцы белка данного класса проходят процедуру электрофореза и окрашиваются красителем. Краситель связывается с любыми белками, но поскольку специфическая методика экстракции оставила только белки нужного класса - исследователь видит конкретно их.
При изоферментной технике (Корочкин и др., 1977; Левитес, 1986; Райдер, Тейлор, 1983) берётся крайне малое количество материала, что позволяет провести индивидуальный анализ конкретной особи практически любого вида. Экстракция представляет собой тривиальную процедуру гомогенизации, не связанную с выделением конкретного белка. Соответственно, на гелевой пластинке после электрофореза, кроме интересующего исследователя фермента, присутствует и большое число других. При этом проводимые процедуры сохраняют нативность этих ферментов. Гель погружают в реакционную смесь, содержащую субстрат, специфичный для выявляемого фермента, краситель и промежуточные реактивы-посредники. Хотя молекул изучаемого фермента в геле совсем немного, но они - "живые", и начинают активно перерабатывать субстрат, что приводит к проявлению красителя в количествах достаточно больших, чтобы быть чётко видимым и, таким образом, выявить данный конкретный фермент. При этом весь остальной "белковый шум" исследователю не мешает, так как остаётся невидимым.
Таким образом, появившаяся благодаря работе (Hunter, Markert, 1957) возможность определять генотипы большого количества индивидуальных особей с помощью тривиальной биохимической процедуры оказалась очень ценной для генетики, в частности, генетики популяционной. На протяжении около 30-ти лет изоферменты были незаменимыми генетическими маркёрами. Однако прогресс молекулярной генетики (появление целого ряда различных типов ДНК-овых маркёров) резко снизил значение изоферментов в этом качестве. В то же время, тот же самый прогресс (в частности, появление возможности сравнительно просто секвенировать большое количество -генетического материала) дал исследователям новые возможности для изучения фермент-кодирующих генов per se и помог существенно продвинуться в понимании эволюционной роли полиморфизма ферментных генов в природных популяциях (Eanes, 1999). В случае ферментных генов исследователю известен не только белковый продукт гена, но и функция этого белка. И это делает ферментные гены прекрасным инструментом для изучения молекулярно-генетических основ эволюционного процесса. (Watt, 1994)
Aegilops tauschii.
Aegilops tauschii Coss. - это однолетний диплоидный злак (2п =14, геном DD), самоопылитель (Берлянд-Кожевников, Богуславский, 1979; Богуславский, 1979, 1981; Witcombe, 1983;Kimber, Feldman, 1987). Возникновение вида Aegilops tauschii и его распространение произошло в конце третичного периода (Жуковский, 1928; Eig, 1929); в настоящее время он занимает обширный ареал от Турции до Пакистана (van Slageren, 1994;
Tanaka, 1983). В самом начале существования Ае. tauschii как вида произошло его разделение на подвиды tauschii и strangulata (Eig) Tzvelev, существенно отличающиеся генетически (Jaaska, 1981). Около 8000 лет назад, по эволюционным меркам - совсем недавно, возникла гексаплоидная пшеница Triticum aestivum L. (Porceddu, Lafiandra, 1985). Донором D-генома Т. aestivum был 4е. tauschii ssp. strangulata (Jaaska, 1980, 1981; Lagudah & Halloran, 1988,1989). В отличие от геномов А и В Г. aestivum, которые существенно отличаются от гомеологичных геномов ныне живущих диплоидных родичей Т. aestivum (Т. urartu, геном AUAU; и представители секции Sitopsis рола. Aegilops - имеющие геномы наиболее близкие к геному В), геномы D Т. aestivum иАе. tauschii существенных различий не имеют (Porceddu, Lafiandra, 1985; Наврузбеков, 1989).
Для Ае. tauschii различные авторы часто используют разные названия (Aegilops tauschii Coss., Aegilops squarrosa auct. non L., Triticum tauschii (Coss.) Schmal.). Данные разногласия являются исключительно формальными, так как Ае. tauschii — это четко определяемый вид. С внутривидовой систематикой Ае. tauschii ситуация обратная. Она представляла и представляет собой постоянную проблему для исследователей. П. М. Жуковский (1928) выделял у Ае. tauschii три подвида, но такое деление не было принято. В настоящее время практически все без исключения авторы принимают деление Ае. tauschii на подвиды tauschii (изначально обозначенный А. Эйгом (Eig, 1929) как ssp. eusquarrosd) и strangulata (Eig, 1929; Hammer, 1980). Однако разные авторы под одними и теми же названиями подразумевают совершенно различный материал. Так, Н. Kihara, М. Tanaka (1958); Н. Kihara et al. (1965); М. Tanaka (1983) относят к ssp. strangulata только растения с ярко выраженной бусо-шнуровидной структурой колоса, которые встречаются только в прикаспийском Иране в районе Горгана. V. Jaaska (1981) трактует ssp. strangulata гораздо более широко: в соответствии с результатами его исследований, ssp. strangulata морфологически гораздо более вариабелен и населяет обширную территорию включающую Закавказье, Северный Иран и Копед-Даг в Туркмении.
