Введение к работе
Актуальность проблемы. Целая группа неизлечимых смертельных заболеваний лекопитающих связана с накоплением в тканях головного мозга высокомолекулярных грегатов белка, получившего название РгР (от Prion Protein). К этой группе относятся: /бчатая энцефалопатия крупного рогатого скота или «Коровье бешенство», «скрэпи» овец, шзнуряюшая болезнь» лосей и оленей, а также такие болезни человека, как «Куру», болезнь рейцфельдта-Якоба, фатальная семейная бессонница, болезнь Герстманна-Штрауслера-Іейнкера и другие заболевания. Прионные заболевания могут возникать спонтанно, для екоторых форм выявляется наследственная предрасположенность, кроме того, выделяют нфекционные формы заболеваний (по: Prusiner, 1995).
Согласно гипотезе, выдвинутой Стенли Прусинером, причиной прионных заболеваний
является изменение мономерной изоформы белка РгРс (от cellular) на олигомерную изоформу
PrPSc (от scrapie). PrPSc является своеобразной матрицей для вновь синтезируемых молекул и
может наследоваться (по: Prusiner, 1998). Несмотря на то, что гипотеза Прусинера получила
кспериментальные подтверждения и является общепризнанной, факторы, контролирующие
прионизацию РгР или блокирующие болезнетворные афегаты, до сих пор не
охарактеризованы. В настоящий момент исследования проводятся в основном на
абораторных животных, с использованием клеточных культур, или в системе in vitro,
едостатком систем in vivo является значительная длительность, высокая стоимость
роводимых экспериментов, и, главное, невозможность проводить масштабный поиск
акторов, контролирующих процесс прионизации и амилоидогенеза. В свою очередь, данные,
олученные в системе in vitro, не всегда отражают процессы, реально происходящие в живой
іетке.
В 1999 году в работе Ма и Линдквист было показано, что продукция мышиного РгР в итоплазме дрожжей приводит к образованию агрегатов, сходных по биохимическим арактеристикам с агрегатам PrPSc, которые выявляются в мозге больных млекопитающих (Ма nd Lindquist, 1999). Дрожжи, как один из самых простых и наиболее изученных генетических бъектов, предоставляют уникальные преимущества для поиска факторов, регулирующих рионнную конверсию РгР. К сожалению, сама по себе агрегация РгР в дрожжах не имеет идимого фенотипического проявления, что существенно затрудняет исследования. Остаётся ткрытым вопрос, проявляют ли полимеры РгР прионные свойства в гетерологичной системе, о есть, способны ли они передавать свою конформацию в ряду клеточных поколений, или бразуются в клетке de novo. В нашей работе мы показали, что агрегаты РгР, а также химерных елков, содержащих последовательность РгР, обладают типичными свойствами амилоидных олимеров. Более того, гибридный белок PrP-GFP формирует в дрожжевых, клетках несколько ипов агрегатов, различающихся по морфологическим и физическим свойствам. Для анализа шследования различных типов PrP-содержащих агрегатов нами была разработана система, озволяющая выявлять конформационные изменения РгР на фенотипическом уровне. Мы юказали, что химерный белок, содержащий последовательность РгР, а также репортерную рожжевую последовательность Sup35MC, может быть представлен в дрожжах в двух тьтернативных изоформах [PrFs~] и ]ргр*~], которые стабильно наследуются в ряду еточных поколений. Белок PrP-Sup35MC в изоформе [PrPs~] соответствует всем основных арактеристикам дрожжевого приона. Показано, что шаперон Hspl04, который контролирует лигомеризацию всех известных дрожжевых прионов, не расщепляет РгР-содержащие милоидные агрегаты на олигомерные зёрна. Вместе с тем, выявлена новая функция Hspl04 -частие в регуляции экспрессии генов на посттранскрипционном уровне.
Работа выполнена в лаборатории генетики животных СПбГУ. Отдельные эксперименты ыполнены в Техническом университете Атланты (г. Атланта, США) в лаборатории, озглавляемой Ю.О. Черновым.
