Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ II - 50
1.1. Общие сведения о строении, функции,классовом составе и биосинтезе липопротеинов сыворотки крови . ...II - 22
1.2. Особенности строения и функции липопротеинов низкой плотности ..22 - 27
1.3. Генетические системы аллотипов липопротеина низкой плотности. 27 -38
1.4. Аллотипы липопротеина высокой плотности.38 -42
1.5. Связь липопротеинов и их иммуногенетического полиморфизма с патологией 42 - 46
1.6. Иммуногенетика американской норки и постановка задачи исследования, 46 - 50
ГЛАВА II. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ... 51 - 69
II.І. Материал... 51 - 57
II.І.І. Объект исследования 51
II.1.2. Получение и хранение сывороточных образцов. 51 - 55
II.1.3. Аллоиммунизация 55 - 57
II.І.4. Гетероиммунизация 57
II.2. Методы 57 - 69
II.2.1. Реакция двойной иммунодиффузии в агаровом геле 57 - 59
II.2.2. Истощение и доработка антисывороток59- 61
II.2.3. Иммуноэлектрофорез. 61 - 64
II.2.4. Общие и специфические характеристические реакции... 64 - 65
II.2.5. Препаративное ультрацентрифугирование 65 - 66
II.2.6. Радиальная ишунодиффузия.. 66 - 67
II.2.7. Регистрация препаратов 67 - 69
СОБСТВЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ.
ГЛАВА III. ВЫЯВЛЕНИЕ И ИЗУЧЕНИЕ АЛЛОТИПОВ ЛИПОПРОТЕИНА НИЗКОЙ ЩОТНОСТИ У АМЕРИКАНСКОЙ НОРКИ 70-125
Ш.І. Идентификация и генетический контроль аллотипа Ld1 70- 85
Ш.I.I. Идентификация аллотипа мі 70- 81
Ш.І.2. Генетический анализ 81- 85
Ш.2. Аллотип Ld2 и генетический анализ Ld-систем 85-103
Ш. 2.1. Идентификация аллотипа Ld2 85- 96
Ш.2.2. Генетический анализ аллотипов Ldl и Ld2 96-103
Ш.З. Молекулярная и количественная фенотипическая экспрессия генов Ld-системы I03-II6
Ш.4. Изучение эволюции Ld-системы... II6-I25
Ш.4.Г. Филогенетический анализ антигенных специфичностей Ld1 и bd2 II6-I22
Ш. 4.2. О субвитальности гена Ld2 122-125
ГЛАВА ІV. ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКАЯ СИСТЕМА НОРОЧЬЕГО ПРОТЕИНА НИЗКОЙ ПЛОТНОСТИ (ОБЩЕЕ ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ) 126-150
ІV.І. Некоторые итоги идентификации и генетического анализа аллотипов Ld-системы 126-130
ІV.2. Особенности фенотипической экспрессии генов, кодирующих аллотипы Ldl и Ы2 в связи с общими представлениями о молекуляр-но-генетической организации Ld-системы
ЛНП норки I3I-I40
IV.З. Эволюционный аспект Ld-системы .. 140-150
ІV.3.1.. Филогенетический анализ 140-147
І.3.2. О возможном дифференциальном отборе Ld-аллелей 147-150
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 150-155
ВЫВОДЫ 156-157
ЛИТЕРАТУРА... 158-194
- Общие сведения о строении, функции,классовом составе и биосинтезе липопротеинов сыворотки крови
- Аллоиммунизация
- Идентификация и генетический контроль аллотипа Ld1
- Некоторые итоги идентификации и генетического анализа аллотипов Ld-системы
Введение к работе
Открытие и изучение генетических систем аллотипов - антигенов, по которым различаются особи одного и того же вида - является традиционным и одним из важнейших направлений иммуноге-нетики (Тихонов, 1967; Эфроимсон, 1971; Фьюденберг и др.,1975; Брондз, Рохлин, 1978; Снелл и др., 1979; Купер, 1980; Баранов, 1981; Петров, 1976,1982; Алтухов, 1983; Зарецкая, 1983). Исследователи, работающие в этом направлении, которое позволяет получать разнообразные данные о генетическом контроле, функции и селективном значении внутривидового полиморфизма по антигенам, оперируют с тремя основными типами иммуногенетических систем: I) системы аллоантигенов поверхностных мембран эритроцитов - группы крови человека и животных; 2) системы аллоантигенов поверхностных мембран лимфоцитов, среди них, прежде всего, главный комплекс тканевой совместимости; 3) системы аллоантигенов белков сыворотки крови - аллотипов.