Как следствие, хотя всем исследователям в области генетики пшеницы хорошо известно, что именно геном ssp. strangulata вошел в состав генома Т. aestivum, на практике реально отличить подвиды Ае. tauschii в нетривиальных случаях оказывается невозможно.
Коллекция Ае. tauschii собранная профессором X. Кихара (унивеситет г. Киото) (Kihara, Tanaka, 1958) была использована Я. Двораком с соавторами (Dvorak et al., 1998) для изучения генетического полиморфизма по RFLP маркёрам. Полученные при этом генетические данные, как оказалось, существенно расходятся с трактовкой подвидового деления Ае. tauschii по ( морфологическим признакам, предлагаемой X. Кихара с соавторами (Kihara, Tanaka, 1958).
Генетический полиморфизм Ае. tauschii по ряду ферментных локусов был изучен В. Э. Яаска (Jaaska, 1980, 1981, 1993). При этом трактовка подвидового деления Ае. tauschii, сделанная В. Э. Яаска на базе генетических данных хорошо соответствуют подвидовому делению Ае. tauschii по морфологии, которое было проведено Э. Ф. Мигушовой (ВИР, Ст. (f, Петербург) (Jaaska ,1981). К сожалению, хотя Э. Ф. Мигушова сама, как очень опытный специалист, смогла надёжно различать подвиды Ае. tauschii по морфологии колоса, без привлечения генетических данных, она не дала общедоступной методики как это делать (Jaaska, 1981).
Материал Ае. tauschii
В работе использовался материал Ае. tauschii из трёх источников: мировая коллекция Всероссийского института растениводства (ВИР, Ст.-Петербург, VIR), коллекция университета Киото (Япония) и материал собранный автором в Закавказье. Коллекция Ае. tauschii ВИР, одна из самых богатых в мире, была использована, чтобы составить картину генетического разнообразия вида на всём его ареале. Коллекция университета Киото гораздо беднее коллекции ВИР (практически не представлено Закавказье и Средняя Азия бывшего СССР), однако в ней хорошо представлен Иран (Kawahara, 1997). Иран - это центр ареала А е. tauschii и именно с этим регионом связаны основные проблемы внутривидовой систематики вида (Lubbers et al., 1991; Dvorak et al, 1998). Поэтому все иранские образцы Ае. tauschii из коллекции университета Киото были взяты для исследования. Также материал Ае. tauschii был специально собран автором в Армении, Азербайджане и Дагестане (подробное описание точек сбора будет представлено далее в 3.3.3). Сборы проводились в первичных (не связанных с хозяйственной деятельностью человека) местообитаниях. Семена собирались с индивидуальных растений выбранных случайным образом и растущих не ближе 1м одно от другого.
Поскольку известно, что образцы Ае. tauschii из коллекции университета Киото фактически являются линиями (Kawahara, личное сообщение), для иссследования было взято по одному растению из каждого из 79 иранских образцов.
В отличие от коллекции университета Киото, образцы коллекции ВИР часто являются полиморфными, хотя при этом, в силу технологии их сбора и воспроизведения, они не репрезентативны в отношении частот в природных популяциях. В данном случае для исследования было взято по 2 растения из каждого из 154 отобранных для работы образцов. Ареал вида был разделён на 7 регионов, таким образом чтобы число изученных растений в каждом из них было не менее 30 (Рис. 1).
Всего в геногеографической и популяционно-генетической части работы был проведён анализ 744 индивидуальных растений.
