Введение к работе
Актуальность исследования. Генетические системы аллоантигенов, т.е. антигенов по которым отличаются гомологичные белки особей одного вида, описаны у человека, лабораторных и сельскохозяйственных животных. Высокая специфичность имуногенетических маркеров обуславливает их широкое использование при решении как фундаментальных, так и прикладных вопросов в различных областях современной биологии, медицины, животноводства и ветеринарии. Из большого числа иммуногенетических систем групп крови, тканевой совместимости, сывороточных белков по степени изученности несомненно выделяется надсемеиство генов иммунологических рецепторов, частью которого является мультигенное семейство иммуноглобулинов <ИГ).
Семейство генов ИГ несет генетическую информацию для обеспечения у позвоночных функции гуморального иммунитета, т.е. синтеза множества антител. Характерными чертами этого семейства являются представленность в нескольких хромосомах, разнообразие форм генов, кодирующих разные цепи и их отдельные элементы, уникальные перестройки генов в ходе онтогенеза и иммунного ответа, избирательность экспрессии комбинаций индивидуальных генов в синтезирующих ИГ клетках - В-лимфоцитах. Эти свойства делают мультигенное семейство ИГ весьма интересной моделью для изучения различных аспектов эеолюции генома эукариот: молекулярных механизмов эволюции, коэволюции структурных и регуляторних генов, возникновения генов с новыми функциями и др. Решение этих проблем во многом зависит от таксономического расширения сферы исследований, т.е. вовлечения в нее видов животных, удаленных от традиционных объектов иммуногенетики.
С середины 70-х годов з лаборатории эволюционной генетики и затем в
лаборатории иммуногенетики ИЦиГ СО РАН у американской норки
изучается система аллотипов иммуноглобулинов. К началу настоящей работы было обнаружено восемь аллотипов ИГ, установлена цепьевая локализация семи из них. Шесть аллотипов Н2, НЗ, Н4, Н6, Н7, Н8 принадлежат./-тяжелым цепям, один (L1 А) - принадлежит легким цепям. Особое значение имеетто, что в противоречие с классической схемой наследования аллотипов ИГ изученных видов в виде сцепленных или аллельных признаков для аллотипов у-цепей ИГ норки длительное время не могли обнаружить ни тесного сцепления, ни ал-лелизма. Эта ситуация послужила отправным моментом для исследований, в результате которых было установлено, что Су -аллотипы норки имеют ряд видовых особенностей, отличающих их фенотипическую экспрессию и генетику. В частности, при изучении аллотипов НЗ, Н4, Н6 и Н8 было показано, что количественное проявление этих признаков может существенно различаться как по уровню, так и по стабильности экспрессии. Обнаруженные видовые особенности генетического контроля Су-аллотипов норки послужили
стимулом к изучению новых полиморфных систем ИГ этого вида и выяснению вопроса о том, распространяются ли эти особенности на другие аллотипы, прежде всего, принадлежащие другому типу субъединиц молекулы IgG -легким (L) цепям. Кроме того, присутствие некоторых аллотипов у части особей в минорных концентрациях приводит к ложноотрицательным результатам тестирования этих норок в стандартно используемой двойной имму-нодиффузии. Это требовало разработки новых высокочувствительных методов массового тестирования норок.
Цель и задачи исследования. Данная работа имела две основные цели: а) изучение новой аллотипической системы L-цепей норки, б) разработка новых чувствительных методов массового тестирования аллотипов ИГ.
Для этого необходимо было решить следующие задачи:
-
Идентифицировать аллотипы L-цепей ИГ норки.
-
Изучить генетический контроль аллотипов L-цепей.
-
Исследовать филогенез новых аллотипов.
-
Разработать новые методы иммуноферментного анализа для массового тестирования аллотипов.
В рамках решения основных задач имелось также в виду развитие частной генетики американской норки, пополнение числа генетических маркеров этого вида.
Научная новизна. Выявлены и идентифицированы три новых аллотипа L3 L4 и L5, являющихся маркерами Л—цепей ИГ. Установлено, что ранее обнаруженный аллотип легких цепей L1A представляет собой совокупность двух аллотипов, обозначенных L1 и L2. Установлено, что аллотипы L1-L5 находятся под контролем одного сложного Я —локуса. Полиморфизм X -цепей в популяции поддерживается благодаря существованию четырех гаплотипов L ' ,
l4l3hlw.
Установлено, что аллоантигены L1 и L2 представлены у всех без исключения исследованных видов семейства куницеобразных, a L3, L4 и L5 являются видоспецифичными для американской норки.
Разработано два варианта иммуноферментного спот-анализа, позволяющего проводить массовые тестирования норок с высокой чувствительностью.
Теоретическое и практическое значение. Проведенные исследования, в результате которых выявлен аллотипический полиморфизм X -легких цепей, установлен его генетический контроль, а также проведен сравнительный анализ этого полиморфизма в семействе куницеобразных, вносят вклад в частную генетику американской норки и других исследованных видов семейства, расширяют наши представления об эволюции и функционировании одного из наиболее сложных мультигенных семейств генома эукариот. Совокуп-
ность результатов настоящего исследования показывает, что обнаруженные ранее особенности фенотипической экспрессии и генетического контроль ал-лотипов норки характерны только для Су -аллотипов этого вида, тогда как генетика аллотипов локусаА -легких пепей норки соответствует классическим схемам функционирования локусов ИГ млекопитающих.
Открытие у американской норки новых аллотипов А -цепей и возросший в связи с этим уровень выявляемого TgG-яолиморфизма позволяют существенно повысить возможность использования маркеров Я-цепей для генетико-се-лекционной работы с норкой.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на 5-й Всесоюзной межуниверситетской конференции "Биология клетки" (Тбилиси, 1987), на V съезде ВОГиС (Москва, 1987), на III школе-семинаре по генетике и селекции животных (Новосибирск, 1989).
Структура и объем работы. Рукопись диссертации включает: введение, обзор литературы (глава 1), описание материала и методов (глава 2), изложение собственных экспериментальных результатов (главы 3 и 4), обсуждение результатов (глава 5), выводы и список литературы. Общий объем диссертации 146 страниц, включая 13 таблиц и 22 рисунка