Введение к работе
Аюуальность.
Существует незначительное количество современных работ, описывающих взаимоотношения экзогенной ДНК и клетки, а именно: что за ДНК, и в какой форме присутствует в межклеточном пространстве; как происходит захват ДНК из околоклеточного пространства; что происходит с ДНК в цитоплазме; каким образом ведет себя ДНК в ядре. В настоящее время отсутствует разработанная концепция оборота экзогенной ДНК как генетической информации, дающая четкое представление о молекулярно-биологических характеристиках и функциональных возможностях этой ДНК в каждом моменте клеточного цикла. Тем не менее, каждый из указанных этапов в разной степени изучен и представляет часть знания необходимого для понимания общей картины этого сложного многофакторного процесса.
Многочисленные данные, полученные в настоящее время, свидетельствуют о том, что в межтканевых жидкостях и в плазме крови в норме всегда присутствует ДНК, которая является постоянным компонентом этих тканей организма (Anker et al., 1999; Anker, 2000). Более того, количество ДНК плазмы отражает функциональное состояние организма в целом.
Установлено, что существует несколько путей проникновения ДНК во внутриклеточное пространство. Проникновение экзогенной ДНК внутрь клетки может проходить за счет поглощения апоптозных телец (Holmgren et al., 1999; Bergsmedh et al., 2002). Описан рецептор - опосредованный путь проникновения экстраклеточного материала ДНК во внутренние компартменты эукариотической клетки. За этот путь доставки молекул ДНК отвечают рецепторы, расположенные на цитоплазматической мембране (Loke et о/., 1989; Bennett et al., 1985; Zamecnik et al., 1994). При этом проведенные исследования подтверждают тот факт, что этот процесс не связан с деградацией ДНК и последующим ее ресинтезом внутри клетки (Ledoux, Charles, 1972).
Опубликованы результаты многочисленных экспериментов по изучению мутагенного эффекта экзогенной ДНК на эукариотические организмы. Главное на что указывается в этих работах это то, что существует трансформация признака связанная с воздействием экзогенной ДНК. Трансформация возможна как в культуре клеток, так и в живом организме. Полученные факты свидетельствуют о том, что экстраклеточная ДНК может усваиваться как генетическая информация и проявляться как фенотипический признак (Гершензон, 1939, 1966, 1975, 1996; Ledoux, 1965; Гершензон, Александров, 1982; Pulciani et al, 1982; Garcia-Olmo et al, 1999; Garcia-Olmo etal, 2000).
Разработка концепции воздействия экзогенной ДНК как генетической информации является важнейшей основой генной терапии будущего, которая охватывает все аспекты целенаправленного контролируемого изменения генома соматических клеток человека и исправления генетических дефектов и несоответствий, врожденно детерминированных или возникших в результате внешних воздействий.
Одной из моделей позволяющих определить некоторые молекулярные особенности взаимодействия соматической раковой клетки и экзогенной ДНК является модель культуры клеток аденокарциномы молочной железы человека
MCF-7. В предлагаемом исследовании мы акцентировали внимание на изучении поведения фрагментированной экзогенной ДНК при ее проникновении в клеточные компартменты клеток линии MCF 7, и проверки гипотезы о возможности переноса генетического материала. Мы полагали, что в процессе культивирования, в определенном количестве клеток, за счет существующего механизма переноса генетической информации из экстраклеточной ДНК, произойдет возвращение к исходному генотипу на примере мутированного гена каспазы 3. При этом новое состояние ДНК и фенотипическое проявление функционирования гена каспазы 3 можно будет проверить экспериментально.
Цели и задачи работы.
Цель работы - исследовать воздействие экзогенной ДНК на модели культуры клеток аденокарциномы молочной железы человека MCF-7 и возможности восстановления активности гена каспазы-3. В рамках целей предлагаемой работы были поставлены следующие задачи:
1. Определить параметры поглощения экзогенной ДНК клетками культуры
аденокарциномы молочной железы человека MCF-7.
2. Проанализировать взаимодействие экзогенной ДНК и реципиентного
клеточного генома. Выяснить, происходит ли изменение фенотипа клеток и
восстановление функциональной активности фермента каспазы 3 при инкубации
культуры клеток MCF-7 с экзогенной ДНК человека.