В работе использовались следующие ферментные системы: аконитатгидратаза (АСО, ЕС 4.2.1.3), кислая фосфатаза (АСРН, ЕС 3.1.3.2), аденилаткиназа (АК, ЕС 2.7.4.3), альдолаза (ALD, ЕС 4.1.2.13), каталаза (CAT, ЕС 1.11.1.6), эндопептидаза (ЕР, ЕС 3.4.21-24.-), эстераза (EST, ЕС 3.1.1.2), гицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа (GAPD, ЕС 1.2.1.12), глутаматдегидрогеназа (GDH, ЕС 1.4.1.2), глутамат оксалоацетаттрансаминаза (GOT, ЕС 2.6.1.1), общий белок (GP, ЕС 4.1.1.39?), глюкозо-6-фосфатизомераза (GPI, ЕС 5.3.1.9), лейцинаминопептидаза (LAP, ЕС 3.4.11.1), малатдегидрогеназа (MDH, ЕС 1.1.1.37), NADH диафораза (NADHD, ЕС 1.6.4.3), фосфоенолпируваткарбоксилаза (РЕРС, ЕС 4.1.1.31), фосфоглюкомутаза (PGM, ЕС 2.7,5.1), шикиматдегидрогеназа (SKDH, ЕС 1.1.1.25).
Гомогенизация листьев 2-3 недельных зелёных растений проводилась по методу: Hart, Langston (1977). Электрофорез ЕР и GOT проводился в полиакриламидном геле ("Р") с 0.25М Трис - 0. ЇМ НС1 гелевым буфером (Jaaska, 1981). Электрофорез в крахмальном геле проводился горизонтально. (Гидролизованный крахмал был получен по методу: Левитес (1980)). Гелевые пластинки, содержащие 12% крахмала, охлаждались льдом. Система "М": Трис-ЭДТА- малеиновая кислота, рН 7.4 (Brown et al., 1978) использовалась для GP, LAP, NADHD и РЕРС. LiOH-боратная система, рН 8.3, ("L") использовалась для АСРН, ALD, CAT, EST и GPI (Gottlieb, 1981а). Для остальных ферментов использовалась система "Н": 0.02М гистидин-цитрат, рН 7.0, (Gottlieb, 1981а).
Окраска ALD, CAT, GDH, GOT, GP, GPI, LAP, MDH, NADHD, РЕРС и PGM проводилась по методикам Brown et al. (1978). ACO выявлялась no методу Chenicek & Hart (1987), AK - по методу Fildes, Harris (1966), EP - no методу Tang, Hart (1975), EST - по методу Jaaska (1980), GAPD - по методу Harris, Hopkinson (1976), SKDH - по методу Neuman, Hart (1983).
Кислая фосфатаза, ACPH, красилась в 40 ml 0.1M Трис-НСІ буфера, рН 5.8, содержащего 40 mg 1-нафтил фосфата и 40 mg GBC соли прочного гранатового. Перед окраской гель вымачивался в течение 1 часа при 4С в 0.2М Трис-НСІ буфере, рН 5.8. Такое вымачивание позволяет более интенсивно прокрашивать "быструю" кислую фосфатазу АСРН1, представляющую, как будет видно далее, особый интерес.
Хорошо известно, что экспрессия ферментных локусов может существенно меняться в процессе онтогенеза. Также возможны различные посттрансляционные модификации изменяющие электрофоретическую подвижность фермента (Markert, Whitt, 1968). Это требует от исследователей определённой осторожности в интерпретации электрофоретических фенотипов. Поэтому для данной работы были отобраны "удобные" ферменты, то есть такие, которые выявляются в ткани листа на любой стадии онтогенеза, и аллельная природа вариабельности которых не вызывает никаких сомнений.
Ае. taushii в природе: фитоценотическая характеристика
Проведённые автором экспедиции: в 1989 году - в Армению и Азербайджан; в 1990 - в Дагестан, позволили отметить характер распространения , tauschii в природе. Первичные местообитания Ае, tauschii - это участки кустарниковой степи на склонах холмов, непосредственно ниже зоны леса. В таких местообитаниях, растения Ае. tauschii растут достаточно разреженно. Интересно, что, несмотря на высокую плотность популяции человека в этом регионе, данные местообитания никак не вовлечены в хозяйственную деятельность человека. Они непригодны ни для земледелия, ни для выпаса крупного рогатого скота. Вероятно, эти участки могут иногда посещаться отдельными забредающими туда козами (можно вспомнить, что народное название Aegilops - "козья трава").
Вторичные местообитания Ае. tauschii связаны с деятельностью человека. В этом случае данный вид можно встретить и выше его исконных местообитаний, например, на обочине дороги в зоне леса; и ниже - в зоне полупустыни, если там, например, проходит арык. В таком вторичном местообитании растения Ае. tauschii могут расти плотно, составляя 100% покрытия; визуально при этом заметно полное морфологическое однообразие колосящихся растений, являющееся, очевидно, следствием эффекта основателя.
