Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы
1.1. Основные положения современной концепции этиологии и патоге неза рассеянного склероза. 10
1.2. Генетические факторы риска рассеянного склероза 16
1.3. Полиморфизм генов-кандидатов рассеянного склероза
1.3.1 .Полиморфизм генов главного комплекса гистосовместимости 23
1.3.2. Полиморфизм генов фактора некроза опухолей 34
(Л 1.3.3. Полиморфизм генов цитокинового комплекса IL-1 37
1.3.4. Полиморфизм гена ангиотензин-превращающего фермента 39
1.3.5. Полиморфизм гена аполипопротеина Е 42
Глава 2. Материалы и методы исследования
2.1. Материалы исследования 46
2.2. Методы исследования
2.2.1. Выделение ДНК из венозной крови человека 48
2.2.2. Амплификация полиморфных участков ДНК. 48
2.2.3. Электрофорез амплифицированных фрагментов ДНК . 50
(А 2.3. Статистический анализ результатов исследования 59
Глава 3. Результаты исследования
3.1. Анализ ассоциаций полиморфизма гена DRB1 HLA класса II с t рассеянным склерозом 61
3.2. Анализ ассоциаций микросателлита гена фактора некроза опухо-лей-а с рассеянным склерозом 70
3.3. Анализ ассоциаций полиморфного маркера (— 511 С/Т) гена интер-лейкина—ip с рассеянным склерозом 82
3.4. Анализ ассоциаций полиморфного маркера (+3954 С/Т) гена интер-лейкина — 1 (3 с рассеянным склерозом 88
3.5. Анализ ассоциаций минисателлита гена антагониста рецептора интерлейкина— 1 с рассеянным склерозом 92
3.6. Анализ ассоциаций полиморфного маркера I/D гена ангиотензин-превращающего фермента с рассеянным склерозом 96
3.7. Анализ ассоциаций полиморфных маркеров в кодонах 112 и 158 гена алипопротеина Е с рассеянным склерозом 100
Глава 4. Обсуждение результатов исследования 109
Выводы 134
Список литературы 136
Приложение 165
- Генетические факторы риска рассеянного склероза
- Полиморфизм гена ангиотензин-превращающего фермента
- Электрофорез амплифицированных фрагментов ДНК
- Анализ ассоциаций минисателлита гена антагониста рецептора интерлейкина— 1 с рассеянным склерозом
Введение к работе
Актуальность проблемы. Рассеянный склероз (PG) — представляет собой хроническое заболевание центральной нервной системы (ЦНС), которое характеризуется разрушением миелина и образованием бляшек в белом веществе головного и спинного мозга. Данное заболевание представляет собой серьезную медико-социальную проблему, так как поражает и приводит к ранней инвалидизации молодых трудоспособных людей. Среди населения, проживающего в разных регионах мира, заболеваемость PC неодинакова. Выделяют зоны высокого (более 50 случаев на 100 000 населения), среднего (от 10 до 50 случаев на 100 000 населения) и низкого уровней (менее 10 случаев на 100 000 населения) заболеваемости PC [174]. Среди населения северной и центральной части Европы, северных районов США, юга Канады, юга Австралии и Новой Зеландии данное заболевание широко распространено. В то же время, в популяциях некоторых народов до сих пор не встречались случаи заболевания PC, в частности, в популяциях эскимосов и других представителей малых народов Севера, у таджиков, у аборигенов Австралии [7]. На территории нашего государства выделяют зоны с высоким и средним уровнями распространенности заболевания. В республике Башкортостан (РБ) на 2003 год усредненный показатель распространенности: PC составил 31,14 случаев на 100 000 населения [3].
Клиническую картину и особенности течения PC впервые описал в 1856 г. французский невропатолог J.-M. Charcot; он же выделил это заболевание в отдельную нозологическую форму. Несмотря на длительную историю изучения PC, до сих пор существуют проблемы в понимании этиологии-и патогенеза этого заболевания, что значительно затрудняет разработку системы! профилактических мер, поиск эффективных методов лечения и не позволяет прогнозировать течение и исход заболевания. В > настоящее время признана точка зрения, согласно которой PC является многофакторным заболеванием, т.е. его развитие зависит от генетических факторов и факторов
7 леванием, т.е. его развитие зависит от генетических факторов и факторов внешней среды (инфекционные возбудители, географические, токсические, социальные, травматические и диетические факторы). Значимость наследственной предрасположенности к PC подтверждают результаты семейных исследований. В семьях больных отмечается более высокая встречаемость PC, чем в популяции в. цел ом, и величина относительного риска заболевания, для родственников больных в 20-50 раз выше, чем в популяции в среднем [72, 98, 230]. Также о значимости генетических факторов в развитии PC свидетельствуют результаты исследований с использованием близнецового метода. Показано, что риск конкордантности по PC у монозиготных близнецов выше, чем у дизиготных (25-30% и 3%, соответственно) [85].