Как показывают исследования человека, лабораторных и некоторых сельскохозяйственных животных, наличие аллотипов особенно характерно для таких сывороточных белков, как иммуноглобулины, о 2~макроглобулины и липопротеины. Одним из двух главных в количественном и функциональном отношениях классов сывороточных липопротеинов является липопротеин низкой плотности. У него среди сывороточных липопротеинов наиболее выражен алло-типический полиморфизм. Генетические системы аллотипов этого класса липопротеинов наиболее полно исследованы у человека, свиньи и кролика (Morganti et al., 1975; Rapacz, 1978; Dray et al., 1974).
С 1972 года в нашей лаборатории проводится комплексное им- муногенетическое изучение, в том числе в сравнительно-эволюционном плане, американской норки (Mustela vison Sclireber), Почему осуществляется такое исследование на столь нетрадиционном для иммуногенетики объекте, каковым является норка? Во-первых, этот зоологический вид является основным в пушном звероводстве СССР. На долю норки приходится 85% в общем объеме заготовок "клеточной" пушнины, который в десятой пятилетке составил 62 млн. шкурок стоимостью 3 млрд. рублей. В настоящее время пушная индустрия - важнейшая сырьевая база пушного экспорта и меховой промышленности (Афанасьев, 1981, 1982). Совершенствование селекции и, следовательно, повышение производительности и экономичности при выращивании американской норки требует развития представлений о биологических особенностях, в том числе о частной генетике, этого вида пушного зверя. Промышленное разведение поставило норку в необычные, по сравнению с естественной средой, условия обитания. В частности, произошло значительное сосредоточение зверей, в связи с чем возросло количество заболеваний различной этиологии. Необходимы работы по изучению естественных механизмов иммунологической защиты и других биохи-мико-генетических процессов, определяющих комплекс адаптационных свойств норки в новых условиях существования. Иммуногенети-ческий подход в этом случае может быть весьма продуктивен (Эф-роимсон, 1968; Феннер и др., 1977; Петров, 1976, 1982).
Во-вторых, интенсивное развитие новой отрасли животноводства - пушного звероводства, создало незаменимую для экспериментатора-эволюциониста модель. Эта модель сочетает в себе и сохранение многих физиологических особенностей, присущих диким сородичам, в том числе, приспособленности;''жизни в природе, и подверженность существенным и быстрым преобразованиям призна- ков и функций организма, порожденным действующим на ранних стадиях одомашнивания дестабилизирующим отбором (Беляев, 1968, 1981, 1983). Норка разводится в искусственных условиях промышленных звероферм всего лишь 50-60 лет, т.е. находится в самом начальном периоде доместикации. Поэтому, этот пушной зверь является одним из редких видов млекопитающих, наиболее пригодных для познания специфики микроэволюционного процесса, присущей ранним стадиям доместикации. Эффективное использование норки для решения задач эволюционной генетики требует выявления у этого вида, в частности, маркеров полиморфных генетических систем.
В связи с этим, в лаборатории было впервые идентифицировано и разносторонне изучено несколько генетических систем аллотипов: генный комплекс, кодирующий аллотипы константной области ^-тяжелых цепей иммуноглобулинов (известно шесть igG-аллотипов и соответствующих генов) (Беляев и др., 1984 б); сцепленные ыа и ыв аллотипы и кодирующие их гены легких цепей иммуноглобулинов (Баранов и др., 1984 а) и, наконец,мультигенное семейство (известно 12 генов) липопротеина очень высокой плотности, названное Lpitt-системой (Баранов и др., 1984 в). Имеются экспериментальные данные, указывающие на гомологию молекул этого необычного класса липопротеинов сывороточному сх^-макроглобулину норки, у которого аллотипов не найдено (Баранов,1981;Ермолаев,1984).
Из сказанного выше очевидна актуальность исследований, направленных на выявление и изучение иммуногенетических систем американской норки. Целью настоящей работы явилась разработка еще одной генетической системы аллотипов норки - системы липопротеина низкой плотности. В плане реализации общего направления этого исследования нами были поставлены следующие задачи:
I) Идентифицировать основные аллотипы липопротеина низкой плотности у американской норки и выяснить их генетический контроль.
Определить характер качественной и количественной молекулярной экспрессии этих аллотипов и кодирующих генов.
Провести сравнительно-популяционное исследование норок по соответствующей иммуногенетической системе.
Получить представление об эволюции и селективном значении генов системы норочьего липопротеина низкой плотности.
