Введение к работе
Актуальность темы диссертации. Одной из ведущих научных программ нашего времени является всемирная программа "Геком человека", направленная на молекулярно-генетическое исследование генома человека вплоть до определения полной последовательности нуклеотидов всех его хромосом. В нашей стране для работ в этом направлении была создана Государственная Научно-Техническая Программа "Геном человека". Работы по ГНТП ведутся в рамках Проектов, часть из которых непосредственно направлена на исследование отдельных хромосом человека. Данная работа выполнялась в рамках Проекта "Картирование хромосомы 13 человека".
До настоящего времени приоритетными по программе "Геном человека" в мире и в России являлись, в частности, два направления работ. 1) Построение физических карт генома человека, представленных в виде наборов перекрывающихся последовательностей рекомбинантных ДНК (контигов), расположенных известным образом вдоль хромосом человека. Относительно элементов коитига, клопов, картируют отдельные гены или мутации, в первую очередь представляющие интерес для фундаментальных научных исследований, а также для медицины. 2) Создание молекулярно-генетических маркеров, главным образом на основе простых тандемных повторов (STR) для генетического и физического картирования генома человека, а также для ДНК диагностики наследственных заболеваний человека.
Формирование физической карты проводится на основе хромосомспецифических библиотек клонов. Наиболее распространены и глубоко охарактеризованы библиотеки, созданные на основе космидных векторов из хромосом, очищенных на хромосомном сортере. Такие библиотеки созданы в частности в Лос-Аламосской Национальной Лаборатории (LANL), и в Фонде раковых исследования (ICRF), Великобритания- Эти библиотеки сконструированы и для хромосомы 13 человека, но ни одна из них не была охарактеризована к началу данной работы. Такая характеристика библиотек, наряду с подготовкой молекулярно-генетических маркеров на их основе, явилась первоочередной задачей по проекту "Картирование хромосомы 13 человека" ГНТП "Геном человека" и составила главную цель исследования, проведенного в диссертационной работе.
Дель исследования - анализ хромосомспецифических космидных клонотек по 13-й хромосоме человека и оценка их качества для физического картирования; выявление в этих библиотеках и характеристика космид, содержащих микросателлитные повторы для создания молекулярно-генетических маркеров 13-й хромосомы
В работе были поставлены следующие задачи:
-
Исследование и сравнительный анализ характеристик специфичных по хромосоме 13 космидных библиотек ICRF С108 и LA13NC01: определение количества и проверка ясизнеспособности клонов этих библиотек; рестрикционый анализ и определение размеров рекомбинантных космид; определение степени хромосомспецифичности библиотек; гибридизационная характеристика панели.клонов библиотек и построение контига в области гена ATP1AL1.
-
Выявление в космидных библиотеках и исследование распределения повторов различных типов для создания молекулярно-генетических маркеров хромосомы 13 человека: выявление STR-повторов девяти различных мотивов в составе рекомбинантных космид; исследование кластеризации STR различных мотивов в составе рекомбинантных космид; выявление-и анализ копийности генов рДНК в индивидуальных хромосомах 13 человека; выявление и анализ полиморфизма, связанного с генами рДНК 13-й хромосомы; анализ STR-состава космид, несодержащих рДНК.
-
Формирование набора STR-содержащих космид и их локализация е уникальных областях 13-й хромосомы.
Научная новизна и практическая значимость полученных рузудьтатов. Определено количество и жизнеспособность клонов в двух специфичных по хромосоме 13 космидных библиотеках - ICRF С108 и LA13NC01. Проведен рестрикционый анализ и определены размеры Солее чем 700 рекомбинантных космид, представляющих в совокупности более 1/6 части хромосомы 13 человека и являющихся охарактеризованными точками роста для создания космидного контига этой хромосомы. Экспериментально определена представительность этих библиотек и степень их хромосомспецифичности. Построен контиг космид в области гена ATP1AL1. Все исследованые характеристики показали пригодность библиотек ICRF и LANL для построения космидных контигов.
Гибридизацией с STR-зондами 9 мотивов (6А, CAG, CCG, САС, TCG, GGA, 6АСА, GAGT и 6ATG) идентифицированы 7501 положительных космидных клонов, доступных для создания молекулярно-генетических маркеров 13-й хромосомы человека на основе выявленных клонов. Обнаружен феномен кластеризации STR различных мотивов в составе рекомбинантных космид, связанный с их присутствием в повторяющихся последовательностях размером со вставку в космидах. К таким повторам относятся гены рДНК и повторы не менее одного нового типа. Определена копийность генов рДНК и показано почти 5-кратное различие в числе этих генов в двух индивидуальных хромосомах 13 человека, составившая 41 копию в источнике хромосомы для космид ICRF и 1ЭД копий - з источнике для космид LANL. Выявлен полиморфизм генов рДНК 13-й хромосомы, проявляющийся на нескольких уровнях. Показано, что микросателлитные мотивы CAG и GATG имеют предпочтительную локализацию в прителомерном районе хромосомы 13 (q32-34), относительно менее насыщенном генетическими маркерами. Для 36 космид, содержащих STR маркер, установлена цитогенетическая локализация на хромосоме 13 как единственная в геноме человека. Информация об этих космидах передана в международную базу данных по геному человека (6DB), где эти космиды получили идентификационные D-номера.
Создана общедоступная база данных библиотек LANL и ICRF, которая позволяет интегрировать результаты, получение нами и другими исследователями. Все 28500 клонов двух библиотек переданы на хранение и доступны в Всеросийской коллекции промышленных микроорганизмов при ГосНииГенетика.
Результаты работ по диссертации использованы по сотрудничеству в рамках проекта "Картирование хромосомы 13" в лабораториях ИМБ РАН, ИБГ РАН, ИБХ РАН, ГосНииГенетика и ВНЦПЗ Минздрава РФ, а тагосе в рамках международного проекта "Картирование хромосомы 13" в лабораториях Фонда исследований рака, Великобритания.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на страницах и составлена по традиционному плану. Полученные данные иллюстрированы 5 рисунками и 14 таблицами.