В настоящий момент предложено около 100 генов-кандидатов PC [197].. Согласно одной из наиболее обоснованных теорий патогенеза PC, ведущую роль в разрушении миелина играет воспалительный процесс, связанный с аутоиммунными реакциями; В связи с этим, большинство генетических исследований направлены на поиск ассоциаций между PC и полиморфными аллелями кандидатных генов; которые регулируют иммунный ответ либо продукцию миелина. Вместе с.тем, в ряде работ показано, что аутоиммунные реакции — это всего лишь один из путей приводящий к патологическим изменениям, и что разные пути могут преобладать при различных клинических формах PC [27]. Результаты полного геномного сканирования с использованием более 300 маркеров свидетельствуют о существовании, по крайней мере, нескольких генов, расположенных на 14-ти хромосомах (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 11, 14, 17, 18, 19, X) [54, 76, 86, 127, 169, 236]. К ним относятся гены главного комплекса гистовместимоти (ГКГ), или системы HLA, гены цитоки-нов и их рецепторов, гены иммуноглобулинов и белков системы комплемента, гены Т-клеточного рецептора и компонентов миелиновой оболочки аксона [4, 27, 103, 120, 211, 222]. Результаты ассоциативных исследований по изучению PC неоднозначны. Они выполнены на выборках из популяций разных этносов, относящихся к европеоидным, монголоидным и негроидным
8 группам народностей. Один из выводов таких исследований состоит в том, что молекулярно-генетический анализ данного заболевания необходимо проводить в разных регионах мира с учетом этнической принадлежности.
В-этнических группах, проживающих на территории РБ, молекулярно-генетические исследования PC не проводились. Учитывая достаточно высокую частоту PC в данном регионе, проведение таких исследований является особенно актуальным.
В связи со сказанным выше были определены цели и задачи исследования.
Цель работы: изучить молекулярно-генетические основы предрасположенность к рассеянному склерозу по полиморфным маркерам ряда генов-кандидатов в популяции татар. Задачи исследования:
1. В выборке больных рассеянного склероза и в группе сравнения провести
типирование по:
десяти специфичностям гена DRB1 (HLA класса II),
полиморфным маркерам генов
фактора некроза опухолей (TNFA) (HLА класс III),
интерлейкина-1 бета (IL-1B),
антагониста рецептора интерлейкина-1 (IL-1RA),
ангиотензин-превращающего фермента (АСЕ),
аполипопротеина Е(АРОЕ).
2. Провести анализ ассоциаций перечисленных полиморфных маркеров с
риском рассеянного склероза с учетом типа течения, тяжести и симптомов
дебюта заболевания.
Научная новизна исследования: Впервые в республике Башкортостан (РБ) создана коллекция ДІЖ больных PC. Впервые в популяции татар РБ проведено типирование по специфичностям гена DRB1 (HLA класса II), получены статистические оценки частот аллелей и генотипов по полиморфному маркеру (микросателлиту) гена TNFA, локализованного в локусе фактора
9 некроза опухолей в области HLA класса III, а так же маркеров генов кластера IL-1. Впервые в популяции татар изучена наследственная предрасположенность к PC по семи полиморфным маркерам: генов HLA-системы, IL-1-семейства, АСЕ и АРОЕ. Установлено, что с риском PC ассоциированы полиморфные маркеры генов DRBI, TNFA. Специфичности гена DRBI, аллели микросателлита гена TNFA, аллели и генотипы полиморфных маркеров генов АРОЕ (112 и 158) и IL-1 (-511Т/С) определяют предрасположенность к клиническим особенностям заболевания.
Научно-практическая значимость работы. Результаты исследования имеют значение: для развития общетеоретических представлений о природе PC Они могут быть использованы в системе медико-генетического консультирования с целью определения шансов развития PC, прогноза формы и тяжести заболевания. Результаты исследования могут быть использованы в различных областях науки (в биохимии, в генетике,, в медицине) и могут быть рекомендованы для использования в учебно-методическом процессе в ВУЗах.
Положения, выносимые на защиту.
Полиморфные маркеры генов HLA-cuctquu (DRBI и TNFA), АРОЕ ассоциированы с риском PC.
Полиморфный маркер гена TNFA ассоциирован с ремитирующим и; вторично-прогрессирующим, маркер гена DRBI - с вторично-прогрессирующим типом течения PC.
Полиморфный маркер гена АРОЕ ассоциирован с высокой степенью инвалидизации больных PG.
Полиморфные маркеры генов АРОЕ, TNFA и IL-1 ассоциированы с различными вариантами дебюта рассеянного склероза.
Генетические факторы риска рассеянного склероза
Обзор литературных данных показал, что в области изучения генетических факторов PC поиск сфокусирован на исследовании более 100 потенциальных кандидатных генов PC [197]. Сюда относят гены, кодирующие продукты антигенов лейкоцитов человека (Human Leukocyte Antigen — HLA), гены цитокинов и их рецепторов, гены Т-клеточного рецептора и компонентов миелиновой оболочки, аксона, гены иммуноглобулинов и белков системы комплемента и другие, которые могут являться аутоантигенами. Так же рассматриваются гены митохондриальной ДНК.