Все результаты проведенной нами работы получены впервые. На защиту выносятся следующие основные положения: а) Установлена иммуногенетическая система липопротеина низкой плотности американской норки - Ld-система, которая представлена двумя аллоти-пами Ldi и Ld2. Эти аллотипы кодируются аутосомными кодоми-нантными аллельными генами ы1 и ш2. ьа-локус осуществляет генетический контроль всего пула молекул липопротеина низкой плотности в сыворотке крови норок, б) Кодоминантность генов Ld и Ld2 проявляется в их независимой друг от друга количественной и качественной фенотипической экспрессии в сыворотке крови гетерозиготных норок. На качественном уровне это проявляется в наличии в крови гетерозигот только двух молекулярных вариантов липопротеина низкой плотности, каждый из которых маркирован либо аллотипом Ldi, либо - Ld2 и, следовательно, в отсутствии гибридных по аллотипам молекул. О количественном проявлении ко-доминирования Ld-аллелей свидетельствует установленный при сравнении генотипов bd1/Ld1 и Ld1/Ld2 эффект дозы гена Ld1, а также примерно равный вклад Ld-аллелей в определение количественных отношений между молекулами Ldi и Ld2 в сыворотке крови гетерозигот, в) В разных популяциях американской норки наблюдается одинаковое и резкое преобладание частоты гена Ld1 (~0,9) над частотой аллеля bd2 (^0,1). г) Распространенность антигенной специфичности аллотипа Ldi в качестве моно-морфного или почти мономорфного признака не только у американской норки и близкородственных ей видов куньих, но и у филогенетически сильно отдаленных от этого семейства млекопитающих, является свидетельством высокой селективной ценности гена Ld , сохраняющейся в ходе макроэволюции. Низкая частота, по всей ве- роятности видоспецифичного для американской норки, гена Ld и полученные сведения о пониженной приспособленности гомозиготных носителей этого гена позволяют считать его субвитальным.
Автор искренне благодарит сотрудников лаборатории эволюционной генетики Н.А. Юришину, В.И. Ермолаева, И.И. Фомичеву, Е.И. Жолнеровскую за помощь в проведении исследования. Глубокую благодарность автор приносит руководителю работы доктору биологических наук O.K. Баранову.
Автор искренне признателен академику Д.К. Беляеву за постоянное внимание к работе. " II ***
Общие сведения о строении, функции,классовом составе и биосинтезе липопротеинов сыворотки крови
В 1929 году впервые был выделен из плазмы крови растворимый липопротеин (Macheboeuf, 1929), названный в последствии белком Машбефа. Тем самым положено начало изучению интересного, но во многом еще загадочного класса сложных белков сыворотки крови, содержащих значительное количество липидных компонентов. Основным объектом изысканий долгое время оставались сывороточные ли-попротеины человека; именно для липопротеинов плазмы крови человека разработаны две наиболее часто используемые системы классификации липопротеинов. Характернейшим свойством липопротеинов, с которым столкнулись исследователи еще на самом раннем этапе изучения этих протеидов, является их необычайная гетерогенность (Карманский и др., 1975; Климов, 1981; Lewis, 1971; Pownali et el», 1979; Kahion et ai., 1982). Высокая гетерогенность липопротеинов обусловлена качественными и количественными различиями как белковых, так и их липидных компонентов, которые коррелируют с такими физическими свойствами, как электрический заряд молекул и диапазон плотности при ультрацентрифугировании. Эти два свойства и были использованы, особенно на ранних этапах исследований, для создания методов фракционирования липопротеинов и послужили основой для классификации этих протеидов (Климов, 1977; Scanu, 1971; Scanu, Wisdom, 1972; Rapacz, 1978).
Аллоиммунизация
Гетероантисыворотки получали иммунизацией кроликов породы шиншилла весом не менее 3,5 кг. Взрослым самцам подкожно в область шеи вводили дробными порциями 3 мл иммунизационного материала. За первой инъекцией I мл антигена, эмульгированного в полном адъюванте Фрейнда, следовала серия инъекций оставшегося антигенного материала по 0,2 мл без адъюванта с интервалом в одну неделю. Реиммунизацию проводили через два месяца после взятия крови половиной кубика сыворотки-антигена без адъюванта. Кровь брали через семь дней после инъекции.