Цель и задачи исследования. Целью данной работы является анализ агрегации и оценк прионных свойств белка РгР млекопитающих в дрожжевой системе. В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:
-
Проанализировать биохимические и физические характеристики агрегатов формируемых белками РгР и PrP-GFP в дрожжах Saccaromyces cerevisiae;
-
Провести цитологический анализ агрегатов PrP-GFP в дрожжевой клетке;
-
Оценить «токсичность» PrP-содержащих агрегатов для дрожжевых клеток;
-
Разработать систему для фенотипического анализа агрегации РгР в дрожжах исследовать возможность прионной конверсии этого белка в гетерологичной системе;
-
Оценить эффекты дрожжевого шаперона Hspl04 на агрегацию белка РгР и РгР содержащих гибридных белков в дрожжевой клетке.
Научная новизна работы. Показано, что при продукции белков РгР и PrP-GFP в дрожж S. cerevisiae образуются высокомолекулярные белковые агрегаты, сходные по биохимически! характеристикам с агрегатами белка РгР в мозге больных млекопитающих (устойчивость действию высоких концентраций протеиназы-К и детергентам (SDS и саркозилат натрия)) Выявлено, что в клетках дрожжей могут формироваться агрегаты, различающиеся п морфологии и динамике восстановления. Агрегаты PrP-GFP имеют цитоплазматическу локализацию и не колокализуются с клеточными компартментами: ядром, митохондриями вакуолью, эндосомами, аппаратом Гольджи, ЭПС. Показано, что агрегаты PrP-GFP, как агрегаты РгР, не токсичны для дрожжевых клеток. Впервые показано, что РгР сохраня прионные свойства в гетерологичной системе. На основании этого можно заключить, что либ факторы, контролирующие прионную конверсию РгР, представлены у эволюционн удалённых эукариотических организмов, либо стабильное воспроизведение прионно" изоформы не требует наличия дополнительных, факторов. Продемонстрировано, что Hspl04 н расщепляет агрегаты РгР, PrP-GFP и PrP-Sup35MC на олигомерные зёрна. Вместе с тем, выявлена новая функция дрожжевого шаперона Hspl04 - участие в регуляции экспрессии генов на посттранскрипционном уровне.
Практическая значимость. Использование химерного белка PrP-GFP даёт возможность оценивать с помощью флуоресцентной микроскопии эффект действия отдельных агентов, способствующих или препятствующих агрегации белка РгР. Получена система, позволяющая на фенотипическом уровне (рост - отсутствие роста дрожжей на селективной среде без аденина) наблюдать конформационные переключения последовательности РгР. Данная тест-система может быть использована для масштабного поиска факторов, взаимодействующих с белком РгР или регулирующих его конформационные переключения в системе in vivo. Результаты, представленные в диссертационной работе, могут быть использованы при чтении курсов лекций: «Молекулярная биология», «Молекулярная генетика», «Белки теплового шока», «Прионы», входящих в учебный план кафедры генетики и селекции СПбГУ.
Апробация работы. Результаты работы были представлены на международных конференциях по прионной биологии (Хингстон, Великобритания, 2005; Турин, Италия, 2006; Эдинбург, Великобритания, 2007); Международных конференциях по генетике и молекулярной биологии дрожжей (Ґетеборг, Швеция, 2003; Мельбурн, Австралия, 2007); 3-ем съезде генетиков и селекционеров России «Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития», (Москва, 2004); 2-ой конференции Московского общества генетиков и селекционеров «Актуальные проблемы генетики» (Москва, 2003).
Диссертация апробирована на научных семинарах лабораторий генетики животных и физиологической генетики кафедры генетики и селекции СПбГУ.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 работ.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из «Введения», «Списка сокращений», «Обзора литературы», «Материалов и методов», «Результатов и обсуждения», «Выводов», «Списка литературы», состоящего из 269 источников. Работа изложена на 167 страницах машинописного текста и содержит 39 рисунков и 13 таблиц.
![Идентификация и характеристика генов, влияющих на поддержание и фенотипическое проявление прионоподобного детерминанта [ISP+], у дрожжей Saccharomyces cerevisiae](/i/i/4278/150135.png "Идентификация и характеристика генов, влияющих на поддержание и фенотипическое проявление прионоподобного детерминанта [ISP+], у дрожжей Saccharomyces cerevisiae Аксенова Анна Юрьевна")