Некоторые из генов, рассматриваемых в качестве возможных генов-кандидатов PC, представлены в табл. 1. Информативным для идентификации областей генома, вовлеченных в развитие заболевания является проведение полного геномного скрининга. Впервые эти исследования были выполнены в 1996 году на выборках больных из Англии США и Канады [86, 127, 236]. Позднее были доложены итоги трех геномных скринингов, проведенных в популяции финнов и итальянцев [54, 76, 169]. Результаты этих исследований представлены в табл. 2. Почти во всех исследованиях показано сцепление с локусом, картированным на хромосоме 6 (6р21), на котором локализованы гены области HLA. Другие Локусы, сцепление которых с PC подтверждено, как минимум в двух исследованиях, обнаружены на хромосомах 2р, 5р, 5q, 6q, 7q, Ир, и 17q. В общей сложности идентифицировано 27 регионов, сцепленных с PC, локализованных на 14 хромосомах. Следует подчеркнуть, чтоне наблюдается строгого совпадения сцепленных с PC областей генома в разных исследованиях, различаются и значения лод-балов для совпадающих областей [45]. Причины противоречий,, возможно,, заключаются в использовании разных наборов микросателлитных маркеров, и проведения - исследований без учета этнической-принадлежности анализируемых семей..В то же время результаты этих работ могут свидетельствовать о генетической гетерогенности заболевания, а так же о его полигенной природе [24].
Согласно результатам этих работ, исключается вероятность картирования главного гена PC в 95% последовательностей генома, а гена PC, оказывающего эффект средней силы», - в 65% последовательностей, но подтверждается наличие генов «небольшой значимости» во многих участках генома [24]. Фактически нет локуса, который проявлял бы больший эффект, чем HLA, и нет локуса (даже HLA), с которым была бы показана связь во всех скринингах. Результаты этих исследований свидетельствуют о существовании нескольких, расположенных на разных хромосомах, локусов, обеспечивающих предрасположенность к PC.
Ассоциативные исследования; в определении генов, приводящих к заболеванию, за исключением генов HLA, так же имеют довольно скромный успех. Результаты анализа связи полиморфизма генов с PC часто противоречивы. Причины расхождения выводов для разных популяций, возможно, заключаются в выраженных этнических различиях в распределении аллелей. Некоторые положительные ассоциации были выявлены только после разделения пациентов по клиническим проявлениям заболевания. Стратификация больных в гомогенные клинические категории, скорее всего, соответствует более гомогенным в плане «генетической природы» PC группам. Исследователей интересуют разбиение выборок пациентов согласно типам течения PC (ремиттирующий, первично-прогрессирующий и вторично-пргрессирующий), по степени или скорости накопления неврологических нарушений (тяжесть PC), по возрасту начала заболевания, а так же по преобладанию того или иного симптомокомплекса.
В настоящее время можно признать, что расширенные гаплотипы HLA-системы пока являются единственными локусами генома, роль которых в генетической предрасположенности к PC установлена. Однако вклад генов HLAB развитие PC меньше, чем в случае других аутоиммунных заболеваний. Таким образом, несмотря на существенный прогресс в изучении клинической генетики PC как многофакторного заболевания, вопрос о природе генетической предрасположенности к PC далек от решения. Можно с уверенностью сказать, что PC возникает скорее при независимом сочетанием действии множества генов, каждый, из которых вносит небольшой вклад в развитие заболевания, чем при участии небольшого количества, генов, оказывающих сильное патологическое влияние [66].
Единственной полиморфной генетической системой, связь которой с PC была продемонстрирована многочисленными исследованиями,. является система генов главного комплекса гистосовместимости (ГКГ). ГКГ объединяет кластеры генов, расположенных у человека на коротком плече шестой хромосомы (6р2Г.З). Данный участок занимает около 2.5 сМ ДНК, включает около 4 000 000 пар оснований и содержит более 240 генов [250]. Гены представлены как постоянные блоки сцепленных аллелей, называемых «протяженными» гаплотипами [ 120]. Система генов ГКГ кодирует три класса (I-III) полипептидных продуктов, играющих центральную роль.в развитии и регуляции иммунного ответа [55]. Этот участок также называют генами HLA-системы (Human Leukocyte Antigen - антигены лейкоцитов человека), в некоторых случаях термин HLА относят только к молекулам ГКГ классов I и II [27];Три покуса HLA класса І (А, Ви С) и примерно 14 локусов HLA класса II наиболее важны при аутоиммунных заболеваниях. Биологическая функция полипептидных продуктов генов класса Г и II состоит в представлении на поверхности клеток пептидных фрагментов процессированного чужеродного антигена рецепторам CD8+ и CD4+ Т-клеток [24]. Способность ответить на антиген и характер ответа определяется специфичной аминокислотной последовательностью молекул HL А [44].
Первоначально в результате серологического типирования, позволяющего идентифицировать HLA-антигены, были обнаружены слабые связи риска PC с молекулами HLA класса I (повышение частоты экспрессии локусов A3, В7 и В18), а затем и класса II (специфичность DR2) [ 120, 152]. Более информативным оказалось, геномное типирование, основанное на различных вариантах полимеразной цепной реакции (ПЦР) и молекулярной гибридизации: Использование новых технологий позволил обнаружить более отчетливую связь PC с отдельными специфичностями HLA-молекул класса II, соответствующими кодирующим их аллелям генов.