Получены следующие антисыворотки: гетероантисыворотка против цельной сыворотки крови норки (Кат-СН) инъецированием смеси цельной сыворотки крови нескольких норок, гетероантисыворотка против липопротеина низкой плотности норок (Кат-ЛНП) введением кроликам фракции ЛНП норок и гетероантисыворотка против Lpm-липопротеина очень высокой плотности норок (Кат-Lpm) инъецированием соответствующей фракции (табл. 4). Фрак-ции ЛНП и ЛОШ были выделены с участием В.И.Ермолаева.
Идентификация и генетический контроль аллотипа Ld1
В результате двух циклов иммунизации цельной сывороткой группы норок, состоящей из, наряду с другими, нами получена новая моноспецифическая преципитирущая антисыворотка. Антигенную специфичность, которую выявляла эта антисыворотка (ее продуцентом был самец № 6617), предварительно назвали Xj. После проверки специфической активности антисыворотки 6617, она была проанализирована на панели норочьих сывороток-антигенов (рис. 9 ). Этим были показаны полиморфизм Xj и иммунохимическая независимость этого антигена от других аллотипических маркеров, тестируемых в нашей лаборатории. Факт иммунохимической специфики Хр показанный на популяционном уровне (тестированием панели), полностью подтвержден тестом на иммунологическую неидентичность сравниваемых антигенов, идентифицированных ранее, в реакции двойной иммунодиффузии, а также безуспешностью абсорбции новой алло-антисыворотки нереагирующими с ней норочьими сыворотками, которые в разных сочетаниях содержат другие сывороточные аллотипы.
Первоначальное тестирование аллоантисыворотки 6617 проведено на панели из 16 сывороток, выбранных случайно
Некоторые итоги идентификации и генетического анализа аллотипов Ld-системы
Важным свойством липопротеинов, которое в значительной степени осложняет работу с ними, является их необычайная гетерогенность, о чем подробно уже было сказано в разделе І.І. Учитывая высокую гетерогенность ЛНП,для возможно более точной идентификации его молекул,несущих аллотипические детерминанты, нами использован комплекс разнообразных методов. Молекулы с аллотида-ми bdi и Ld2 отнесены к классу ЛНЇЇ на основании следующих критериев: I) анти-ьаг, а впоследствии и анти-ьп, получали путем иммунизации препаратом норочьего липопротеина с плотностью 1,006-1,100 г/мл, который, как было установлено впоследствии, и был истинным ЛНЇЇ; 2) Электрофоретическая подвижность молекул с детерминантами Ы1 и Ы2 была идентична подвижности пула молекул, несущих изотипические детерминанты ЛНЇЇ норки; 3) иммуно-преципитаты аллотипов idl и Ld2, также как изотипа ЛНЇЇ,давали контрастные результаты при окрашивании на липиды и белки, что свидетельствует о свойственном ЛНЇЇ высоком содержании жиров и низком содержании белка в его частицах; 4) отсутствовала взаимопреципитация между анти-Ldi и анти-ы2 иммунными сыворотками после удаления из них собственных ЛШІ (см.рис,24); 5) основная масса Ldi- и Ld2 4acTH4 при ультрацентрифугировании распределялась в диапазоне плотности от 1,006 до 1,100 г/мл; и, наконец, 6) иммунохимически доказано, что молекулы с аллотипами Ldi и Ld2 идентичны по антигенному изотипу норочьему ЛНП.
Таким образом, молекулы, несущие ьаі и Ld2, идентичны по всем исследованным физико-химическим и иммунохимическим (кроме аллоантигенности) свойствам. Они четко отличаются по этим свойствам от молекул наиболее изученной и сложной иммуногенетичес-кой системы норок - системы Lpm-липопротеина (см. раздел 1.6). О корректности использованных критериев для определения принадлежности ЛНП аллотипов bdi и Ld2 свидетельствует, в частности, тот факт, что, если анти-Ldi первоначально была получена алло-иммунизацией цельной сывороткой норки, то анти- Ld2 - путем иммунизации препаратом липопротеина, выверенного и оцененного по соответствующим критериям.
Учитывая существование видовых различий в гетерогенности ЛНП (см. раздел I.I) и пионерский характер нашей иммуногенетической работы на норке, представлялось особенно важным выяснить, является ли несущий аллотипические детерминанты їді и Ld2 ЛНП норки гомологом ранее идентифицированных и хорошо изученных ЛНП человека и других видов животных. Нами получены достаточно убедительные иммунохимические доказательства этой гомологии: выявлена четкая перекрестная иммунологическая реакция между норочьим ЛНП, с одной стороны, и ЛНП человека и свиньи, с другой стороны. Более того, антигенная специфичность Ldi обнаружена на молекулах ЛНП человека (см. раздел Ш.4).