Введение к работе
Актуальность проблемы. Одной из важнейших проблем молекулярной генетики является, как известно, регуляция активности генов в эукарио-тических клетках. Знание механизмов этой регуляции необходимо для понимания процессов дифференцировки, злокачественного роста и других центральных вопросов генетики и молекулярной биологии.
Значительные успехи были достигнуты в изучении регуляции активности глобиновых генов в эритроидкых клетках. Было детально изучено тонкое строение этих генов, их регуляторные элементы, взаимодействие этих элементов с регуляторнюии факторами и др. Эти исследования имеют не только общее значение для понимания организации генов, они важны и с практической точки зрения. Ряд тяжелых заболеваний, таких, например, как талассемия, эригроидные лейкозы, являются следствием нарушения регуляции экспрессии генов. Однако, ряд важных вопросов изучены недостаточно. Среди них - роль в регуляции экспрессии генов негистоновых белков хроматина.
Важным подходом к исследованию экспрессии генов в зритроидных клетках являются модельные эксперименты на культуре этих клеток. Культуры зритроидных клеток, трансформированные вирусами, как индуцибель-ные, так и неиндуцибельные по синтезу гемоглобина, стали распространенными и удобными объектами для изучения клеточной дифференцировки и экспрессии глобиновых генов.
В нашей лаборатории в течение ряда лет проводятся исследования экспрессии глобиновых генов в культуре эритробластов, трансформирован--мх вирусом Раушера. Было установлено, что в этих клетках не синтезн-эуется гемоглобин, и блок синтеза осуществляется на уровне транскрипции глобиновых генов.
Цели и задачи исследования. В настоящей работе проведено дальней-нее более детальное изучение механизма блокирования экспрессии глоби-
новых генов. Нами было исследовано содержание последовательностей гло-биновой мРНК в транскриптах, синтезированных in vitro на хроматине. выделенном из трансформированных и нормальных эритробластов и ретику-лоцитов. В проявлении активности глобиновых генов важную роль играет структура хроматина. Поэтому мы исследовали роль отдельных компонентов хроматина в экспрессии глобиновых генов и, в особенности, роль негис-тоновых белков хроматина.
Основным подходом к решению этой задачи служило проведение диссоциации хроматина и его самосборки из отдельных компонентов (реконструкция хроматина in vitro) и использование реконструированного хроматина в качестве матрицы для синтеза РНК.
В исследуемой культуре эритробластов, как отмечалось, не синтезируется гемоглобин. При этом блок синтеза не снимается распространенными индукторами дифференцировки.- диметилсульфоксидом, актиномицином Д. протеазами, эритропоэтином. В нашей работе мы предприняли попытку активизировать синтез гемоглобина в этих клетках путем воздействия таки> факторов стресса как антибиотик циклогексимид и тепловой шок, поскольку известно, что они активируют экспрессию ряда генов.
Научная новизна и практическая значимость работы.Исследован механизм ранее обнаруженного нарушения экспрессии глобиновых генов в эрит-роидных клетках мыши, трансформированных вирусом Раушера. Выявлено существенное различие содержания последовательностей глобиновой мРНК і транскриптах, полученных in vitro на хроматине нормальных и трансформированных эритроидных клеток. Исследовано влияние негистоновых белка хроматина (НРБ) на транскрипцию глобиновых генов в нормальных и транс формированных вирусом Раужера эритроидных клетках. Выявлена фракци. НГБ оказывающая максимальный стимулирующий эффект на транскрипцию гло биновых генов. Получены данные, указывающие на то, что в трансформиро ванных вирусом эритроидных клетках нарушается не только транскрипция но и процессинг глобиновой мРНК. Установлено, далее, что при воздейс твии таких факторов клеточного стресса как тепловой шок и циклогекси
мид происходит изменение экспрессии глобиновых генов в сторону ее нормализации. Это выражается в появлении глобиновых последовательностей в мРНК, и в синтезе белков по молекулярной массе, соответствующих глобинам.
Полученные результаты могут быть использованы в изучении роли не-гистоновых белков в регуляции экспрессии генов в клетках животных, а также в выяснении механизма нарушений функций эритроидных клеток при лейкозах.
Апробация работы. Основные материалы диссертационной работы были доложены на межлабораторном научном семинаре Института, который состоялся 15.06.94.
Публикации. Основные результаты исследования, представленные в диссертационной работе, изложены в 7 публикациях.
Структура и объем диссертации. Материал диссертации, состоящий из введения, обзора литературы, изложения материалов и методов, результатов, обсуждения и выводов, представлен на 116 машинописных страницах, включая 2 таблицы и 11 рисунков. Библиографический указатель включает 120 наименований.