Полиморфизм гена ангиотензин-превращающего фермента
Потенциальными генами-кандидатами при развитии PC могут быть гены, кодирующие компоненты ренин-ангиотензиновой системы (РАС). Основными компонентами РАС являются ренин (REN), ангиотензин I-превращающий фермент (АСЕ), ангиотензиноген (AGT), ангиотензины (I, II и III) и специфические рецепторы для ангиотензинов (AT], АТ , АТ3, АТ4, АТХ). Различают циркулирующую и локальную (или тканевую) РАС, которые имеют функциональные различия. Циркулирующая РАС оказывает длительное регулирующее действие на сердечно-сосудистый и почечный гомеостаз. Локальные или тканевые РАС, функционирующие в клетках-мишенях (в мозге, сердце, почках, сосудах, периферической мускулатуре) стимулируют пролиферацию клеток и процессы ремоделирования органов и тканей [16].
В мозге синтезируются такие компоненты РАС, как AGT, предшественники молекул ангиотензинов I;, II и III, REN, АСЕ. Рецепторы ангиотензинов ATi, АТ2 и АТд также представлены в мозге. РАС мозга вовлечена в регуляцию кардиоваскулярного и жидкостного гомеостаза, цикличность репродуктивных гормонов, высвобождение вазопрессина [270] и функциональной активности: парасимпатической нервной системы [135]. Иммуногистохимиче-ские и нейрофармакологические исследования позволяют предположить, что ангиотензинэргические нервные проводящие пути используют ангиотензины II и/или III как нейротрансмиттеры и нейромодуляторы в различных отделах мозга [192]. АТррецепторы опосредуют активность центрального звена симпатической нервной системы [162]. На возможное вовлечение: элементов РАС мозга в развитие PC так же указывает влияние некоторых из них на состояние ГЭБ. Известно, что при PC лимфоциты по неизвестной причине преодолевают ГЭБ и проникают в мозг больных PC. Таким образом, на течение патологического процесса оказывают влияние любые факторы, повышающие проницаемость гематоэнцефали-ческого барьера. Обнаружено, что удаление гена AGT у мышей;приводит к ослаблению ГЭБ. В то же время подобный эффект не обнаружен при удалении гена ренина. Повреждение ГЭБ у мышей с удаленным геном AGT можно восстановить лечением Ang I или Ang П. Данный эффект не опосредован ATi и АТ2 рецепторами [192]. АСЕ является дипептидиловойкарбоксилазой, которая отщепляет от G-концевого участка молекулы ангиотензинаЛ две аминокислоты, превращая его в активный октапептид ангиотензин П. АСЕ катализует расщепление эн-кефалинов, субстанции Р и брадикинина до неактивных пептидов. Брадики-нин же, в свою очередь, является вазодилятором (vasodilator) и медиатором воспаления. Особый интерес в качестве гена-кандидата PC представляет ген ангиотензин-превращающего фермента (А СЕ). АСЕ известен как фермент, регулирующий кровяное давление.
Растворимая форма фермента присутствует практически во всех биологических жидкостях (плазме, лимфе, слезах, спинномозговая, амниотическая и другие жидкости) [10]. Основная масса фермента находится в мембранно-связанном состоянии. В этом случае фермент является; интегральным белком плазматической мембраны. AGE располагается на внешней поверхности плазматической мембраны эндотелиальных и специализированных эпителиальных клеток, на нервных окончаниях, на клетках мононуклеарного ряда, а так же в репродуктивных органах. Известно, что, располагаясь в дендритах, аксонах, нервных окончаниях, АСЕ вовлечении в обмен нейропептидов [118, 191]. AGE, локализованный в моноцитах, макрофагах, фибробластах, лимфоцитах участвует в регуляции иммунных и воспалительных реакций [77]. Находясь в эпителиальных клетках сосудистых сплетений мозга, АСЕ, возможно, оказывает влияние на ГЭБ, участвуя в регуляции транспорта ионов [10]. Ген АСЕ локализован на хромосоме 17q23, содержит 26 экзонов и 25 нитронов, [186]. Для данного гена известны не менее 12 полиморфных маркеров, три из которых находятся в кодирующей последовательности [70]. Наиболее изучен полиморфизм, обусловленный наличием ("insertion" — I) или отсутствием ("deletion" - D) Л/и-повтора (287 п.н.) в интроне 16 гена АСЕ [224]. Полиморфизм ассоциирован: с концентрацией фермента в крови. Содержание АСЕ в сыворотке крови у здоровых людей, гомозиготных по аллелю ACE D в два раза превышает уровень фермента у гомозиготных лиц по аллелю АСЕ 1и имеет среднее значение у гетерозиготных — ACE I/ D [146]; С полиморфизмом гена также связан уровень АСЕ в сердце человека, [10]. Аллель гена ACE D считают повышенным фактором; риска возникновения инфаркта миокарда, спазма коронарных сосудов; атеросклероза, диабетической нефропатии, онкологических заболеваний [18, 30, 124, 166, 175]. У больных гомозиготных по аллелю ACE D отмечается повышенный тонус мускулатуры сосудов. Аллель АСЕ 1связан с повышенной выносливостью при физических нагрузках у спортсменов [10]. Показано существенное увеличение генотипа ACE D/ Dудолгожителей в сравнении с общей популяционной выборкой [237]. Выдвинуто предположение, что вероятностные сердечнососудистые риски, связанные с аллелем ACE D компенсируются его возможным ; отдалённым протективным действием. «Протективные» эффекты АСЕ, вероятно, связаны с другими биологическими функциями фермента не связанными с РАС и каликреин-кининовой системой. В этом отношении заслуживает внимание участие фермента в метаболизме нейропептидов, его активность в тканях мозга, а также иммуномодулирующие эффекты, связанные с активностью AGE в цитотоксических Т-лимфоцитах [77, 118, 191].