Поиск первичных местообитаний Ае. tauschii связан с определёнными (иногда существенными) затратами времени и сил. Вторичные местообитания "сами попадаются на глаза", и именно во вторичных местообитаниях (Kihara, Tanaka, 1958) собраны образцы Ае. tauschii, вошедшие в коллекции генетических банков. Для гено-географических исследований, проводимых с использованием таких коллекций, это, однако, не имеет значения, т. к. очевидно, что в какое-либо создаваемое человеком вторичное местообитание растения Ае. tauschii попадают из ближайшего первичного: на географической карте места их расположения "сольются" в одну точку
Вкратце подводя итог визуального фитоценотического исследования, можно сказать, что первичные местообитания Ае. tauschii являются пространственно-разрозненными, и что колличество растенишЫе. tauschii, в каждом таком местообитании невелико. Как будет видно далее, данные фитоценотические характеристики находят отражение на популяционно-генетическом уровне: разрозненность местообитаний - в высоком уровне генетической дифференциации популяций Ае. tauschii ( 3.7), а малое количество растений в местообитании - в том, что генетический дрейф может играть существенную роль в локальных популяциях Ае. tauschii ( 4.1). Ае. taushii
В данной работе было изучено 29 ферментных локусов: электрофоретические характеристики использовавшихся в работе ферментов Ае. tauschii представлены в таблице 1. Ае. tauschii
Вкратце объём исследованого материала и оценки доли полиморфных ферментных генов у Ае. tauschii суммированы в таблице 2. Далее данные электрофоретического анализа представлены подробно для каждого из трёх источников материала Ае. tauschii.
Географическое положение местообитаний Ае. tauschii, где был собран материал (Таб. 5), представлено на рисунке 4. Из 27 локусов, проанализированных у 357 растений, 16 были мономорфны (см. 4.1.1). Частоты аллелей 11 полиморфных ферментных локусов в Закавказских популяциях Ае. tauschii представлены в таблице 6. В местообитаниях 4, 6, 9 Ае. tauschii представлен двумя подвидами. Как показали данные электрофоретического анализа (Таб. 6), Ае. tauschii ssp. strangulata в местообитании 9 представлен двумя мономорфными популяциями (9 s и 92s), очевидно вследствие миграционного события, произошедшего недавно (т.к. генетический обмен между популяциями 9 s и 9 s не успел произойти) и связанного, по-видимому, с появлением на холме 336 (Табл. 5, рис. 4) автомобильной дороги.
Известно, что Ae. tauschii - самоопылитель (Богуславский, 1979; Берлянд-Кожевников, Богуславский, 1979). Гетерозигота изредка встречались автору (за рамками данного систематического исследования), т.о. перекрёстное опыление тоже имеет место, однако происходит редко: среди исследованных в данной части работы 744 растений гетерозигот обнаружено не было.
В целом для вида, доля существенно-полиморфных (частота наиболее обычного аллеля у которых не превышает 0.99) фермент-кодирующих локусов составила 38% (эти локусы отмечены звёздочкой " " в таблице 1), что существенно превышает среднее значение для видов растений-самоопылителей, 18.3% (Gottlieb, 1981b). А е. tauschii
Для изучения внутривидовой дивергенции Ae. tauschii был проанализирован материал из Ирана и Закавказья (где встречаются оба подвида Ae. tauschii - ssp. tauschii и ssp. strangulata) с точки зрения генетики, морфологии и экологии.
Данные, характеризующие частоты аллелей 11-ти полиморфных ферментных локусов в 24-х закавказских популяциях А е. tauschii (Табл. 6), были обработаны с помощью метода главных компонент. В многомерном пространстве генных частот закавказские популяции А е. tauschii распадаются вдоль первой главной компоненты на две чёткие группы представляющие подвиды tauschii и strangulata (рис. 5).
Изменчивость генетическая чётко коррелирует с изменчивостью морфологической. Все популяции подвида tauschii (группа точек справа по абсциссе на рисунке 5) характеризуется меньшими значениями SI индекса ("белые" гистограммы на рисунке 6) по сравнению с популяциями подвида strangulata (рис. 6), исключение составляет только популяция 4е (рис. 6), которая далее будет рассмотрена особо.
Подвиды tauschii и strangulata также различаются экологически: ssp. strangulata предпочитает более высокорасположеные влажные местообитания (рис. 7).
