Введение к работе
Актуальность темы. Перестройки генетического материала - важный биологический процесс, приводящий к созданию новых геномов в эволюции и являющийся этапом ряда механизмов клеточной дифференцировки. Оптимальный уровень перестроек является важным адаптивным признаком віща: поддержание такого уровня, с одной стороны, обеспечивает вігутрігввдовое разнообразие, необходимое для существования вида, а с другой стороны предотвращает возможные негативные для организма последствия перестроек.
Источником перестроек в геноме могут служить короткие повторы -диспергированные и тандемные. Такие неспецифичные повторяющиеся последовательности встречаются как в геноме прокариота, так и эукариота. Таидемные короткие повторы (длина повторяющихся элементов от 2 до 40 п.о.) обнаружены в геноме человека примерно в 1000 локусов (Charlesworth et al., 1994). Диспергированные короткие повторы - это случайно совпадающие короткие участки ДНК. Например, повторы 6 п.о., 5 п.о., 4 п.о. во фрагменте ДНК размером 100 п.о. в среднем встречаются два, пять и девятнадцать раз соответственно (Moore et al., 1984). Перестройки с участием столь многочисленных коротких повторов могут служить источником материала, используемого для эволюционного преобразования генома. В то же время на сегодняшний день является доказанным, что перестройки с участием коротких повторов приводят к развитию у человека тяжелых наследственных заболеваний и рака (Krawzcak and Cooper, 1991; Sutherland and Richards, 1995; Fishel and Kolodner, 1995). Настоящая работа посвящена изучению генетігческого контроля образования перестроек с участием коротких диспергированных повторов, в геноме эукариогического организма - дрожжей Saccharomyces cererisiae. При изучении образования делеций по коротким повторам, фланкирующим модельные инсерции в гене LYS2, нами было обнаружено, .что на перестройки по коротким диспергированным повторам влияют мутации в генах, продукты которых участвуют в репликации и рекомбинационной репарации ДНК.
Задачи работы. Задачи исследования определены следующим образом:
1) Конструирование удобной модельной системы для изучения образования делеций
по коротким диспергированным повторам;
2) Изучение влияния мутаций в различных генах аппарата репликации на
стабильность короткій прямых повторов;
3) Изучение эффекта генов системы эксцизионной, мутагенной и рекомбинационной
репарации на образование делеций по коротким прямым повторам.
Научная новизна полученных результатов. Для изучения генетического контроля образования делеций по коротким диспергированным повторам были
4 использованы инсерций, фланкированные коротыши (6-9 п.о.) прямыми повторами. Между прямыми короткими повторами были расположены либо случайные последовательности ДНК, либо квазипалиндромы, способные образовывать вторичную структуру. Кроме того, мы сконструировали специальную систему для селекции протяженных делеций по коротким повторам. Используя эти модельные системы, мы доказали, что уровень перестроек с участием коротких повторов повышается у штаммов, несущих мутацию роІЗ-t в гене для ДНК-полимеразы 8, вне зависимости от того, возможно ли образование вторичной структуры типа шпильки на участке ДНК между повторами. Этот результат - единственное пока свидетельство важной роли активности ДНК-полимераз, не связанной с корректорской функцией, в индукции перестроек - делеций по коротким повторам у эухариота. Другие компоненты аппарата репликации, как нам удалось обнаружить, тоже влияют на стабильность коротких диспергированных повторов. Помимо эффекта мутации роІЗ-t на делеций квазипалиндромных инсерций влияет мутация ро130-52 в гене для ядерного антигена пролиферирующих клеток дрожжей (PCNA). Одна из функций этого белка - обеспечение процессивного синтеза ДНК во время репликации двумя ДНК-полимеразами; кроме того, показано, что этот фермент взаимодействует с белками репарации ДНК. Мутация ро130-52 затрагивает именно репликативную активность PCNA (Ayyagari et al., 1995) и одновременно, как было продемонстрировано в нашей работе, приводит к дестабилизации квазипалиндромных инсерций, фланкированных короткими прямыми повторами.
Мы показали, что в образовании протяженных делеций непалиндромных инсерций у мутантов роІЗ-t, участвуют все проверенные нами гены рекомбинационной репарации - RAD50, RADS1, RAD52, RADS4, RAD55, RAD57. Скорее всего, мы обнаружили новое свойство продуктов рекомбинационных генов, которые, по последним данным, образуют в клетке сложный комплекс. Это свойство - взаимодействие репликативного аппарата и продуктов рекомбинационных генов, которое проявляется в снижении роІЗ-t - стимулируемых частот делеций у мутантов по перечисленным генам рекомбинационной репарации. Такое влияние на образование делеций, является новым свойством, характерным для всех упомянутых генов рекомбинационной репарации.
Теоретическая и практическая ценность работы. Представленные в работе данные свидетельствуют о том, что увеличение уровня перестроек с участием коротких диспергированных повторов может быть вызвано изменением функционирования некоторых компонентов аппарата репликации и мутациями в ряде генов системы рекомбинационной репарации. Обнаруженные закономерности имеют большое значение для понимания механизмов дестабилизации коротких повторов, в том числе и тандемных в микросателлитной ДНК, а также механизмов взаимодействия таких важнейших процессов метаболизма ДНК, как рекомбинация и репликация. Результаты, представленные в работе, следует учитывать при анализе
структуры и эволюции прокариотических и эукарнотических геномов, реконструкции механизмов возникновения раковых и наследственных заболеваний, конструировании рекомбинантных молекул и манипуляциж с искусственными хромосомами.
Материалы и экспериментальные данные, полученные в диссертационной работе могут быть использованы для чтения лекций по курсам "Мутационный процесс", "Молекулярные механизмы рекомбинации", "Структура и функции ДНК" на кафедре генетики и селекции Санкт-Петербургского государственного университета и в других научных и образовательных институтах, изучающих проблемы стабильности генома, молекулярные механизмы рекомбинации и репликации.
Апробация работы. Результаты работы были представлены на симпозиуме "Структура и функции клеточного ядра" (Санкт-Петербург, 1993), 1 съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (ВОГИС) (Саратов, 1994), конференциях "Yeast Genetics and Molecular Biology Meeting" (Seattle, USA, 1994; Madison, USA, 1996), "Genetic Recombination and Genome Rearrangements" (Snowmass Village, USA, 1995), "Molecular Mechanisms in DNA Replication and Recombination" (Taos, USA, 1996), на семинарах лаборатории физиологической генетики БиНИИ СШГУ.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 120 страницах, содержит 6 рисунков и 12 таблиц. Работа состоит из введения, глав "Обзор литературы", "Материалы и методы", "Результаты", "Обсуждение", выводов и списка литературы, содержащего 127 ссылки на научные публикации.