Большой интерес представляют результаты работ по изучению роли AGE в развитии неврологических заболеваний. Отмечено значительное повышение активности АСЕ в тканях отделов мозга, вовлеченных в развитие когнитивных процессов [167]. Выявлено повышение частоты аллеля АСЕ 1 среди пациентов с болезнью Альцгеймера (БА) [159, 200]. До сих пор не проводилось исследований полиморфизма гена АСЕ у больных PC. Аполипопротеин Е (АРОЕ) — гликопротеид с молекулярной массой 34200 Да (299 аминокислотных остатков), является апобелком, входящим в состав различных классов липопротеинов. При участии АРОЕ осуществляются процессы метаболизма; и транспорта липидов в плазме крови и внутри клетки, процессы регуляции клеточного метаболизма и иммунного ответа.. Кроме того, АРОЕ играет важную роль в поддержании гомеостаза холестерина в тканях нервной системы [80]; Белок АРОЕ является важнейшим компонентом, имеющим большое значение для нормального метаболизма ЦНС и при восстановительных процессов в мозге [96, 215]. При PC, особенно в начальной стадии заболевания, после рецидивов протекают процессы восстановления нервной ткани [63]. Ген АРОЕ находится на 19 хромосоме (19ql3.2) и состоит из 4 экзонов и Зинтронов общей протяженностью 36000 п.о.; в экзоне 4 обнаружены тесно сцепленные точковые нуклеотидные. замены, которые приводят к замещениям аминокислот цистеина и аргинина в положениях 112-158 полипептидной цепи белка. В. разных популяциях мира, встречаются три аллеля {АРОЕ 2: Argi58- Cys, АРОЕ 3: Gysn2- Argi58, АРОЕ 4: Gys,i2- Arg) и шесть генотипов ( Е2/ Е2, Е2/ ЕЗ; ЕЗ/ ЕЗ, ЕЗ/ Е4, Е4/ Е4); наиболее распространены генотипы ЕЗ/ ЕЗ, ЕЗ/ Е4 и Е2/ ЕЗ [53]. С генетическим полиморфизмом АРОЕ сопряжена вариабельность концентраций самого белка и липидов. Это объясняется тем, что изоформа белка Е2 проявляет пониженное связывание с рецепторами по сравнению с изоформой ЕЗ, что способствует аккумуляции: остатков частиц в плазме, полученных в результате частичного катаболизма липопротеинов. С другой стороны, для изоформы Е4 характерно повышенное связывание с рецепторами, что приводит к увеличению метаболизма липопротеинов, к снижению уровня триглицеридов и увеличению хо-листерина липопротеинов низкой плотности в плазме [124].
Электрофорез амплифицированных фрагментов ДНК
В группе больных PC, татар по этнической принадлежности, выявлено 13 специфичностей и 37 генотипов (табл.8, табл.9). С наибольшей частотой в данной выборке встречаются генотипыDRBl 07/ 07 (6.74%) HDRB1 01/ 15, DRB1 07/ 11, DRB1 15/ 17 (5.61%). Специфичностями, преобладающими в группе больных, являются DRB1 07 (16.47%) nDRBl 2 (15) (14.77%). Группы лиц, разного пола по спектру частот специфичностей в выборке больных не отличаются друг от друга (%2 =11.34, Р = 0.517) (табл. 8). По частоте встречаемости генотипа DRB1 01/ 07 наблюдаются; достоверные отличия. В группе больных данный генотип не встречается, в то время как среди здоровых лиц частота генотипа DRBl 01/ 07 составляет 8.04% (Р=0.019; OR=0.05, С1=0.003-1.06) (табл. 8). При разбиении контрольной группы и группы больных по полу различий по частотам генотипов не наблюдается (табл.3, 4 приложения). В группе больных отмечена сравнительно более низкая частота специфичности DRB1 13 (1.70% по сравнению с 6.89% в контрольной; группе; Р=0.044). Показатель относительного риска PC по этой специфичности составляет 0.25 (С1=0.05-0.97) (табл. 9). При разделении изученных групп по половой принадлежности оказалось, что ассоциация PC со специфичностью DRB1 13 характерна только для женщин, в то время как для мужчин данная ассоциация! не прослеживается. Так в группе женщин, больных PC специфичность DRB1 13 не выявляется- (0% по сравнению с 4.54% в контрольной группе, Р=0.008; OR=0.04, СІ=0.002-0.86) (табл.