Генетическое сцепление между ферментными локусами у Ае. tauschii. Локализация гена контролирующего тип развития
Таким образом, гены Nadhd2 и Est5 находятся в хромосоме 3, а общая схема отмеченных у Ае. tauschii генетических сцеплений представлена на рис. 25. Выявленные сцепления между генами Nadhdl - Pgm и Got2 - Est2 подтверждают данные об их локализации в одних и тех же плечах хромосом (4DS и 6DL, соответственно (Mcintosh et al., 1998)). Поскольку ген NADH диафоразы мягкой пшеницы, Ndh-D3, был ранее описан (с помощью метода изоэлектрического фокусирования) и локализован в хромосоме 3DL (Liu, Gale, 1991), то, возможно, что гены Nadhd2 и Ndh-D3 являются ортологичными. У Т. aestivum ген, кодирующий каталазу - Cat-Bl, был ранее локализован (с помощью пшенично-ржаных дополненных линий) на хромосоме 4BL (Thiele, Seidel, 1990; Mcintosh et al., 1998). Весьма вероятно, что Cat2 и Cat-Bl являются членами одного ортологического набора генов.
К сожалению, в проведённом у Ае. tauschii генетическом анализе не был локализован теп Acphl. Не удалось провести и хромосомную локализацию ортологичных Acphl генов мягкой пшеницы с помощью нулли-тетрасомных линий, так как белковые продукты этих генов из геномов А, В и D мягкой пшеницы имеют сходную электрофоретическую подвижность (рис. 26). Как показали приведённые в предыдущих разделах результаты, Acphl представляет особый интерес. Кроме того, этот ген описан впервые не только у Ае. tauschii, но и вообще у Triticeae. Поэтому генетическое картирование этого локуса было проведено специально, с использованием ДНК-овых маркёров (микросателлитов, SSR (Bryan et al., 1997; Roder et al., 1998; Pestsova et al., 2000; Guyomarc h et al., 2002)), совместно с сотрудниками John Innes Center (Norwich, UK) Stephen M. Reader, Jane Kirby и Ho The Vinh.
Результаты генетического анализа представлены в табл. 11. Локус Acphl локализован в прицентромерном районе длинного плеча хромосомы 2D (рис. 27). Ранее Г. Хартом и П. Лангстоном гены, кодирующие кислую фосфатазу и обозначенные впоследствии как Acph-Al, Acph-Bl, Acph-Dl (Mcintosh et al, 1998), были локализованы в хромосомах 4А, 4В и 4D мягкой пшеницы (Hart, Langston, 1977). Также, гены кодирующие кислую фосфатазу, были обнаружены в хромосоме 4Н у ячменя, 4MV у Ае. ventricosa, 7 Ag1 и 4Ag1 у Agropyron intermedium, 4SS у Ае. searsii и 7R у Secale cereale (Mcintosh et al., 2003). В хромосоме 2-ой гомеологической группы локус, кодирующий кислую фосфатазу, обнаружен впервые. В соответствии с номенклатурой генных символов мягкой пшеницы, гены Т. aestivum, ортологичные Acphl Ае. tauschii (рис. 26), должны быть обозначены как Acph-2.
Проведённая работа может служить примером использования различных подходов в частной генетике Ае. tauschii.
Во-первых, поскольку А е. tauschii является, с формально-генетической точки зрения, аналогом такого классического генетического объекта, как горох посевной, Pisum sativum, (т.е., самоопылитель, 2n = 14), то он весьма удобен для проведения классического менделевского анализа расщепления в F2(4.1).
Во-вторых, поскольку Ае. tauschii - родич мягкой пшеницы, можно использовать NT и DT линии Т. aestivum для получения информации о хромосомной локализации генов, ортологичных исследуемым у Ае. tauschii ( 4.2).
В-третьих, поскольку Ае. tauschii - не просто родич мягкой пшеницы, а донор генома D, для локализации локусов на генетической карте можно использовать имеющиеся SSR-маркёры D-геномов, как Т. aetivum, так и собственно Ае. tauschii ( 5.3).
Картирование гена Acphl у Ае. tauschii представляет пример того, как в современных условиях может быть "поставлен на карту" любой новый ген у Ае. tauschii. (Ситуация с Т. aestivum - совершенно аналогична, просто придётся использовать большее число SSR-маркёров.) При этом, локализация Acphl на генетической карте представляла собой несколько усложнённый вариант общего случая: (1) анализ кислой фосфатазы, и анализ SSR-маркёров - проводились в разных странах, отсюда - необходимость использования F3; (2) ограниченное количество семян F3 от каждого родителя F2 несколько усложнило статистическую обработку данных ( 2.3).