3. Установить, связано ли восстановление функциональной активности фермента
с исправлением мутации в 4 экзоне гена каспазы 3 клеток MCF-7 под действием
экзогенной ДНК человека.
Научная новизна.
-
Обнаружено, что экзогенная ДНК за очень короткий промежуток времени (от нескольких секунд до минуты) достигает всех основных компартментов (цитоплазма, ядро) клеток культуры аденокарциномы молочной железы человека MCF-7.
-
Установлено, что ДНК накапливается во внехромосомной фракции клеточного ядра клеток культуры MCF-7. Во внехромосомной фракции клеток MCF-7 может постоянно присутствовать до 2.0% от гаплоидного генома фрагментированной экзогенной ДНК
-
Показано, что линейный размер исходной фрагментированной ДНК, депонированной во внехромосомной фракции, возрастает от 200 - 500 п.н. до порядка 10 000 п.н. Увеличение размера является следствием лигирования фрагментов между собой.
-
Молекулярно - генетическими методами доказано, что восстановление функциональной активности фермента каспазы 3 линии MCF-7 связано с реверсивным исправлением дефектного локуса гена, которое происходит за счет гомологичного обмена экзогенного экстрахромосомального фрагмента ДНК с локусом хромосомы, несущим делецию.
Практическая значимость.
Даны качественная и количественная характеристики экзогенной ДНК доставляемой в основные клеточные компартменты (цитоплазма, ядро) соматической клетки.
Обнаружен эффект восстановления активности housekeeping гена Каспазы 3 произошедший в результате естественных репаративно-рекомбинационных процессов между хроматином соматической раковой клетки и гомологичного фрагмента экстраклеточной ДНК. Полученные результаты позволяют определить один из векторов генной терапии как возможность изменять генетический статус и фенотип малегнезированный клетки за счет длительного присутсвия в окружении раковой клетки достаточного количества экстраклеточной терапевтической ДНК в виде фрагментов размером 200-6000 п.н. и содержащей всю совокупность геномных последовательностей в немутаптной форме.
Положения, выносимые на защиту.
-
Экзогенная ДНК за очень короткий промежуток времени (от нескольких секунд до миігутьі) достигает всех основных клеточных компартментов клеток культуры аденокарциномы молочной железы человека MCF-7 (цитоплазма, ядро) и накапливается во внехромосомной фракции.
-
Инкубация культуры клеток аденокарциномы молочной железы человека MCF-7, несущей делецию в гене каспазы 3, с экзогенной ДНК человека приводит к характерной апоптотической нуклеосомной фрагментации хроматина, что связано с реверсивным исправлением дефектной нуклеотидной последовательности гена.
Апробация работы.
Результаты работы представлены на рабочем совещании «Функциональная организация клеточного ядра» (Прага, 5-8 мая 2006 г.), международной конференции «Физико-химическая биология» (Новосибирск, 30 июля -3 августа 2006 г.), международной молодежной научно-методической конференции «Проблемы молекулярной и клеточной биологии» (Томск, 9-12 мая 2007 г.), II Съезде общества клеточной биологии и Юбилейной конференции, посвященной 50-летию Института цитологии РАН (Санкт-Петербург, 16-19 октября 2007 г.), научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в Сибири-2008» (Томск, 16-19 сентября 2008 г.) и на V Съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров, посвященного 200-летию со дня рождения Чарльза Дарвина (Москва, 21-27 июня 2009 г.).
Публикации.
По теме диссертации опубликованы 5 работ в рецензируемых отечественных и зарубежных журналах из списка ВАК.
Вклад автора.
Основные результаты получены автором самостоятельно. Работа с культурой MCF-7 проводилась совместно с к.б.н. Л.В. Мечетиной и с.н.с, А.Г. Шиловым (ИХБиФМ СО РАН). Молекулярно - биологические эксперименты проводились под руководством д.б.н. С.С. Богачева с участием к.б.н. А.С. Лихачевой (ИЦиГ СО РАН).
Структура и объем работы.