Ю). В группе больных PC мужчин отмечена тенденция, к повышению частоты специфичности DRB1 2(15+16) (30.30% по сравнению с 16.21%, Р=0.075), у женщин данных различий не наблюдается (табл. 10). При сравнении распределений частот специфичностей в группах больных с различным типом течения заболевания с таковым в контрольной группе не обнаружено достоверных отличий (при вторично прогрессирующем течении: х2=13.09, Р=0.349; при первично прогрессирующем: %2=11.90, Р=0.445; при ремитирующем: x2=10.59, P=0.551) (табл. 10). Однако отмечена большая частота специфичности DRB1 08 у больных с вторично-прогрессирующим течением (9.21% против 2.29% в контрольной группе, Р=0.034; OR=4.31, №1.08-18.19);
Сравнение по спектрам частот специфичностей групп больных со значением EDSS 6 и больных с EDSS 6 между собой не показало достоверных отличий (х =8.02, Р=0.655) (табл. 5 приложения). При сравнении по распределению частот специфичностей каждой из этих групп с контрольной группой не выявлены различия (EDSS 6: х2=Ю.47, Р=0.587; EDSS 6: Х2=13.66, Р=0.327) (табл. И). При попарном сравнении частот специфичностей в группах больных с контрольной группой выявлена тенденция к снижению частоты специфичности DRB1 6(13) как в группе с EDSS 6 (0% и 6.89%; Р=0.094), так ив группе с EDSS 6 (0% и 6.89%; Р=0.080). При сопоставлении \ групп больных с различными симптомами дебюта PC с контрольной группой не выявлено достоверных различий по спектрам частот специфичностей (табл. 6 приложения). Таким образом, полиморфизм гена DRB1 (HLA класса И) ассоциирован с PC в популяции татар. Согласно полученным данным специфичность DRB1 6 (13) маркирует пониженный риск PC в данной этнической группе у женщин, для мужчин наблюдается тенденция к увеличению частоты специфичности DRB1 2 (15+16). Специфичность DRB1 08 ассоциирована с вторично-прогрессирующим течением заболевания. Генотип DRB1 01/ 07 является маркером пониженного риска PC. Анализ ассоциаций аллелей микросателлита гена фактора некроза опухолей - альфа с рассеянным склерозом
В выборке из жителей Башкортостана, татар по этнической принадлежности проведено типирование по полиморфному локусу гена TNFA. При определении: длины тандемных микросателлитных динуклеотидных повторов (CA/TG)n гена TNFA выявлено 13 аллелей и 64 генотипа. В выборке лиц без признаков,неврологических заболеваний обнаружено 55 генотипов (табл. 7 приложения). С наибольшей частотой встречаются генотипы TNFA 2/ 6 и TNFA 2/ 7 (5.85%), следующим по частоте является генотип TNFA 6/ 7 (5.36%). В контрольной группе выявлено 13 аллелей, из них преобладают аллели TNFA 6 (17.31%) и TNFA 2 (1634%) (табл. 8 приложения). При сравнении групп разного пола по распределению частот аллелей обнаружены достоверные отличия среди лиц, не страдающих PC: %2 = 22.88, Р = 0.022 (табл. 12). У мужчин выявлена значительно большая, чем у женщин частота аллеля-: TNF A4, (5.08% по сравнению с 0.57%; Р=0.022). Известно существование выраженных этнических различий в распреде-ленях частот аллелей TNFA [20]. Популяция татар отличается от популяций русских иг ирландцев согласно данным, представленным в табл. 9 и 10 приложения. , В группе лиц с PG, татар по этнической принадлежности, выявлено 44 генотипа (табл. 7 приложения). Генотипы TNFA 2/ 6 и TNFA 2/ 11 встречаются наиболее часто (7.69% и 6.59%, соответственно). С наибольшей частотой встречаются ajinenmTNFA 2 и TNFA 10 (17.41% и 16.29%, соответственно) (табл. 8 приложения). Группы больных мужчин и женщин по распределению частот аллелей схожи между собой (%2 =9.99, Р = 0.632) (табл. 12).
Сравнение групп больных и здоровых не выявило статистически значимых отличий у мужчин. В группе больных женщин обнаружено понижение. частоты аллеля TNF A7 (7.75% по сравнению с 17.24% в контрольной группе; Р=0.032; OR=0.40;CI=0.18-0.88) и повышение частоты аллеля TNF A4 (9.84% относительно 0.57%; Р=0.001; OR=18.12, С1=2.30-142.92) (табл. 12). При сравнении групп больных PC и здоровых по частотам генотипов не было выявлено достоверных отличий ни у женщин, ни у мужчин (табл. 11,. 12 приложения). При сравнительном анализе распределения частот аллелей в группах больных с различным типом течения заболевания и в контрольной группе необнаружено достоверных отличий в выборке мужчин (табл. 13). Попарное сравнение частот аллелей в данных группах позволило обнаружить тенденцию к увеличению частоты аллеля TNF A3 в группе больных с вторично-прогрессирующим течением PC по сравнению с контрольной (9.37% и,2.11%, Р=0.087). Также выявлена тенденция к повышению частоты аллеля TNF A2 у больных с ремитирующим течением (41.66% по сравнению с 16.10% в контрольной группе, Р=0.058). Повышение частоты аллеля TNF A4 отмечается у женщин, страдающих PC с вторично прогрессирующим (7.57% по сравнению с 0.57%; Р=0.009; OR=14.18, С1=1.58-123.80) и ремитирующим (22.22% и 0;57% в контрольной группе; P=0.0005;OR=49.42,CI=5:16-472.73) типом течения заболевания (табл. 14). Кроме того, у пациенток с ремитирующим типом течения обнаружено повышение частоты аллеля TNF A2 (38.88% относительно 16.66%; P=0.047;OR=3.18, №1.01-9.86). Сравнение по спектрам частот аллелей, а также попарное сравнение по частотам аллелей в группах больных со значением EDSS 6 и больных с EDSS 6 между собой (х =5.92, Р=0.921) с таковыми в контрольной группе не показали достоверных отличий в выборке мужчин (для EDSS 6: %2 =6.02, Р=0.929; EDSS 6: х2=6.63, Р=0.884) (табл. 13 приложения). Согласно результатам, приведенным в табл. 15; среди женщин группы больных с EDSS бис EDSS 6 по распределению частот аллелей не отличаются друг от дру-га (х =8.04, Р=0.852). В то же время каждая из этих групп отличается от контрольной группы за счет увеличения частоты аллеля TNF A4. В группе с EDSS 6 аллель TNF A4 представлен с частотой 7.14% по сравнению с 0.57% в контрольной группе (Р=0.016), а в группе больных женщин с показателем EDSS 6 — 11.66% (Р=0.0009). Соответственно, относительный риск по данному аллелю для группы EDSS 6 составил 13.30 (0=1.35-121.69) и для группы EDSS 6 — 22.84 (С1=2.72-186.94).
Анализ ассоциаций минисателлита гена антагониста рецептора интерлейкина— 1 с рассеянным склерозом
При типирования по минисателлиту гена IL-1RA, локализованного в области интрона 2, из возможных пяти аллелей в нашем исследовании были обнаружены четыре: IL-1RA I,\ IL-1KA4I, IL-1 IL-1RA I/ I RA III, IL-1RA IV; из пятнадцати возможных генотипов найдены только шесть: IL-1RA I/ I, IL-1RA I/ II, IL-1RA W U, IL-IRA ІІ/ Ш; IL-1RA I/ III, IL-1RA II/ IV. В группе здоровых лиц наиболее часто встречается генотип IL-1RA 1/ Г (50.56%) и аллель IL-1RA 1 (70.50%) (табл.. 25). Наблюдаемое распределение частот генотипов не отличается от теоретически ожидаемого равновесного распределения Харди-Вайнберга (Р=0.208). Различий в связи с поло-вой принадлежностью не обнаружено (х =1.73, Р = 0.862) По распределению частот данного полиморфного маркера популяция татар не отличается от популяций русских, башкир, испанцев, канадцев, американцев, немцев, поляков, финнов, турков (табл. 25, 26 приложения). Наблюдаются различия: по частотам генотипов между популяциями татар и итальянцев, тайваньцев, японцев и англичан. В группе больных генотип IL-1RA I/ I и аллель IL-1RA 1 представлены с наибольшими частотами: 50.00%) и 67.21%, соответственно (табл. 25). При сравнение групп разного пола по спектру частот генотипов у больных не выявлено достоверных отличий (х2 =4.96, Р = 0.455) (табл. 26). Как следует из данных, представленных в табл. 25, достоверных различий между группами больных и здоровых лиц по частотам аллелей и генотипов не обнаружено. Проведено сравнение по спектрам частот генотипов групп больных с ризными типами течения PC (ремиттирующим, вторично прогрессирующим и первично прогрессирующим) меду собой и с контрольной группой. Достоверные отличия не выявлены (табл. 27 и табл. 27 приложения). Следовательно, данный маркер не ассоциирован с типом течения PC. Также и с показателями инвалидизации при PC (EDSS) и с вариантами PC с различными симптомами дебюта заболевания минисателлит гена IL-1RA не соотносится (табл. 28, 29 приложения).
При типировании полиморфизма I/D гена АСЕ в популяции татар выявлено три генотипа и два аллеля. В контрольной группе генотип // / представлен с частотой 14.78%, генотип I/ D с частотой 59.11% и генотип D/ D с частотой 26.11%. Частота аллеля / в данной выборке составила 44.33%, аллель D встречается с частотой 55.67% (табл.28). Наблюдаемое распределение частот генотипов соответствует теоретически: ожидаемому равновесному распределению Харди-Вайнберга (Р=0.998). В контрольной группе по спектру частот генотипов не обнаружено достоверных отличий в связи с по-ловой принадлежностью (%. =0.63, Р = 0.757) (табл. 29). Частоты генотипов и аллелей гена АСЕ в популяциях татар, русских, башкир, а также в некоторых популяций» других народов мира приведены в табл. 30 приложения. Согласно результатам сравнительного анализа, популяция татар схожа с популяциями русских, башкир, англичан, французов, немцев, японцев, но сильно отличается от популяций китайцев, корейцев и индусов (табл. 31 приложения).
В группе пациентов с PC, татар по этнической принадлежности, генотип // /встречается с частотой 17.97%, генотип I/ D с частотой 61.72%» и генотип D/ D с частотой 20.31 %..Частота аллеля / в данной выборке составила 48.83%, аллель !) встречается.с частотой: 51.17% (табл.28). В выборке больных группы пациентов разного пола по спектру частот генотипов не отлича-ются друг от друга (% =0.10, Р = 0.971) (табл. 29). При попарном сравнении частот генотипов и аллелей между группами больных PC и здоровых лиц не обнаружено достоверных различий (табл. 28). С типом течения . заболевания полиморфизм I/D гена А СЕ не ассоциирован (табл., 32 приложения). Также и с вариантами PC, различающимися, по показателям EDSS не прослеживается значимых связей (табл.33 приложения). При сопоставлении по спектру частот генотипов групп больных с различными симптомами дебюта и контрольной группы достоверные различия между ними не обнаружены (табл. 34).
Таким образом, в популяции татар полиморфизм I/D гена АСЕ не ассоциирован с PC или его клиническими вариантами. В популяции татар?нами выявлены генотипы - АРОЕ 2/ 2, АРОЕ 2/ 3; АРОЕ 2/ 4, АРОЕ 3/ 3, АРОЕ 3/ 4, АРОЕ 4/ 4 и аллели - АРОЕ 2, АРОЕ 3, АРОЕ 4 (табл.30). С наибольшей частотой в группе здоровых лиц в: данной популяции встречается генотип АРОЕ 3/ 3 (64.28%) и аллель АРОЕ 3 (80.88%). Распределение частот генотипов соответствует равновесному распределению Харди-Вайнберга (Р=0.58). Как видно из табл. 31, при, сравнении между собой групп здоровых лиц разного пола по спектрам частот генотипов достоверных отличий между ними, не обнаружено (х =5.75, Р=0.217). В табл. 35 приложения представлены частоты генотипов данных локусовг в популяциях татар, русских и башкир; а также в некоторых популяциях других народов мира. Популяция татар по распределению частот генотипов схожа с популяциями коми, мордвы, удмуртов, немцев, китайцев, англичан и американцев (табл. 36 приложения). Также, как в контрольной группе, в выборке больных PC с наибольшей частотой встречается генотип АРОЕ 3/ 3 (65.83%) и аллель АРОЕ 3 (77.91%) (табл.30). Пациенты разного пола по спектру частот генотипов не отличаются друг от друга (х =4.61, Р = 0.347) (табл.31). Как: следует из материалов таблицы 3 0, в группе больных по сравнению с контрольной? группой; обнаружена; тенденция к повышению; генотипов» АРОЕ 4/ 4 (5.83 % и 1.68 %; Р=0.068).
Между группами больных с различными: типами? течения; и- группами: здоровых лиц статистически значимых различий не выявлено (таблица 32). Однако, в группе больных с вторично прогрессирующим течением« заболевания наблюдается выраженная тенденция к увеличению частоты встречаемости генотипов АРОЕ 2/ 4 (5.17% по сравнению с 0.84% в контрольной группе; Р=0.084) и АРОЕ 4/ 4 (6.89% по сравнению с 1.86%; Р=0.081). У больных с ремитирующим типом течения PC отмечается тенденциям понижению частоты генотипа АРОЕ 3/ 4 (4.16% относительно 24.42%; Р=0.079) (табл.32). В выборке больных с EDSS 6 наблюдается повышение частоты генотипа АРОЕ 4/ 4 по сравнению с контрольной группой (7.84% и 1.86% в группе здоровых; Р=0.049, OR=4.97, GI= 1.00-24.44) и генотипа АРОЕ 2/ 4 (5.88% по сравнению с 0.84%; Р=0.055) (табл. 33). В выборке больных с нарушениями координации в начале. заболевания относительно контрольной группы обнаружено повышение частоты генотипов АРОЕ 2/ 4 (7.69% по сравнению с 0.84%; Р=0.009; OR=9.83, С1=1.49-79.75), аллеля АРОЕЧ (23.07% относительно 12.81%; Р=0.012; OR=2:04, GI=0.16-3.57) и выявлена тенденция к повышению генотипа АРОЕ 4/ 4 (7.69% и 1.86%; Р=0.053). В данной группе обнаружено понижение частоты аллеля АРОЕ 3 (69.23% по сравнению с 80.88%; Р=0.013; OR=0.53і GI=0.32-0.87) (табл. 34). У больных с дебютом заболевания, выраженным в нарушениях пирамидного пути, и у больных с полисистемным началом PC отмечается повышеная частота генотипа АРОЕ 2/ 4 (нарушение пирамидного пути: 7.01%) по сравнению с контрольной группой 0.84%; Р=0.015; OR=8.90, С1=1.35-71.99; полисистемное начало: 9.25% относительно 0.84%; Р=0.003; GR=12.42, GI=1.86-101.69) (табл. 35).
